RU2645255C1

RU2645255C1 - Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека

Info

Publication number: RU2645255C1
Application number: RU2016149580A
Authority: RU
Inventors: Геннадий Тихонович Сухих; Римма Алексеевна Полтавцева; Андрей Михайлович Полтавцев; Евгений Ильич Зарайский
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-02-19

Abstract

Изобретение относится к области клеточной биологии, конкретно к получению биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека. Способ включает выделение из плаценты человека после операции «кесарево сечение» культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона, дезагрегацию ткани раствором, содержащим 0,2% коллагеназы 2 типа и 0,18% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM\F12 в соотношении 1:1 и инкубирование при 37°С в течение 30 мин. Далее собирают отделившиеся клетки, центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM\F12, содержащей 5% фетальной сыворотки теленка, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM\F12 (в соотношении 1:1), переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% СО₂ до формирования 3\4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю, и при достижении 3\4 монослоя клетки пересевают в соотношении 1:2, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется. Изобретение позволяет получать биобезопасную культуру, не зараженную вирусами СПИДа, гепатита В и С и микоплазмы. 1 табл.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и клеточной терапии и касается получения из ворсин хориона человека биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток однородной клеточной популяции. Изобретение может найти применение в медицине для лечения различных заболеваний.

В настоящее время клеточная терапия находит все более широкое применение в медицине. Путем трансплантации стволовых клеток успешно лечат различные заболевания, такие как остеопороз (Патент РФ №2265442 от 10.12.2005), аллергические заболевания (Патент РФ №2250773 от 27.04.2005), паркинсонизм (Патент РФ №2259836 от 10.09.2005), травму головного мозга (Патент РФ №2216336 от 20.11.2003), онкологические заболевания (Патент РФ №2257219 от 27.07.2005), выращивают органы для трансплантации, изготавливают фармакологические препараты из их дериватов.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) часто используют в роли трансплантата, т.к. они активизируют собственные резервы организма, способствуют образованию цитокинов и факторов роста.

МСК получают обычно из костного мозга (патент 2303632), хотя их можно выделять из фетальных органов гемопоэза, из скелетных мышц, из подкожной жировой ткани.

Выделение и культивирование МСК относительно несложно, но существует проблема получения однородной клеточной популяции мезенхимальных стволовых клеток в достаточном количестве для трансплантации и консервации впрок. По известным методикам при культивирование МСК из костного мозга обычно получают гетерогенные популяции клеток стромы с незначительным содержанием в них стволовых клеток. При работе с МСК используют традиционные методы работы с клетками (Культура животных клеток. Методы. Под ред. Р. Фрешни. М.: Мир. 1989 г.), в каждом конкретном случае подбирая индивидуальную последовательность действий, условия выделения и наработки клеточной массы.

Однако одним из наиболее перспективных источников получения мезенхимальных стромальных клеток являются ворсины хориона плаценты человека. Ворсины хориона - плодовая часть плаценты и, в силу своего происхождения, содержат значительно больше стволовых клеток, чем материнская часть плаценты. Плацента является одним из наиболее привлекательных источников сингенных и аллогенных стромальных клеток, так как получение клеток из нее является легитимным (Федеральный закон «О биомедицинских клеточных продуктах», 23 июня 2016 года), не связано с серьезными этическими проблемами и позволяет получать значительное количество биологического материала неинвазивным способом.

Известен способ лечения заболеваний роговицы у собак, заключающийся в ретробульбарном введении лекарственного вещества в непосредственной близости от патологического очага, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства используют мезенхимальные стволовые клетки пуповины или плаценты, взятые после нормальных родов, при этом осуществляют ретробульбарное введение клеток путем инъекции 1-2 мл физиологического раствора, содержащего 0,075-0,20×10 6 клеток/кг веса одномоментно 1-2 раза в год. Мезенхимальные стромальные клетки пуповины или плаценты были получены в соответствии со стандартной методикой следующим образом. Образцы пуповины или плаценты человека собирали после нормальных родов на 39-40 неделе гестации. Вены пуповины и плаценты канюлировали и промывали сначала раствором Хенкса, а затем 0,1% раствором коллагеназы I типа, приготовленным на среде DMEM без сыворотки, и инкубировали при 37°С 30 мин. Затем сосуды вновь промывали раствором Хенкса, ткань подвергали непродолжительному мягкому механическому воздействию и собирали отделившиеся клетки. Полученные клетки осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина, 100 ед/мкг стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 нг/мл базального фактора роста фибробластов (b-FGF), переносили в культуральные чашки и культивировали до формирования монослоя, меняя среду 2 раза в неделю. При достижении монослоя клетки пересевали в соотношении 1:2 (патент 2481112 RU).

Известен СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ZNF281 (патент 2511417 RU).

Недостатком способа является то, что в крови подавляющая часть стволовых клеток преиндуцирована в кроветворном направлении и не может быть использована для лечения заболеваний, не связанных с патологией крови.

Известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОСУДИСТЫХ И ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ И КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА, ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ (патент RU 2347579), включающий в себя выделение из пуповины новорожденного после нормальных родов культуры стволовых клеток, отличающийся тем, что осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков: 100 Ед./мл пенициллина, 100 ед/мкг стрептомицина, 100 ед./мл амфотерицина, в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1%-ным раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткань пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота Ед./мл пенициллина, 100 ед./мкг стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, меняя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:2, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с pH 7,2, затем суспензию осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение аллогенных мезенхимальных клеток производят из пуповины новорожденного после нормальных родов на 38-40 недели гестации. Клеточная культура для лечения заболеваний нервной системы, включающая полученную из пуповины новорожденного культуру стволовых клеток для парентерального введения их пациенту, отличающаяся тем, что она получена с возможностью выделения культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток по п. 1, причем количество аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в клеточной культуре - в диапазоне от 1 до 5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Способ выбран нами в качестве прототипа. Недостатком прототипа является низкий выход МСК и низкая жизнеспособность клеток, вызванная применением в качестве дезаггреганта смеси смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С. Кроме того, такая культура может нести опасность для реципиента и медицинского персонала, проводящего манипуляции с такими препаратами из-за их изначальной возможной зараженности вирусами СПИДА, гепатитов В и С и микоплазмой.

Известен способ получения мезенхимальных стволовые клеток человека из хориальной стромы плаценты (Патент RU 225225), избранный нами в качестве прототипа. Ткани человека измельчают и обрабатывают раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, при этом децидуальную или амниотическую оболочку плаценты обрабатывают коллагеназой типа I, а хориальную строму плаценты - коллагеназой типа IV. Затем полученную суспензию очищают от эритроцитов с помощью лизирующего раствора с последующей последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 100 и 10 мкм. Изобретение позволяет повысить однородность клеточной суспензии, выход целевого продукта и жизнеспособность клеток. Недостатком метода является недостаточный пролиферативный потенциал и малое количество стволовых клеток. Кроме того, такая культура может нести опасность для реципиента и медицинского персонала, проводящего манипуляции с такими препаратами из-за их возможной зараженности вирусами СПИДА, гепатитов В и С и микоплазмой.

Нами предложен способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека, включающий в себя выделение из плаценты человека после операции «Кесарево сечения» культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона, причем при выделении мезенхимальных стволовых клеток отделяют ворсины хориона от плаценты, освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 200 Ед/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают раствором Хенкса, затем осуществляют механическое и ферментативное воздействие на ткани пуповины и собирают отделившиеся клетки, отличающийся тем, что дезаггрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,2% коллагеназы 2 типа и 0,18% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM\F12 в соотношении 1:1 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают отделившиеся клетки, центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM\F12, содержащей 5% фетальной сыворотки теленка 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде DMEM\F12 в соотношении 1:1, переносят в культуральные флаконы и культивируют в атмосфере, содержащей 5% CO2 до формирования 3\4 монослоя, проводя замену ростовой среды 3 раза в неделю на 50%, и при достижении 3\4 монослоя клетки пересевают в соотношении 1:2, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется.

Предложенный способ позволяет получать биобезопасную культуру, не зараженную опасными вирусами. Пересев клеток при достижении ими 3\4 монослоя позволяет поддерживать их в стадии логарифмического роста, что препятствует дифференцировке и повышает пролиферативный потенциал. Применение в качестве дезагрегирующего агента смеси содержащей 0,2% коллагеназы 2 типа и 0,18% коллагеназы 4 типа приготовленным на среде DMEM\F12 в соотношении 1:1 повышает выход и жизнеспособность клеток (табл. 1), они соответствуют фенотипу МСК. Экспрессия поверхностных маркеров полученных клеток соответствует иммунофенотипу МСК: клетки положительны по CD13, CD73, CD44, CD90, CD105, CD29, CD54 и отрицательны по CD34, CD80, CD83, CD86, CD HLA-DR.

Claims

Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека, включающий в себя выделение из плаценты человека после операции «кесарево сечение» культуры мезенхимальных стромальных клеток из ворсин хориона, причем при выделении мезенхимальных стромальных клеток отделяют ворсины хориона от плаценты, освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков: 200 Ед/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина, в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, затем осуществляют механическое и ферментативное воздействие на ткань, центрифугируют, метод отличается тем, что дезагрегацию ткани проводят раствором, содержащим 0,2% коллагеназы 2 типа и 0,18% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM\F12 в соотношении 1:1 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, собирают клетки, центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, получая осадок клеток, который ресуспендируют в ростовой среде DMEM\F12, содержащей 5% фетальной сыворотки теленка, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, пассируют, в соотношении 1:1, культивируют в атмосфере, содержащей 5% СО₂ до формирования 3\4 монослоя, меняя ростовую среду 3 раза в неделю, и при достижении 3\4 монослоя, клетки пересевают в соотношении 1:2, причем после 1 пассажа часть клеток используют для выявления наличия в культуре вирусов СПИД, гепатита В и С и микоплазмы методом ПЦР и в случае позитивного анализа на эти инфекции культура бракуется.