RU2639569C1 - Probiotic bacillus megaterium strain - producer of antibacterial substances, immunomodulators and proteolytic enzymes - Google Patents
Probiotic bacillus megaterium strain - producer of antibacterial substances, immunomodulators and proteolytic enzymes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639569C1 RU2639569C1 RU2016140188A RU2016140188A RU2639569C1 RU 2639569 C1 RU2639569 C1 RU 2639569C1 RU 2016140188 A RU2016140188 A RU 2016140188A RU 2016140188 A RU2016140188 A RU 2016140188A RU 2639569 C1 RU2639569 C1 RU 2639569C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- megaterium
- producer
- immunomodulators
- proteolytic enzymes
- Prior art date
Links
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims description 12
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims description 8
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 title claims description 8
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 title claims description 8
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 title claims description 8
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims description 6
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title abstract description 7
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 abstract description 3
- 208000036649 Dysbacteriosis Diseases 0.000 abstract 1
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 6
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 5
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 5
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 5
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 4
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 4
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000219470 Mirabilis Species 0.000 description 4
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 4
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 3
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 3
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005232 Glossitis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000208474 Protea Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000012532 cell-free culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000013872 defecation Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 208000007565 gingivitis Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Пробиотический штамм Bacillus megaterium - продуцент антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов.The probiotic strain of Bacillus megaterium is a producer of antibacterial substances, immunomodulators and proteolytic enzymes.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к средствам профилактики и лечения инфекционных болезней, вызываемых патогенными микроорганизмами, аллергических заболеваний, повышения иммунной резистентности организма, коррекции дисбиозов различной этиологии.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to means of preventing and treating infectious diseases caused by pathogenic microorganisms, allergic diseases, increasing the body's immune resistance, and correcting dysbioses of various etiologies.
Известно, что пробиотики - класс микроорганизмов и веществ микробного и иного происхождения, использующихся в терапевтических целях, а также пищевые продукты и биологически активные добавки, содержащие живые микрокультуры. Хотя большинство бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, являются представителями семейств Lactobacillus и Bifidobacterium, стали использоваться и спорообразующие бактерии, в особенности из рода Bacillus (см. Химическая и биологическая безопасность. 2007. №2-3 (32-33)).It is known that probiotics are a class of microorganisms and substances of microbial and other origin used for therapeutic purposes, as well as food products and biologically active additives containing live microcultures. Although most bacteria with probiotic properties are members of the Lactobacillus and Bifidobacterium families, spore-forming bacteria, especially from the genus Bacillus, have also been used (see Chemical and Biological Safety. 2007. No. 2-3 (32-33)).
В патенте ЕР 0363491 (B1), NIKITENKO, 02.02.1994 описан препарат для профилактики и лечения гнойно-воспалительных процессов различной локализации и пищевой аллергии, использующий штамм Bacillus subtilis 534, депонированный за №1666 D. Препарат обеспечивает усиление лечебного эффекта за счет проникновения бактерий в очаг повреждения, где они вырабатывают биологически активные вещества, тем самым подавляя развитие инфекции и способствуя очищению от некротизированных тканей. Препарат «Споробактерин» (RU 2217154 С2, Никитенко М.В., 20.06.2003), который содержит жизнеспособные клетки штамма Bacillus subtilis ВКМ 1666D в концентрации 107-1015 КОЕ/мл в растворе хлорида натрия, проявляет антагонистическую активность к бактериям золотистого стафилококка, протея мирабильного, грибкам рода Candida. В патенте (RU 2035185 С1, ИМиВ АН Украины и др., 20.05.1995) описан биопрепарат для профилактики желудочно-кишечных заболеваний на основе рекомбинантного штамма В. Subtilis ВКПМ В-4759, который характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, антивирусной активностью за счет синтеза интерферона.In the patent EP 0363491 (B1), NIKITENKO, 02.02.1994, a preparation for the prevention and treatment of purulent-inflammatory processes of various localization and food allergies is described using the Bacillus subtilis 534 strain deposited under No. 1666 D. The drug provides an enhancement of the therapeutic effect due to the penetration of bacteria to the lesion, where they produce biologically active substances, thereby inhibiting the development of infection and helping to cleanse necrotic tissue. The drug "Sporobacterin" (RU 2217154 C2, MV Nikitenko, 06/20/2003), which contains viable cells of the Bacillus subtilis strain VKM 1666D at a concentration of 10 7 -10 15 CFU / ml in sodium chloride solution, exhibits antagonistic activity against golden bacteria staphylococcus, protea mirabilny, fungi of the genus Candida. The patent (RU 2035185 C1, IMiV AN of Ukraine and others, 05.20.1995) describes a biological product for the prevention of gastrointestinal diseases based on the recombinant strain B. Subtilis VKPM B-4759, which is characterized by high antagonistic activity against a wide range of pathogenic and conditionally pathogens, antiviral activity due to the synthesis of interferon.
Известно, что штаммы Bacillus megaterium (В-4440 и В-200) использовались ранее в сельском хозяйстве для восстановления плодородия почвы, увеличения всхожести семян, укрепления иммунной системы растений, сопротивляемости болезням и вредителям (RU 2322061 С2, НПО "Экобиотех+", 20.04.2008).It is known that strains of Bacillus megaterium (B-4440 and B-200) were previously used in agriculture to restore soil fertility, increase seed germination, strengthen the immune system of plants, and resistance to diseases and pests (RU 2322061 C2, NPO Ecobiotech +, 20.04 .2008).
Ближайшим аналогом патентуемого штамма является пробиотический штамм Bacillus megaterium LJ2014 (регистрационный № KCCM11676P), используемый в составе фармацевтической композиции для лечения или профилактики воспалительных заболеваний или аллергических заболеваний, которая проявляет иммунологическую активность и отбеливающий эффект (KR 101583600 (В1), 21.01. 2016 - прототип). Композиция (пищевая или косметическая) содержит штамм, лизат штамма, культуры штамма, концентрат культуры и высушенного материала из культуры Bacillus megaterium.The closest analogue of the patented strain is the probiotic strain Bacillus megaterium LJ2014 (registration number KCCM11676P), used in the pharmaceutical composition for the treatment or prevention of inflammatory diseases or allergic diseases, which exhibits immunological activity and a whitening effect (KR 101583600 (B1), January 21, 2016 - prototype ) The composition (food or cosmetic) contains strain, strain lysate, strain culture, culture concentrate and dried material from a Bacillus megaterium culture.
Настоящее изобретение направлено на решение технической проблемы - расширение арсенала пробиотических штаммов, направленных на профилактику и лечение дисбактериозов различной этиологии, инфекционных заболеваний человека и животных, вызываемых широким спектром патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также аллергических заболеваний, повышения иммунной резистентности организма, что и является техническим результатом изобретения.The present invention is aimed at solving a technical problem - expanding the arsenal of probiotic strains aimed at the prevention and treatment of dysbacterioses of various etiologies, infectious diseases of humans and animals caused by a wide range of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms, as well as allergic diseases, increasing the body's immune resistance, which is technical result of the invention.
Патентуемый штамм Bacillus megaterium 874 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером В-12251, является продуцентом антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов. Штамм В. megaterium 874 обладает иммуномодулирующей способностью и может быть использован для снижения аллергии и, например, может быть добавлен в пищевые продукты. Штамм обладает, подобно антибиотику широкого спектра действия, выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др. Штамм продуцирует следующие ферменты: протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Обладает лизоцимной активностью.Patented strain of Bacillus megaterium 874 deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM) FSUE GosNIIgenetics under registration number B-12251, is a producer of antibacterial substances, immunomodulators and proteolytic enzymes. Strain B. megaterium 874 has immunomodulating ability and can be used to reduce allergies and, for example, can be added to food products. The strain has, like a broad-spectrum antibiotic, pronounced antagonistic activity against a wide range of microbial pathogens - Staphylococcus aureus, E. coli, Pr.mirabilis and others. The strain produces the following enzymes: protease, gelatinase, amylase, lipase, catalase, lecithinase. It has lysozyme activity.
Характеристика штамма Bacillus megaterium 874Characterization of the strain of Bacillus megaterium 874
Штамм Bacillus megaterium 874 выделен из почвы. Это грубая палочка размером (4-7)×(1,5-2) мкм. Располагается одиночно, попарно или цепочками, подвижна. Образует споры, капсул не образует, грамположительна. Аэроб, на плотной среде колонии круглые, белые, с ровным или слегка волнистым краем. В бульоне - белесоватая пленка на поверхности и небольшой придонный осадок.Strain Bacillus megaterium 874 isolated from the soil. This is a coarse stick with a size of (4-7) × (1.5-2) microns. It is located singly, in pairs or in chains, is mobile. Forms spores, does not form capsules, is gram-positive. Aerob, on a dense medium, the colonies are round, white, with a smooth or slightly wavy edge. In the broth there is a whitish film on the surface and a small bottom sediment.
Штамм В. megaterium 874 хорошо растет на простых питательных средах в течение 18-24 часов. Оптимальная температура культивирования - 37°C.Strain B. megaterium 874 grows well on simple nutrient media for 18-24 hours. The optimum cultivation temperature is 37 ° C.
Штамм ферментирует без выделения газа глюкозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу, манит. Не разлагает лактозу. Не образует индол, сероводород. Штамм продуцирует протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Не образует уреазу. Основные физиолого-биохимические свойства представлены в таблице 1.The strain ferments without gas evolution glucose, sucrose, arabinose, xylose, beckons. Does not decompose lactose. Does not form indole, hydrogen sulfide. The strain produces protease, gelatinase, amylase, lipase, catalase, lecithinase. Does not form urease. The main physiological and biochemical properties are presented in table 1.
Специфическая активность В. megaterium 874The specific activity of B. megaterium 874
Специфическая активность штамма В. megaterium 874 изучена методом отсроченного антагонизма в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов (Таблица 2). В качестве контроля использованы тест-штаммы: Staphylococcus aureus "Никифоров", Staphylococcus aureus "Филиппов", E.coli 157, Pr.mirabilis. Определяли антагонистическую активность по зоне задержки роста тест-штаммов (в мм), при этом антагонистическую активность считали положительной при задержке роста тест-культур не менее 10 мм.The specific activity of strain B. megaterium 874 was studied by the method of delayed antagonism against a wide range of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms (Table 2). As control, the test strains were used: Staphylococcus aureus "Nikiforov", Staphylococcus aureus "Philippov", E. coli 157, Pr.mirabilis. Antagonistic activity was determined by the zone of growth inhibition of test strains (in mm), while antagonistic activity was considered positive when growth retardation of test cultures was not less than 10 mm.
Безопасность В. megaterium 874Security B. megaterium 874
Изучали острую и хроническую токсичность штамма В. megaterium 874. Опыты проводили на крысах и мышах (Таблицы 3, 4). При изучении острой токсичности животным вводили культуру В. megaterium 874 внутримышечно и внутрибрюшинно в различных концентрациях.The acute and chronic toxicity of strain B. megaterium 874 was studied. The experiments were performed on rats and mice (Tables 3, 4). In the study of acute toxicity, animals were injected with a B. megaterium 874 culture intramuscularly and intraperitoneally at various concentrations.
При исследовании острой токсичности гибели животных за весь период наблюдения на протяжении 15 дней не наблюдалось.In the study of acute toxicity of animal death over the entire observation period for 15 days was not observed.
При наблюдении за животными.When observing animals.
Первые сутки после введения препаратаThe first day after drug administration
Общее состояние удовлетворительное, поведение обычное, движения координированы, судорог не отмечалось. Реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители идентична наблюдавшейся до эксперимента в обеих группах. Волосяной и кожный покров не изменялся. Потребление корма и воды обычное.The general condition is satisfactory, normal behavior, movements are coordinated, convulsions were not noted. The response to tactile, pain, sound and light stimuli is identical to that observed before the experiment in both groups. Hair and skin were not changed. Feed and water are common.
В последующие 14 дней наблюдения изменений в поведении, реакции на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, в потреблении корма и воды, в характере, режиме дефекации и мочеиспускания не было.In the next 14 days, there were no changes in behavior, reactions to tactile, pain, sound and light stimuli, in the consumption of food and water, in the nature, defecation and urination regimen.
Результаты измерения массы тела крыс отражены в таблице 5. Статистически достоверных различий в прибавке массы за 14 суток не выявлено. Средняя прибавка массы крыс за время наблюдения в опытных группах составила: группа, получавшая 0,5 мл препарата - 21±1,8 г; группа, получавшая 1,5 мл препарата - 20±2,6 г; группа, получавшая 5,0 мл препарата - 20±1,9 г. Средняя прибавка массы за время наблюдения в контрольных группах составила: группа, получавшая 0,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 18±1,5 г; группа, получавшая 1,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 19±2,7 г; группа, получавшая 5,0 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 20±2,5 г. Статистически достоверных различий в прибавке массы тела крыс в опытных и контрольных группах не выявлено (p>0,1).The results of measuring body weight of rats are shown in table 5. There were no statistically significant differences in weight gain over 14 days. The average weight gain of rats during the observation in the experimental groups was: the group receiving 0.5 ml of the drug - 21 ± 1.8 g; the group receiving 1.5 ml of the drug - 20 ± 2.6 g; the group receiving 5.0 ml of the drug — 20 ± 1.9 g. The average weight gain during the observation period in the control groups was: the group receiving 0.5 ml of a 0.9% sodium chloride solution — 18 ± 1.5 g; the group receiving 1.5 ml of 0.9% sodium chloride solution - 19 ± 2.7 g; the group receiving 5.0 ml of a 0.9% sodium chloride solution was 20 ± 2.5 g. No statistically significant differences in the increase in body weight of rats were detected in the experimental and control groups (p> 0.1).
Результаты измерения массы тела мышей отражены в таблице 6. Статистически достоверных различий в прибавке массы за 14 суток не выявлено. Средняя прибавка массы мышей за время наблюдения в опытных группах составила: группа, получавшая 0,1 мл препарата - 2,3±0,9 г; группа, получавшая 0,5 мл препарата - 1,9±1,2 г; группа, получавшая 1,0 мл препарата - 2,2±0,9 г. Средняя прибавка массы за время наблюдения в контрольных группах составила: группа, получавшая 0,1 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,2±0,7 г; группа, получавшая 0,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,8±0,7 г; группа, получавшая 1,0 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,0±1,0 г. Статистически достоверных различий в прибавке массы тела мышей в опытных и контрольных группах не выявлено (p>0,1).The results of measuring body weight of mice are shown in table 6. No statistically significant differences in weight gain over 14 days were revealed. The average weight gain of mice during the observation in the experimental groups was: the group receiving 0.1 ml of the drug - 2.3 ± 0.9 g; the group receiving 0.5 ml of the drug - 1.9 ± 1.2 g; the group receiving 1.0 ml of the drug - 2.2 ± 0.9 g. The average weight gain during the observation in the control groups was: the group receiving 0.1 ml of a 0.9% sodium chloride solution - 2.2 ± 0, 7 g; the group receiving 0.5 ml of 0.9% sodium chloride solution - 2.8 ± 0.7 g; the group receiving 1.0 ml of 0.9% sodium chloride solution - 2.0 ± 1.0 g. No statistically significant differences in the increase in body weight of mice were detected in the experimental and control groups (p> 0.1).
В связи с тем, что летальности во всех группах не наблюдалось, клинические анализы крови, патоморфологические и гистологические исследования выполнялись в группах животных, получавших максимальное количество препарата или физиологического раствора. Для крыс это количество составило 5,0 мл внутримышечно, для мышей - 1,0 мл внутрибрюшинно.Due to the fact that no mortality was observed in all groups, clinical blood tests, pathomorphological and histological studies were performed in groups of animals that received the maximum amount of the drug or physiological saline. For rats, this amount was 5.0 ml intramuscularly, for mice - 1.0 ml intraperitoneally.
Клинический анализ крови выполнялся на вторые, седьмые и четырнадцатые сутки опыта. Результаты анализов крови лабораторных крыс показаны в таблице 7. Нормальные показатели отражены в таблице 8.A clinical blood test was performed on the second, seventh and fourteenth days of the experiment. The results of blood tests of laboratory rats are shown in table 7. Normal values are shown in table 8.
При внешнем визуальном осмотре тел животных различий между опытной и контрольной группами также не выявлено. Кожа эластичная, подвижная; шерсть гладкая, блестящая; видимые слизистые оболочки бледные, чистые, без изъязвлений и посторонних наложений; подкожная клетчатка умеренно выражена; патологические выделения из естественных отверстий тела отсутствовали.During an external visual examination of animal bodies, differences between the experimental and control groups were also not revealed. The skin is elastic, mobile; the coat is smooth, shiny; visible mucous membranes are pale, clean, without ulceration and extraneous overlays; subcutaneous tissue is moderately expressed; pathological discharge from the natural openings of the body was absent.
При макроскопическом исследовании внутренних органов различий между опытной и контрольной группами не обнаружено. Раздражающего воздействия тестируемого вещества в месте введения (брюшинная полость) не выявлено.Macroscopic examination of the internal organs did not reveal any differences between the experimental and control groups. No irritating effect of the test substance at the injection site (peritoneal cavity) was detected.
При изучении острой токсичности штамма В. megaterium 874 установлено, что при парентеральном введении препарата в максимальной дозе он не вызывает летального и токсического эффекта.When studying the acute toxicity of strain B. megaterium 874, it was found that with parenteral administration of the drug at the maximum dose, it does not cause a lethal and toxic effect.
При изучении хронической токсичности животным вводили культуру перорально по 109 микробных клеток ежедневно в течение 10 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Результаты изучения хронической токсичности культуры представлены в таблице 9.In the study of chronic toxicity, animals were orally administered with 10 9 microbial cells daily for 10 days. The control animals were injected with saline. The results of the study of chronic toxicity of the culture are presented in table 9.
Наблюдение за животными проводили в течение 7 дней.Observation of the animals was carried out for 7 days.
Через 1 и 7 суток по 5 животных из каждой группы умерщвляли глубоким эфирным наркозом и проводили макроскопическое исследование внутренних органов, а также отбирали различные органы для гистологического изучения: печень, почки, легкие, селезенку, кишечник, мезентериальные лимфатические узлы, головной мозг, тимус, мягкие ткани в области глотки (последние только при оральном введении). Материал фиксировали в растворе формалина, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.After 1 and 7 days, 5 animals from each group were killed by deep ether anesthesia and a macroscopic examination of the internal organs was performed, and various organs were selected for histological examination: liver, kidneys, lungs, spleen, intestines, mesenteric lymph nodes, brain, thymus, soft tissues in the pharynx (the latter only with oral administration). The material was fixed in formalin solution, paraffin sections were stained with hematoxylin and eosin.
Проводили в таком же объеме гистологические исследования органов контрольных животных.Histological studies of the organs of control animals were carried out in the same volume.
В течение всего периода наблюдения животные были здоровы, хорошо поедали пищевые рационы, поведенческие реакции не нарушены, шерстный покров не изменен. Макроскопическое и гистологическое изучение внутренних органов животных не выявило никаких патологических изменений даже в группах животных, получавших максимальное количество бактериальных клеток.During the entire observation period, the animals were healthy, they ate well-fed diets, behavioral reactions were not disturbed, and the coat was not changed. Macroscopic and histological studies of the internal organs of animals did not reveal any pathological changes even in groups of animals that received the maximum number of bacterial cells.
Промышленная применимость штамма подтверждается следующими примерами.The industrial applicability of the strain is confirmed by the following examples.
Пример 1. Использование штамма B. megaterium 874 в качестве продуцента антибактериальных веществExample 1. The use of strain B. megaterium 874 as a producer of antibacterial substances
Штамм отличается выраженной антагонистической активностью, подобно антибиотику широкого спектра действия, он обладает активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др. Антагонистическая активность штамма дает возможность добавлять его в препарат для использования в плановой предоперационной подготовке и послеоперационном периоде для лечения заболеваний легких и верхних дыхательных путей (бронхиты, пневмонии, синуситы, тонзиллиты и т.п., вызванные стафилококками, клебсиеллой и грамотрицательными бактериями), для профилактики и лечения послеоперационных инфекционных осложнений, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.The strain is characterized by pronounced antagonistic activity, like a broad-spectrum antibiotic, it has activity against a wide range of microbial pathogens - Staphylococcus aureus, E. coli, Pr.mirabilis, etc. The antagonistic activity of the strain makes it possible to add it to the drug for use in planned preoperative preparation and the postoperative period for the treatment of diseases of the lungs and upper respiratory tract (bronchitis, pneumonia, sinusitis, tonsillitis, etc., caused by staphylococci, Klebsiella and gram-negative bacteria), for the prevention and treatment of postoperative infectious complications caused by pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms.
Пример использования штамма В. megaterium 874 для получения препаратаAn example of using strain B. megaterium 874 to obtain the drug
1-й пассаж: Стерильно вскрывают ампулу лиофилизированного штамма В. megaterium 874. Содержимое ампулы разводится в 1 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида. Затем полученную взвесь микроорганизмов засевают на жидкую питательную среду (ПБ). Инкубируют при температуре 37±1°C в течение 18-20 часов.1st passage: The ampoule of the lyophilized strain B. megaterium 874 is sterilized. The contents of the ampoule are diluted in 1 ml of a 0.9% sterile sodium chloride solution. Then the resulting suspension of microorganisms is seeded on a liquid nutrient medium (PB). Incubated at a temperature of 37 ± 1 ° C for 18-20 hours.
2-й пассаж: Выросшую культуру разводят 0,9% раствором натрия хлорида до получения суспензии, количество живых клеток в которой составляет не менее 10×109.2nd passage: The grown culture is diluted with 0.9% sodium chloride solution to obtain a suspension, the number of living cells in which is at least 10 × 10 9 .
Полученную суспензию высевают в бактериологические матрацы с питательным агаром стерильным шприцом из расчета примерно 5,0±1,0 мл на матрац. Засеянные матрацы инкубируют при температуре (37±1)C в течение 120±12 ч.The resulting suspension is plated in bacteriological mattresses with nutrient agar using a sterile syringe at the rate of about 5.0 ± 1.0 ml per mattress. Inoculated mattresses are incubated at a temperature of (37 ± 1) C for 120 ± 12 hours.
Смыв биомассы с питательного агара после выращивания.Flushing biomass from nutrient agar after cultivation.
Смыв биомассы, выросшей на поверхности питательной среды, осуществляют 5% раствором натрия хлорида с помощью микробиологических петель. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду. Полученная биомасса представляет собой жидкий концентрат бактерий штамма В. megaterium 874, который можно использовать в качестве лекарственного препарата. Предварительно биомассу разводят 5% раствором натрия хлорида, до получения суспензии, количество живых клеток в которой составляет не менее 109. Готовый продукт разливают по 10 мл во флаконы и укупоривают.The biomass grown on the surface of the nutrient medium is washed off with a 5% sodium chloride solution using microbiological loops. The resulting suspension is collected in a sterile dish. The resulting biomass is a liquid bacterial concentrate of strain B. megaterium 874, which can be used as a drug. Previously, the biomass is diluted with 5% sodium chloride solution, until a suspension is obtained, the number of living cells in which is at least 10 9 . The finished product is poured into 10 ml bottles and corked.
Пример 2. Использование штамма В. megaterium 874 как продуцента иммуномодуляторовExample 2. The use of strain B. megaterium 874 as a producer of immunomodulators
При изучении штамма В. megaterium 874 как продуцента иммуномодуляторов опыты проводили на мышах, животным вводили культуру перорально по 109 микробных клеток каждый день в течение 10 дней. Под влиянием этих процедур усилились функциональные свойства фагоцитов (повысился фагоцитоз), возросла продукция провоспалительных цитокинов, необходимых для инициации гуморального и клеточного иммунитета. В результате увеличилась продукция антител, активировалось образование антигенспецифических Т-хелперов и Т-киллеров.When studying strain B. megaterium 874 as a producer of immunomodulators, experiments were performed on mice, animals were injected with a culture of 10 9 microbial cells orally every day for 10 days. Under the influence of these procedures, the functional properties of phagocytes increased (phagocytosis increased), the production of pro-inflammatory cytokines necessary for the initiation of humoral and cellular immunity increased. As a result, the production of antibodies increased, the formation of antigen-specific T-helpers and T-killers was activated.
Учитывая результаты проведенных исследований, можно рекомендовать использовать данный штамм в качестве иммуномодулятора.Given the results of the studies, we can recommend the use of this strain as an immunomodulator.
1-й пассаж: Лиофилизированную культуру штамма В. megaterium 874 разводят стерильным раствором натрия хлорида, полученную суспензию засевают в 50 мл пептона. Инкубируют 18-20 часов при температуре (37±1)C.1st passage: Lyophilized culture of strain B. megaterium 874 is diluted with a sterile solution of sodium chloride, the resulting suspension is seeded in 50 ml of peptone. Incubated for 18-20 hours at a temperature of (37 ± 1) C.
2-й пассаж: Выросшую культуру, с содержанием живых бактерий не менее 109 вносят в минеральную среду М9 с казаминовыми кислотами, выращивают в биореакторе при температуре (37±1)C 18-20 часов.2nd passage: A grown culture, with a content of living bacteria of at least 109, is introduced into the M9 mineral medium with casamic acids, grown in a bioreactor at a temperature of (37 ± 1) C for 18-20 hours.
После завершения процесса культивирования клетки отделяют центрифугированием. После осаждения клеток надосадочную жидкость ультрафильтруют с использованием установки для ультрафильтрации. Полученный раствор имеет молекулярный вес в диапазоне 10-100 тыс. дальтон. Он свободен также от нуклеиновых кислот, жиров и органических кислот. Изолированный таким образом и очищенный раствор обладает иммуномодуляторными свойствами. Полученный раствор осаждают спиртом (этанол : вода - 3:1 по объему). Осажденный спиртом продукт лиофилизируют.After completion of the cultivation process, the cells are separated by centrifugation. After cell precipitation, the supernatant was ultrafiltered using an ultrafiltration unit. The resulting solution has a molecular weight in the range of 10-100 thousand daltons. It is also free of nucleic acids, fats and organic acids. Thus isolated and purified solution has immunomodulatory properties. The resulting solution was precipitated with alcohol (ethanol: water - 3: 1 by volume). The product precipitated with alcohol is lyophilized.
Пример 3. Использование штамма В. megaterium 874 в качестве продуцента протеолитических ферментов.Example 3. The use of strain B. megaterium 874 as a producer of proteolytic enzymes.
Штамм продуцирует протеазу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Это свойство штамма можно использовать, добавляя бесклеточную культуральную жидкость штамма В. megaterium 874.The strain produces protease, amylase, lipase, catalase, lecithinase. This property of the strain can be used by adding cell-free culture fluid of B. megaterium 874 strain.
Протеолитические ферменты, лизоцим, липазы, амилазы и другие способствуют очищению ран и воспалительных очагов от некротизированных тканей, эта способность штамма может быть использована для профилактики и лечения заболеваний полости рта (глоссит, гингивит, пародонтит, стоматит). Поскольку штамм способен вырабатывать протеолитические ферменты, его можно использовать для лечения ферментной недостаточности поджелудочной железы.Proteolytic enzymes, lysozyme, lipases, amylases and others help cleanse wounds and inflammatory foci of necrotic tissue, this ability of the strain can be used to prevent and treat diseases of the oral cavity (glossitis, gingivitis, periodontitis, stomatitis). Since the strain is capable of producing proteolytic enzymes, it can be used to treat pancreatic enzyme deficiency.
Культивирование штамма проводят при посевной дозе (3-5)×109 кл/мл, насыщении среды кислородом в пределах 70-90%. Культуральную жидкость отделяют от биомассы микрофильтрацией с последующей стерилизующей фильтрацией целевого ферментного препарата. Полученная биомасса является основой для получения препарата-пробиотика. Протеолитическая активность культуральной жидкости 36±6 ПЕ/г.The cultivation of the strain is carried out at a sowing dose of (3-5) × 10 9 cells / ml, saturation of the medium with oxygen in the range of 70-90%. The culture fluid is separated from the biomass by microfiltration, followed by sterilizing filtration of the target enzyme preparation. The resulting biomass is the basis for obtaining the probiotic preparation. Proteolytic activity of the culture fluid 36 ± 6 PE / g
1-й пассаж: Штамм В. megaterium 874 высевают на 2 матраса с агаризованной синтетической питательной средой, содержащей пептон, мальтозу, минеральные соли, микроэлементы и на 18-20 ч помещают в термостат при температуре 37C.1st passage: B. strain megaterium 874 is sown on 2 mattresses with an agarized synthetic nutrient medium containing peptone, maltose, mineral salts, trace elements and placed in a thermostat at 18 ° C for 18-20 hours.
2-й пассаж: Смытую с агара микробную взвесь засевают для подращивания на жидкой среде того же состава в объеме 5 л и растят 3-4 часа.2nd passage: A microbial suspension washed from agar is seeded to grow on a liquid medium of the same composition in a volume of 5 l and grow 3-4 hours.
3-й пассаж: Полученную культуру в дозе (1,0±0,5)×109 КОЕ используют в качестве посевного материала для проведения основного процесса в биореакторе. Выращивание проводят при температуре 37C, насыщении среды кислородом 70-80%, перемешивании со скоростью вращения мешалки 400 об/мин, в течение 16-20 ч до перехода культуры в споровую форму и прекращения нарастания протеолитической активности культуральной жидкости.3rd passage: The resulting culture in a dose of (1.0 ± 0.5) × 10 9 CFU is used as seed for the main process in the bioreactor. Cultivation is carried out at a temperature of 37 ° C, saturation of the medium with oxygen of 70-80%, stirring at a rotational speed of the stirrer of 400 rpm, for 16-20 hours until the culture passes into a spore form and the growth of the proteolytic activity of the culture fluid ceases.
В полученной при этом способе культуральной жидкости уровень протеолитической активности колеблется в пределах 10±3 ПЕ/г, а количество микробных клеток составляет (20±5)×109 КОЕ.In the culture fluid obtained by this method, the level of proteolytic activity ranges from 10 ± 3 PE / g, and the number of microbial cells is (20 ± 5) × 10 9 CFU.
Протеолитическую активность культуральной жидкости определяют методом Ансона при нейтральных значениях pH.The proteolytic activity of the culture fluid is determined by the Anson method at neutral pH values.
После завершения процесса культивирования клетки отделяют центрифугированием. После осаждения клеток надосадочную жидкость ультрафильтруют с использованием установки для ультрафильтрации.After completion of the cultivation process, the cells are separated by centrifugation. After cell precipitation, the supernatant was ultrafiltered using an ultrafiltration unit.
После микрофильтрации протеолитическая активность культуральной жидкости падает до 2,0-4,0 ПЕ/г из-за неспецифической сорбции фермента на мембранах.After microfiltration, the proteolytic activity of the culture fluid drops to 2.0-4.0 PE / g due to non-specific sorption of the enzyme on the membranes.
Для снижения неспецифической сорбции фермента мембраны установки перед ультрафильтрацией обрабатывают 0,5%-ным раствором альбумина, а затем отмывают нейтральным фосфатным буфером. Фермент концентрируют до объема достижения активности (36+6) ПЕ/г. После чего проводят стерилизующую фильтрацию. Разливают полученный продукт во флаконы по 10 мл и герметично укупоривают.To reduce nonspecific sorption of the enzyme, the membranes of the installation are treated with a 0.5% albumin solution before ultrafiltration, and then washed with neutral phosphate buffer. The enzyme is concentrated to a volume of activity achievement (36 + 6) of PE / g. Then sterilizing filtration is carried out. The resulting product is poured into 10 ml vials and hermetically sealed.
Таким образом, исследования показали, что штамм В. megaterium 874 является продуцентом антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов. Штамм В. megaterium 874 обладает иммуномодулирующей способностью, и может быть использован для снижения аллергии. Штамм отличается выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др.. Продуцирует ферменты: протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу; обладает лизоцимной активностью и характеризуется высокой степенью безопасности.Thus, studies have shown that strain B. megaterium 874 is a producer of antibacterial substances, immunomodulators, and proteolytic enzymes. Strain B. megaterium 874 has immunomodulating ability, and can be used to reduce allergies. The strain is characterized by pronounced antagonistic activity against a wide range of microbial pathogens - Staphylococcus aureus, E. coli, Pr.mirabilis, etc. Produces enzymes: protease, gelatinase, amylase, lipase, catalase, lecithinase; possesses lysozyme activity and is characterized by a high degree of safety.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016140188A RU2639569C1 (en) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | Probiotic bacillus megaterium strain - producer of antibacterial substances, immunomodulators and proteolytic enzymes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016140188A RU2639569C1 (en) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | Probiotic bacillus megaterium strain - producer of antibacterial substances, immunomodulators and proteolytic enzymes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2639569C1 true RU2639569C1 (en) | 2017-12-21 |
Family
ID=63857553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016140188A RU2639569C1 (en) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | Probiotic bacillus megaterium strain - producer of antibacterial substances, immunomodulators and proteolytic enzymes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2639569C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757086C1 (en) * | 2021-01-22 | 2021-10-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр "Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" (ИЦиГ СО РАН) | Bacillus megaterium bacterial strain with the ability to produce probiotic and antimicrobial substances of the organic acid class |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0183600B1 (en) * | 1996-07-24 | 1999-04-15 | 대우전자주식회사 | A situation measurement device for head of the head assembly |
-
2016
- 2016-10-12 RU RU2016140188A patent/RU2639569C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0183600B1 (en) * | 1996-07-24 | 1999-04-15 | 대우전자주식회사 | A situation measurement device for head of the head assembly |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| HOLLAND I.B., The purification and properties of megacin, a bacteriocin from Bacillus megaterium, J. Biochem, 1961, 78 (641), p. 641-644. * |
| MOHSEN M.S.ASKER, MANAL G. MAHMOUD et.al., Purification and characterization of two thermostabile protease fractions from Bacillus megaterium, Journal of genetic engineering and biotechnology, 2013, N11, p.103-109. * |
| PAULA M., PERIAGO, RAQUEL CONESA, et.al., Bacillus megaterium spore germination and growth inhibition by a treatment combiling heat with natural antimicrobials, Food technol.biotechnol., 2006, 44(1), p. 17-23. * |
| МАЛАНИЧЕВА И.А., КОЗЛОВ И.Г., СУМАРУКОВА И.Г. и др. Антимикробная активность представителей рода Bacillus megaterium, Микробиология, 2012, т. 81, N2, с. 196-204. * |
| МАЛАНИЧЕВА И.А., КОЗЛОВ И.Г., СУМАРУКОВА И.Г. и др. Антимикробная активность представителей рода Bacillus megaterium, Микробиология, 2012, т. 81, N2, с. 196-204. MOHSEN M.S.ASKER, MANAL G. MAHMOUD et.al., Purification and characterization of two thermostabile protease fractions from Bacillus megaterium, Journal of genetic engineering and biotechnology, 2013, N11, p.103-109. HOLLAND I.B., The purification and properties of megacin, a bacteriocin from Bacillus megaterium, J. Biochem, 1961, 78 (641), p. 641-644. PAULA M., PERIAGO, RAQUEL CONESA, et.al., Bacillus megaterium spore germination and growth inhibition by a treatment combiling heat with natural antimicrobials, Food technol.biotechnol., 2006, 44(1), p. 17-23. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757086C1 (en) * | 2021-01-22 | 2021-10-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр "Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" (ИЦиГ СО РАН) | Bacillus megaterium bacterial strain with the ability to produce probiotic and antimicrobial substances of the organic acid class |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101454440B (en) | Probiotic strain and antimicrobial peptide derived therefrom | |
| RU2580002C1 (en) | Method of producing autoprobiotic containing living bifidus bacteria and lactic acid bacilli | |
| RU2375444C1 (en) | Bifidobacterium bifidum OV-19 STRAIN USED TO PREPARE BACTERIAL PREPARATIONS, BIOLOGICALLY ACTIVE FOOD ADDITIVES, FERMENTED AND UNFERMENTED FOODSTUFF, HYGIENIC AND COSMETIC PRODUCTS | |
| CN113040390B (en) | Probiotic salt-tolerant lactobacillus johnsonii and application thereof in preventing and treating pathogenic bacteria in livestock and poultry aquiculture | |
| CN114134083B (en) | Bacillus bailii and application thereof | |
| CN107354190A (en) | The process of antibacterial peptide is prepared using bacillus licheniformis | |
| RU2639569C1 (en) | Probiotic bacillus megaterium strain - producer of antibacterial substances, immunomodulators and proteolytic enzymes | |
| KR101098946B1 (en) | A compound for feed additive comprising novel Lactobacillus salivarius G1-1 | |
| KR101854705B1 (en) | Novel strains of Bacillus licheniformis NY1505 producing high amount of α-glucosidase inhibitors | |
| KR101665334B1 (en) | Rhodobacter sphaeroides CB 8521 strain, having the effect of reducing malodor and immune activity in livestock industry, and microbial agent using it | |
| RU2298032C2 (en) | Bacillus subtilis 1719 BACTERIUM STRAIN AS PRODUCER OF ANTAGONISTICALLY ACTIVE BIOMASS IN RELATES TO PATHOGENIC MICROORGANISMS, AS WELL AS PROTEOLYTIC, AMYLOLYTIC, AND LIPOLYTIC ENZYMES | |
| RU2366448C2 (en) | Method for making preparation used for treatment of radiation injuries in animals and treatment method of radiation injuries in animals | |
| KR101201337B1 (en) | A feed additive containig novel Lactobacillus spp. complex | |
| RU2393214C1 (en) | Immunobiologial antiallergic agent (versions), lactobacillus acidophilus nkjc strain, lactobacillus acidophilus jch strain, lactobacillus acidophilus kaa strain | |
| RU2302877C2 (en) | Biological food supplement for treatment and prophylaxis of intestine infections complicated with dysbacteriosis and for enhancing nonspecific resistance of organism | |
| RU2247775C1 (en) | Liquid nutrient transporting medium for collection, culturing and transportation of patient blood with suspicion for brucellosis | |
| RU2431663C2 (en) | IMMUNOBIOLOGICAL ANTIALLERGIC AGENT (VERSIONS) AND Lactobacillus acidophilus 100 "аш" PA STRAIN USED FOR PRODUCTION OF IMMUNOBIOLOGICAL ANTIALLERGIC AGENT | |
| RU2158302C2 (en) | Nutrient medium for bifidobacterium and lactobacterium culturing | |
| KR100593255B1 (en) | Novel Bacillus Strain and Its Use | |
| CN111040975B (en) | Enzyme-producing bacillus halophilus and application thereof in preventing and controlling pathogenic bacteria in saline water aquaculture | |
| RU2530552C1 (en) | STRAIN Bacillus lentus - PRODUCER OF BACTERIOCIN-LIKE SUBSTANCE OF ANTIMICROBIAL ACTION AND METHOD OF OBTAINING BACTERIOCIN-LIKE SUBSTANCE | |
| RU2103353C1 (en) | Strain of bacterium lactobacillus acidophilus used for correction of disbacteriosis at gastroenteric diseases and in patient with large intestine cancer | |
| RU2677668C2 (en) | Lactobacillus helveticus d75 and d76 strains and preparation therewith | |
| RU2444366C1 (en) | Antibiotic resistant therapeutic biological product for bacterial and mycotic infections | |
| KR101797139B1 (en) | Novel Lactobacillus gallinarum strain and uses thereof |