RU2634871C1 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/OmpF, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего мембранного белка OmpF, и рекомбинантный штамм E. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF - Google Patents

Рекомбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/OmpF, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего мембранного белка OmpF, и рекомбинантный штамм E. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF Download PDF

Info

Publication number
RU2634871C1
RU2634871C1 RU2016132052A RU2016132052A RU2634871C1 RU 2634871 C1 RU2634871 C1 RU 2634871C1 RU 2016132052 A RU2016132052 A RU 2016132052A RU 2016132052 A RU2016132052 A RU 2016132052A RU 2634871 C1 RU2634871 C1 RU 2634871C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ompf
cmap
pet40cmap
polypeptide
recombinant
Prior art date
Application number
RU2016132052A
Other languages
English (en)
Inventor
Лариса Анатольевна Балабанова
Василий Александрович Голотин
Нина Сергеевна Буйновская
Ольга Юрьевна Портнягина
Ольга Данииловна Новикова
Валерий Александрович Рассказов
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН)
Priority to RU2016132052A priority Critical patent/RU2634871C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2634871C1 publication Critical patent/RU2634871C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена плазмида pET40CmAP/OmpF размером 8767 пар оснований (п.о.), определяющая синтез рекомбинантного гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF. Указанная плазмида характеризуется наличием следующих фрагментов: NcoI/SalI-фрагмента плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и фрагмента ДНК размером 2577 п.о., содержащего химерный ген, кодирующий полноразмерную щелочную фосфатазу CmAP и полноразмерный порин Yersinia pseudotuberculosis OmpF, соединенные между собой последовательностью, кодирующей гибкий линкер (G4S)3 (SEQ ID NO: 1). Предложен рекомбинантный штамм Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF, являющийся продуцентом гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF и полученный путем модификации штамма Е. coli Rosetta (DE3) указанной плазмидой pET40CmAP/OmpF. Группа изобретений обеспечивает высокий выход гибридного белка CmAP/OmpF со свойствами рекомбинантной высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего белка OmpF. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получать микробиологическим синтезом по оптимизированной технологии новый гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina и высокоспецифичного к антителам больных псевдотуберкулезом порина Yersinia pseudotuberculosis, который может быть использован для улучшения диагностической тест-системы псевдотуберкулеза.
Псевдотуберкулез, или экстраинтестинальный иерсиниоз, относится к числу широко распространенных инфекций, что, в первую очередь, обусловлено высокой адаптационной способностью такого возбудителя, как Y. pseudotuberculosis [Г.П. Сомов, Н.Н. Беседнова, Ф.Ф. Антоненко. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 2001, 256 с.]. Порины, или интегральные порообразующие белки наружной мембраны бактерий, как поверхностные антигены представляют собой молекулы-мишени для системы врожденного иммунитета макроорганизма, которые активируют факторы немедленной защиты и участвуют в формировании специфического иммунного ответа, направленного на освобождение от патогена. Особенности структуры и поверхностная локализация в клетке обуславливают участие поринов в осуществлении динамической связи между бактериями и окружающей средой.
Из бактерии Y. pseudotuberculosis (штамм 512, серовар IB) был выделен белок - порин, названный иерсинином, относящийся к термозависимым порообразующим белкам наружной мембраны грамотрицательных бактерий, ассоциированным с пептидогликаном [О.Д. Новикова, Г.М. Фролова и др. Конформационная стабильность и иммунохимические свойства иерсинина - основного белка внешней мембраны псевдотуберкулезного микроба // Биоорган. химия. 1989. Т. 15. С. 763-772]. При иммунизации экспериментальных животных этим белком была получена специфическая антисыворотка с высоким титром. В ряду поверхностных белков иерсинин принадлежит к числу иммунодоминантных антигенов наружной мембраны псевдотуберкулезного микроба. Показано, что при иммунизации как крупных, так и мелких лабораторных животных в сыворотке крови обнаруживаются антитела к иерсинину. При естественном развитии заболевания у людей антитела к порину преобладают. Иерсинин реагирует не только с антисыворотками к бактериям всех 6-ти сероваров Y. pseudotuberculosis, но и с антисыворотками к бактериям других видов иерсиний.
На основе этих результатов разработан иммуноферментный метод (ИФА) для диагностики псевдотуберкулеза с использованием иерсинина в качестве диагностического антигена [О.Ю. Портнягина, О.Д. Новикова и др. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний // Вестник ДВО РАН, 2004. №3, с. 35-44; RU 2339952 С1, 27.11.2008]. Данная диагностическая тест-система отличается от коммерческого диагностикума на основе типоспецифических липополисахаридов тем, что в сыворотках больных обнаруживаются антитела ко всем вариантам возбудителя псевдотуберкулеза. Высокая чувствительность тест-системы позволяет выявлять развитие инфекционного процесса на ранних стадиях (7-10 дней от начала проявления клинических признаков).
Известно, что ИФА диагностика на основе типоспецифических антигенов требует долговременной подготовки и многочисленных затрат на коммерческие антитела. Такого рода проблемы можно решить при помощи заявляемой конструкции бифункционального белка CmAP/OmpF, обладающего свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP и OmpF порина Y. pseudotuberculosis, высокочувствительного по отношению к антителам к возбудителю псевдотуберкулеза.
Методами молекулярного клонирования установлены структуры порина OmpF [GenBank, код доступа AY855840] и щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina ВКМ В-2021 Д (CmAP) [GenBank, код доступа ABD92772]. Описаны методы получения высокоактивной рекомбинантной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP [RU 2447151 С1, 10.04.2012] и рекомбинантного порина OmpF в виде телец включения в клетках Е. coli с последующим его рефолдингом и очисткой [Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д. и др. Выделение и характеристика рекомбинантного OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Биоорган. химия. 2008. №2. С. 1-8].
Задача изобретения - конструирование рекомбинантного штамма-продуцента Е. coli, несущего такую экспрессирующую конструкцию (плазмиду), которая позволит получать в препаративных количествах целевой продукт - высокоочищенный недеградированный гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF в водорастворимой форме с сохранением как антигенной активности OmpF порина Y. pseudotuberculosis, так и ферментативных свойств высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP, используемой для цветной визуализации поринсвязанных комплексов в иммуноферментном методе диагностики иерсиниоза на разных стадиях развития инфекционного процесса.
Поставленная задача решена путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pET40CmAP/OmpF, кодирующей химерный полипептид CmAP/OmpF, и рекомбинантного штамма Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF, обеспечивающих индуцируемый синтез с высоким и стабильным выходом активного растворимого бифункционального белка CmAP/OmpF, обладающего свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP и высокочувствительного OmpF порина Y. pseudotuberculosis.
Технический результат заявленного изобретения - получение растворимого активного гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и высокочувствительного OmpF порина Y. pseudotuberculosis с высокими выходом и уровнем очистки.
Плазмида pET40CmAP/OmpF имеет 8767 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием NcoI/SalI-фрагмента плазмиды pET-40b(+) (Novagen), или последовательности фрагмента ДНК размером 2577 п.о., содержащего химерный ген, начинающий трансляцию со щелочной фосфатазы CmAP (N-конец) и заканчивающийся порином OmpF с С-концевой части молекулы рекомбинантного белка, соединенным со щелочной фосфатазой гибким линкером (G4S)3.
На фиг. 1 представлена физическая карта плазмиды pET40CmAP/OmpF и область плазмиды, ответственная за экспрессию гибридного белка CmAP/OmpF. Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды pET40CmAP/OmpF, фланкированная сайтами NcoI и SalI, содержит последовательность структурного гена CmAP, соответствующую открытой рамке считывания для зрелого белка CmAP, последовательность соединяющего линкера (G4S)3 и последовательность структурного гена OmpF, соответствующую открытой рамке считывания для белка OmpF (SEQ ID NО: 1).
Рекомбинантный штамм Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF получен трансформацией клеток Е. coli Rosetta (DE3) (Novagen) плазмидой pET40CmAP/OmpF с использованием традиционной генно-инженерной технологии [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. 2bd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989].
Рекомбинантный штамм Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки
Клетки штамма образуют крупные круглые с ровными краями, выпуклые колонии до 5 мм в диаметре, поверхность колоний гладкая, консистенция слизистая. Пигмент не накапливается. Грамотрицательные, спор не образуют, капсулы не имеют. Колонии хорошо растут на простых питательных средах (LB). При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки
Рекомбинантный штамм Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF видотипичен по своим биохимическим свойствам. Штамм не обладает желатиназной активностью, не ферментирует лизин; расщепляет глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу до кислоты и газа. Имеет мутацию в гене lac, обеспечивающую контроль уровня экспрессии, а также трансляцию редких кодонов. Оптимальной для роста является температура 37°С, а для продукции белка CmAP/OmpF -16°С.
Устойчивость к антибиотикам
Клетки штамма характеризуются устойчивостью к хлорамфениколу (34 мкг/мл) и канамицину (25 мкг/мл).
Патогенность и токсичность
Рекомбинантный штамм Е. coli Rosetta (DE3)/pET400CmAP/OmpF не патогенен и не токсичен для теплокровных животных.
Штамм хранится обычным способом в суспензии с глицерином (30%) при -20°С.
Способ получения гибридного бифункционального белка CmAP/OmpF заключается в следующем: клетки штамма Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF культивируют в жидкой питательной среде LB в течение 18 ч при 16°С, затем бактериальные клетки осаждают центрифугированием, суспензию клеток дезинтегрируют в буфере, далее экстракт центрифугируют, затем надосадочную жидкость помещают на колонку с Ni-сефарозой (GE Healthcare), далее элюируют белок с 0,5 М имидазолом, затем белковый элюат помещают на колонку с ионообменной смолой для удаления имидазола и получения активной фракции целевого белка. Выход рекомбинантного гибридного бифункционального белка CmAP/OmpF составляет не менее 10 мг рекомбинантного белка из 1 л культуры с удельной активностью щелочной фосфатазы не менее 1000 ед/мг белка и свойствами OmpF порина Y. pseudotuberculosis, характерными для природного аналога.
Рекомбинантный гибридный бифункциональный белок CmAP/OmpF имеет молекулярную массу 127,5 кДа, включая плазмидный шаперон DsbC с молекулярной массой 32,5 кДа, широкий диапазон значений температуры (25-37°С) и pH 7,5-9,5 для проявления фосфатазной активности и антигенных свойств порина OmpF. Плазмидный шаперон Dsb не дает существенного вклада в функциональную способность обеих частей химеры CmAP/OmpF, поэтому этап его удаления из рекомбинантного белка с помощью энтерокиназы по предусмотренному генетической конструкцией сайту рестрикции не обязателен.
Рекомбинантный гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF успешно апробирован в ИФА тест-системах при связывании с антителами к поринам иерсиний в мышиных антисыворотках к рекомбинантному порину OmpF, а также в сыворотках крови больных иерсиниозом независимо от серологического варианта возбудителя Y. pseudotuberculosis. Использование ИФА тест-системы на основе бифункционального порина CmAP/OmpF позволит обеспечить высокий уровень дифференциальной диагностики иерсиниозов от других острых кишечных инфекций со сходными клиническими признаками как на ранних (первая неделя), так и поздних стадиях (вторая - четвертая неделя) развития инфекционного процесса.
На фиг. 2 представлены результаты ИФА, проведенного на микропланшете (Costar), сенсибилизированном антителами из мышиной антисыворотки к рекомбинантному порину OmpF и антителами из сывороток крови больных иерсиниозом с применением гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF, полученного от рекомбинантного штамма Е. coli Rosetta (DE3)/pET40 CmAP/OmpF. Уровень аффинности рекомбинантного гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF к специфическим антителам определяли по концентрации поринсвязанных комплексов, измеренной в единицах активности щелочной фосфатазы CmAP.
Использование порина в составе гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF с активностью щелочной фосфатазы позволяет сократить ИФА на две стадии по сравнению с процедурой, которая требовалась раньше (иммобилизация белка и использование вторых антител).
Существенными преимуществами вышеописанного способа получения гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF являются:
- использование рекомбинантного штамма-продуцента Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF, что позволяет получать при биосинтезе большое количество высокоактивного бифункционального гибридного белка CmAP/OmpF;
- использование несложной двухстадийной хроматографической очистки рекомбинантного белка, что позволяет получить чистый гибридный полипептид CmAP/OmpF за короткое время и с большим выходом.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование плазмиды pET40CmAP/OmpF
Рекомбинантную плазмиду pET40CmAP/OmpF, содержащую химерный ген, кодирующий полноразмерную щелочную фосфатазу CmAP и полноразмерный порин Y. pseudotuberculosis OmpF, соединяющиеся через гибкий линкер (G4S)3, фланкированный сайтами рестрикции NcoI и SalI, конструируют на основе коммерческой плазмиды рЕТ-40b(+) (Novagen).
Фрагмент ДНК, содержащий химерный ген гибридного полипептида CmAP/OmpF, получают в два этапа. На первом этапе проводят полимеразную цепную реакцию с использованием плазмиды 40Pho в качестве матрицы для получения гена щелочной фосфатазы CmAP и праймеров X-PhoN_F и Pho40X-SacI-R, где X-PhoN_F - праймер, специфичный по отношению к N-концевой последовательности CmAP, включающий сайт для рестриктазы NcoI; Pho40X-SacI-R - обратный праймер, специфичный по отношению к С-концевой последовательности CmAP, включающий полинуклеотид, кодирующий линкер (G4S)3 и сайт рестрикции SacI:
X-PhoN_F: 5'-TATTCCATGGCAGAGATCAAGAATGTCATTCTGAT-3'
Pho40X-SacI-R: 5'-TTAAGAGCTCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCA
GAACCACCACCACCCTTCGCTACCACTGTCTTCAGATACTGTCCT-3'.
Данную реакцию проводят в следующих условиях: 10× Encycio буфер, 50× смесь полимераз Encyclo («Encyclo PCR kit», Евроген, Москва), 50× смесь dNTP (10 mM каждого), смесь праймеров (5 μM каждого), 20 нг ДНК. Процесс амплификации состоит из следующих стадий: 30 циклов ПЦР (15 с - 95°С, 1 мин 30 с - 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. После амплификации ПЦР-продукт очищают электрофоретически в 1% агарозном геле. Фрагмент (1 мкг) обрабатывают рестриктазами NcoI и SacI в оптимальном буфере (Fermentas) в течение 3 ч, затем ферменты удаляют из реакционной среды по стандартной методике фенолом (1:1) [Sambrook J. et. al. Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. 2bd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989]. В водную фракцию, содержащую фрагмент, добавляют 1/10 объема 0,3 М ацетата Na, pH 5,2 и 1/2 объема изопропилового спирта и оставляют на -20°С в течение 30 мин. Затем центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин, осадок промывают 75% этанолом и высушивают при комнатной температуре. Осадок растворяют в 20 мкл деионизованной воды.
2 мкг плазмидной ДНК рЕТ-40b(+) обрабатывают рестриктазами NcoI и SacI в соответствии с методикой, описанной выше, и из полученного гидролизата выделяют векторную часть плазмиды в 1% геле легкоплавкой агарозы.
Полученный фрагмент гена CmAP и векторную часть плазмиды рЕТ-40b(+) сшивают при помощи лигазной реакции в 50 мкл буфера для лигирования согласно инструкции (Fermentas). 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli Rosetta (DE3). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 25 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 16 ч при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и анализируют на наличие мутаций при помощи автоматического секвенирования. Отбирают плазмидную ДНК pET40CmAP, содержащую последовательность CmAP с линкером (G4S)3 на С-концевой части.
На втором этапе проводят амплификацию гена OmpF белка с использованием геномной ДНК грамотрицательной бактерии Y. pseudotuberculosis и пары праймеров, несущих сайты рестриктаз SacI и SalI:
OmpF40-Sac-dir: 5'-TTAAGAGCTCCGAAATCTATAACAAAGATGGCAACA-3'
OmpF40-Sal-rev: 5'-TTAAGTCGACTTAGAACTGATAAACCAAGCCAAC-3'
Для создания конструкции pET40CmAP/OmpF полученный ген порина OmpF и 2 мкг плазмидной ДНК pET40CmAP обрабатывают рестриктазами SacI и SalI в соответствии с методикой, описанной выше, и очищают в 1% геле легкоплавкой агарозы. Очищенные ПЦР-фрагменты OmpF и векторную часть плазмиды pET40CmAP сшивают при помощи лигазной реакции в 50 мкл буфера для лигирования согласно инструкции к лигазе (Fermentas). 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli Rosetta (DE3). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 25 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 16 ч при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и анализируют на наличие мутаций при помощи автоматического секвенирования. Отбирают ДНК, содержащую необходимые последовательности генов CmAP и OmpF, представляющую собой плазмиду pET40CmAP/OmpF размером 8767 п.о. (фиг. 1).
Пример 2. Получение рекомбинантного штамма Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцента гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF
Рекомбинантный штамм-продуцент Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF получают путем трансформации клеток штамма Е. coli Rosetta (DE3) рекомбинантной плазмидой pET40CmAP/OmpF. Ночную культуру (0,5 мл LB) рекомбинантного штамма-продуцента гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF помещают в пятилитровую колбу с жидкой средой MX, содержащей на литр 10 г бактотриптона, 7,5 г бактодрожжевого экстракта, 70 г сорбитола, до 10 мМ MgCl2, 4 мл глицерина, 12 г KH2PO4, 25 мг/мл канамицина, pH 7,7, культивируют на шейкере при 200 об/мин при температуре 37°С в течение 3-4 ч до оптической плотности 0,6-0,8 (OD 600 нм), затем проводят процедуру «heat shock» нагреванием при 42°С в течение 30 мин, после чего охлаждают и добавляют индуктор экспрессии IPTG до конечной концентрации 0,2 мМ, далее инкубируют при 16°С в течение 18 ч.
Для определения продуктивности штамма водные клеточные экстракты анализируют электрофорезом в 12,5% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Кумасси R-250 по стандартной методике и определяют относительное количество белка в полосе целевого продукта. Содержание рекомбинантного белка в растворимой клеточной фракции составляет не менее 30% от всех белков этой фракции.
Пример 3. Выделение и характеристика гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF
Рекомбинантный штамм-продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF - Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF инкубируют в пятилитровой колбе в жидкой среде MX, содержащей на литр 10 г бактотриптона, 7,5 г бактодрожжевого экстракта, 70 г сорбитола, до 10 мМ MgCl2, 4 мл глицирина, 12 г KH2PO4, 25 мг/мл канамицина, pH 7,7, на шейкере при 200 об/мин 18 ч при 16°С. Бактериальные клетки осаждают на проточной центрифуге при 5000 об/мин в течение 10 мин. Суспензию клеток дезинтегрируют ультразвуком в 20 мл буфера А (0,05 М трис-HCl, pH 8,5, 0.01% NaN3) 5 раз в течение 30 с, охлаждая во льду. Затем суспензию центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирают и помещают на колонку с Ni-сефарозой (GE Healthcare). Элюцию белка проводят 0,5 М имидазолом в буфере А. Фракцию с элюированным белком помещают на колонку с ионообменной смолой MonoQ (GE Healthcare), предварительно уравновешенную буфером А. Элюцию белка проводят буфером В (25 мМ Tris-HCl, pH 8,5), градиенте соли NaCl (0-0,5 М), фракции с активностью щелочной фосфатазы собирают.
Выход рекомбинантного белка составляет 10 мг из 1 л культуры.
Идентификацию полученного рекомбинантного полипептида проводят по первым 10 аминокислотам на автоматическом секвенаторе. Секвенирование препарата рекомбинантного белка, выделенного из клеток штамма Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF, показало, что N-концевой составляющей химерного белка CmAP/OmpF является аминокислотная последовательность Ala-Glu-Ile-Lys-Asn-Val-Ile-Leu-Met-Ile, соответствующая первым 10 аминокислотам щелочной фосфатазы CmAP.
Ферментативную активность гибридного полипептида CmAP/OmpF определяют по расщеплению пара-нитрофенилфосфата (п-НФФ). Стандартная инкубационная смесь в объеме 500 мкл содержит 15 мМ п-НФФ, 1 М диэтаноламина (ДЭА), pH 10,3; либо 2 мМ п-НФФ, 0,1 М трис-HCl, 0,2 М KCl, pH 9,5-10,0 и фермент. После 30 мин инкубации при 37°С реакцию останавливают добавлением 2 мл 0,5 М NaOH. Количество образовавшегося в процессе ферментативной реакции п-нитрофенола (п-НФ) определяют спектрофотометрически при длине волны 400 нм. За единицу активности щелочной фосфатазы принимают количество фермента, катализирующего освобождение 1 мкМ п-НФ (ε400 нм = 18600) в течение 1 мин инкубации. Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка. Концентрацию белка в растворе определяют по методу Брэдфорда.
Антигенную активность пориновой части гибридного полипептида CmAP/OmpF определяют методом ИФА по уровню аффинности к специфическим антителам к порину OmpF (фиг. 2). В лунки микропланшета, сенсибилизированного мышиной поликлональной специфической сывороткой к рекомбинантному порину OmpF и сыворотками крови больных иерсиниозом, добавляют раствор гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF, полученного от рекомбинантного штамма Е. coli Rosetta (DE3)/pET40 CmAP/OmpF, в концентрациях от 1 до 100 мкг/мл. Уровень аффинности рекомбинантного гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF к специфическим антителам определяют по концентрации CmAP/OmpF-связанных комплексов, измеренной в единицах активности щелочной фосфатазы CmAP.
Полученные данные по характеристике и функциональной активности продукта экспрессии искусственного химерного гена гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF в клетках рекомбинантного штамма Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF свидетельствуют о соответствии антигенной активности исследуемого полипептида таковой его природного аналога - порина OmpF, применяемого в ИФА диагностике псевдотуберкулеза, или экстраинтестинального иерсиниоза.
Как следует из приведенных примеров, авторы получают активный рекомбинантный гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP и высокоспецифичного порина грамотрицательной бактерии Y. pseudotuberculosis с высоким выходом при относительно простой и надежной технологии.
Заявленное изобретение позволяет:
- с помощью использования рекомбинантного штамма-продуцента Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF получать путем биосинтеза большое количество растворимого активного гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF;
- использование металлоаффинной и ионообменной хроматографий при очистке рекомбинантного белка из водного экстракта клеток рекомбинантного штамма-продуцента позволяет получать гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF с чистотой не менее 98% в качестве аналога природного иммуногенного порина Y. pseudotuberculosis OmpF, связывающийся со специфическими к порину антителами, конъюгированный ферментной меткой, применяемого для проведения ИФА при диагностике псевдотуберкулеза, или экстраинтестиального иерсиниоза.

Claims (2)

1. Плазмида pET40CmAP/OmpF размером 8767 пар оснований (п.о.), определяющая синтез рекомбинантного гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF и характеризующаяся наличием следующих фрагментов: NcoI/SalI-фрагмента плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и фрагмента ДНК размером 2577 п.о., содержащего химерный ген, кодирующий полноразмерную щелочную фосфатазу CmAP и полноразмерный порин Yersinia pseudotuberculosis OmpF, соединенные между собой последовательностью, кодирующей гибкий линкер (G4S)3 (SEQ ID NO: 1).
2. Рекомбинантный штамм Е. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF, полученный путем модификации штамма Е. coli Rosetta (DE3) плазмидой pET40CmAP/OmpF по п. 1, - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF.
RU2016132052A 2016-08-03 2016-08-03 Рекомбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/OmpF, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего мембранного белка OmpF, и рекомбинантный штамм E. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF RU2634871C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016132052A RU2634871C1 (ru) 2016-08-03 2016-08-03 Рекомбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/OmpF, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего мембранного белка OmpF, и рекомбинантный штамм E. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016132052A RU2634871C1 (ru) 2016-08-03 2016-08-03 Рекомбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/OmpF, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего мембранного белка OmpF, и рекомбинантный штамм E. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2634871C1 true RU2634871C1 (ru) 2017-11-07

Family

ID=60263714

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016132052A RU2634871C1 (ru) 2016-08-03 2016-08-03 Рекомбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/OmpF, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего мембранного белка OmpF, и рекомбинантный штамм E. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2634871C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2447151C1 (ru) * 2010-12-29 2012-04-10 Учреждение Российской академии наук Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН (ТИБОХ ДВО РАН) ПЛАЗМИДА 40Ph, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CmAP, ШТАММ E.coli rosetta(DE3)/40Ph - ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО БЕЛКА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CmAP, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
RU2538169C1 (ru) * 2013-09-11 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET40CmAP/MBL-T, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОЛИПЕПТИД CmAP/MBL-T СО СВОЙСТВАМИ ВЫСОКОАКТИВНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CMAP И МАННАН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЛЕКТИНА С-ТИПА MBL-T, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОЛИПЕПТИДА CmAP/MBL-T И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2447151C1 (ru) * 2010-12-29 2012-04-10 Учреждение Российской академии наук Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН (ТИБОХ ДВО РАН) ПЛАЗМИДА 40Ph, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CmAP, ШТАММ E.coli rosetta(DE3)/40Ph - ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО БЕЛКА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CmAP, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
RU2538169C1 (ru) * 2013-09-11 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET40CmAP/MBL-T, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОЛИПЕПТИД CmAP/MBL-T СО СВОЙСТВАМИ ВЫСОКОАКТИВНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CMAP И МАННАН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЛЕКТИНА С-ТИПА MBL-T, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОЛИПЕПТИДА CmAP/MBL-T И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank: *
GenBank: ABD92772.1, 12.02.2008, Найдено онлайн: http://www.ncbi.nlm.nih.gov./protein/ABD92772. *
GenBank: AY855840.1, 15.02.2005, Найдено онлайн: http://www.ncbi.nlm.nih.gov./nuccore/58918045?sat=4&satkey=8481008;. *
TOMMASSEN J. ET AL. Gene encoding a hybrid OmpF-PhoE pore protein in the outer membrane of Escherichia coli K12 // Mol Gen Genet (1984) 197:503-508. *
Найдено онлайн: http://www.ncbi.nlm.nih.gov./nuccore/58918045?sat=4&satkey=8481008;. TOMMASSEN J. ET AL. Gene encoding a hybrid OmpF-PhoE pore protein in the outer membrane of Escherichia coli K12 // Mol Gen Genet (1984) 197:503-508. *
Найдено онлайн: http://www.ncbi.nlm.nih.gov./protein/ABD92772. GenBank: *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2371440T3 (es) Mutantes por deleción de glicosiltransferasas de neisseria para biosíntesis de oligosacáridos y genes que las codifican.
CN101351550B (zh) 具有卓越的伴侣和折叠活性的嵌合融合蛋白
Panek et al. Effects of the polyhistidine tag on kinetics and other properties of trehalose synthase from Deinococcus geothermalis
KR101528169B1 (ko) 아비박테리움 파라갈리나룸 항체의 검출방법 및 키트
EP2970953A1 (en) Improved surface display of functional proteins in a broad range of gram negative bacteria
CN117186246A (zh) 一种重组纤连蛋白Pro.FN及其制备方法和应用
JPH02177887A (ja) グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
Frey et al. Immune response against the L-lactate dehydrogenase of Mycoplasma hyopneumoniae in enzootic pneumonia of swine
RU2634871C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/OmpF, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего мембранного белка OmpF, и рекомбинантный штамм E. coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF
JP2014506471A (ja) タンパク質分泌
RU2447151C1 (ru) ПЛАЗМИДА 40Ph, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CmAP, ШТАММ E.coli rosetta(DE3)/40Ph - ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО БЕЛКА, ВКЛЮЧАЮЩЕГО АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CmAP, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
CN104673817B (zh) 一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法
Favre et al. Relatedness of a periplasmic, broad-specificity RNase from Aeromonas hydrophila to RNase I of Escherichia coli and to a family of eukaryotic RNases
Lamont et al. Characterization of an adhesion antigen of Streptococcus sanguis G9B
CN116121215A (zh) 一种甘油磷酸氧化酶的突变体及其用途
US9725748B2 (en) Method for producing fructose-added carbohydrate
RU2538169C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET40CmAP/MBL-T, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОЛИПЕПТИД CmAP/MBL-T СО СВОЙСТВАМИ ВЫСОКОАКТИВНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ CMAP И МАННАН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЛЕКТИНА С-ТИПА MBL-T, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОЛИПЕПТИДА CmAP/MBL-T И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
RU2486243C1 (ru) ПОЛИНУКЛЕОТИД, КОДИРУЮЩИЙ МУТАНТНУЮ РЕКОМБИНАНТНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ Neisseria meningitidis СЕРОГРУППЫ В, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ПОЛИНУКЛЕОТИД, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, РЕКОМБИНАНТНАЯ IgA1 ПРОТЕАЗА Neisseria memingitidis СЕРОГРУППЫ В, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ IgA1 ПРОТЕАЗЫ
US7662606B1 (en) β-agarase isolated from Thalassomonas agarivorans, preparation process and uses thereof
KR101673195B1 (ko) 구멍장이 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 재조합 렉틴
Buinovskaya et al. Hybrid bifunctional protein based on OmpF porin and highly active alkaline phosphatase
US20070141698A1 (en) Microbial protein expression system utilizing plant viral coat protein
RU2813324C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА MBP_RBD_6His ВИРУСА SARS-CoV-2 с C-КОНЦЕВОЙ АФФИННОЙ МЕТКОЙ 6xHIS-tag, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯЧ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ COVID-19
RU2728652C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-SAV, обеспечивающая синтез полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент растворимого полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii
CN103214561B (zh) 人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20190804

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20200827