RU2623314C2 - Assessment method for protective potency of pertussis vaccines - Google Patents
Assessment method for protective potency of pertussis vaccines Download PDFInfo
- Publication number
- RU2623314C2 RU2623314C2 RU2015148021A RU2015148021A RU2623314C2 RU 2623314 C2 RU2623314 C2 RU 2623314C2 RU 2015148021 A RU2015148021 A RU 2015148021A RU 2015148021 A RU2015148021 A RU 2015148021A RU 2623314 C2 RU2623314 C2 RU 2623314C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pertussis
- bacteria
- bronchiseptica
- mice
- infection
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
- G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
- G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
- G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение.The technical field to which the invention relates.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается способа оценки защитной активности коклюшных вакцин при интраназальном заражении животных вирулентными бактериями Bordetella.The invention relates to biotechnology and medicine and relates to a method for evaluating the protective activity of pertussis vaccines in case of intranasal infection of animals with virulent Bordetella bacteria.
Уровень техникиState of the art
Известны различные способы оценки эффективности коклюшных вакцин. Так, van der Ark А. с соавт. ("Коклюшный серологический тест, как альтернатива внутримозговому тесту для оценки иммуногенной активности коклюшных вакцин". Develop, in Biol. Stand. 1996, v. 86. p. 271-281) предлагают оценивать защитную активность коклюшных вакцин по уровню антител к основным протективным антигенам - коклюшному токсину (КТ) и филаментозному гемагглютинину (ФГА) B. pertussis на 4-5 неделе после введения их экспериментальным животным. Известен способ оценки иммуногенности коклюшных вакцин по очищению верхних дыхательных путей лабораторных мышей от вирулентных бактерий B. pertussis на 7-10 день после заражения (Mills КН., et al. "Мышиная модель, в которой иммуногенные свойства коклюшных вакцин, коррелирует с их эффективностью у детей". Inf. and Immun. 1998. vol. 66, №2. p. 594-602). Syukuda Y. с соавт. ("Тест аэрозольного инфицирования для оценки иммуногенности коклюшных вакцин". Tokai J. Exp. Clin. Med. 1988, vol. 13, Suppl. 2. p. 71-72) предложили оценивать защитную активность коклюшных вакцин по уровню специфических антител и количеству бактерий в легких после аэрозольного заражения вакцинированных мышей вирулентным бактериями B. pertussis.Various methods are known for evaluating the efficacy of pertussis vaccines. So, van der Ark A. et al. (“Pertussis serology test as an alternative to the intracerebral test for assessing the immunogenic activity of pertussis vaccines.” Develop, in Biol. Stand. 1996, v. 86. p. 271-281) propose to evaluate the protective activity of pertussis vaccines by the level of antibodies to the main protective antigens - pertussis toxin (CT) and filamentous hemagglutinin (PHA) B. pertussis at 4-5 weeks after administration to experimental animals. A known method for evaluating the immunogenicity of pertussis vaccines by cleaning the upper respiratory tract of laboratory mice from virulent bacteria B. pertussis 7-10 days after infection (Mills KN, et al. "A mouse model in which the immunogenic properties of pertussis vaccines correlates with their effectiveness in children. "Inf. and Immun. 1998. vol. 66, No. 2. p. 594-602). Syukuda Y. et al. (“Aerosol infection test for assessing the immunogenicity of pertussis vaccines.” Tokai J. Exp. Clin. Med. 1988, vol. 13, Suppl. 2. p. 71-72) suggested that the protective activity of pertussis vaccines be evaluated by the level of specific antibodies and the number of bacteria in the lungs after aerosol infection of vaccinated mice with virulent bacteria B. pertussis.
Однако описанные способы оценки иммуногенности коклюшных вакцин сложны, требуют использования большого количества лабораторных животных, длительных сроков исследования, а также отличаются высокой вариабельностью.However, the described methods for assessing the immunogenicity of pertussis vaccines are complex, require the use of a large number of laboratory animals, long study periods, and are also highly variable.
Метод оценки защитных свойств коклюшных вакцин, описанный в "Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий" (М., 1987, стр. 18-28), основан на модели внутримозгового заражения мышей. Метод заключается в следующем: белых беспородных мышей массой 10-12 г внутрибрюшинно иммунизируют испытуемой коклюшной вакциной в дозе, составляющей прививочную дозу для человека. Через 2 недели проводят внутримозговое заражение экспериментальных животных нейротропным штаммом бактерий В. pertussis 18323, в дозах, вызывающих 100% гибель интактных животных. Доза вирулентного штамма должна составлять не менее 100 ЛД50 (ЛД50 - летальная доза, при которой погибают 50% животных, взятых в опыт). Для вычисления ЛД50 параллельно с основным опытом заражают интактных мышей используемой вирулентной культурой четырьмя дозами с пятикратным шагом. После заражения наблюдение за экспериментальными животными проводят в течение 14-17 суток, ежедневно учитывая гибель и паралич мышей. По окончании опыта высчитывают процент выживших животных. Эффективными считаются вакцины, защищающие не менее 70% животных, взятых в опыт. Главным недостатком метода является заражение вакцинированных животных не естественным для коклюша путем. Внутримозговое заражение не может моделировать патогенез коклюша и, следовательно, корректно характеризовать защитную активность вакцины. Полученные с помощью этого метода результаты лишь коррелируют с защитной активность вакцины у человека. Этому способу также свойственны такие недостатки, как длительность срока исследования, значительное количество экспериментальных животных и низкая и воспроизводимость результатов.The method for assessing the protective properties of pertussis vaccines, described in the "Instructions for the selection, verification and storage of production strains of pertussis bacteria" (M., 1987, p. 18-28), is based on a model of intracerebral infection of mice. The method consists in the following: white outbred mice weighing 10-12 g are immunized intraperitoneally with the test pertussis vaccine at a dose of a vaccination dose for humans. After 2 weeks, an intracerebral infection of experimental animals is carried out with a neurotropic strain of bacteria B. pertussis 18323, in doses that cause 100% death of intact animals. The dose of the virulent strain should be at least 100 LD 50 (LD 50 is the lethal dose at which 50% of the animals taken in the experiment die). To calculate the LD 50, in parallel with the main experiment, four doses with a five-fold step are used to infect intact mice with the virulent culture used. After infection, the observation of experimental animals is carried out for 14-17 days, daily considering the death and paralysis of mice. At the end of the experiment, the percentage of surviving animals is calculated. Effective vaccines are considered that protect at least 70% of the animals taken in the experiment. The main disadvantage of this method is the infection of vaccinated animals in a non-natural way for whooping cough. Intracerebral infection cannot model the pathogenesis of whooping cough and, therefore, correctly characterize the protective activity of the vaccine. The results obtained using this method only correlate with the protective activity of the vaccine in humans. This method is also characterized by such disadvantages as the length of the study period, a significant number of experimental animals and low and reproducible results.
Модель интраназального заражения мышей была использована для оценки защитной активности цельноклеточных коклюшных вакцин Quinvaxem, Easyfive and Pentavac (Anne Marie Queenan et. al. The mouse intranasal challenge model for potency testing of whole-cell pertussis vaccines. Expert Review of Vaccines. 2014, Vol. 13, No. 10, p. 1265-1270). Эффективность вакцин определялась на основании определения КОЕ в легких через пять дней после интраназального заражения вакцинированных мышей вирулентным штаммом Bordetella pertussis. Выявлены различия в эффективности тестируемых вакцин.The mouse intranasal infection model was used to evaluate the protective activity of the whole-cell pertussis vaccines Quinvaxem, Easyfive and Pentavac (Anne Marie Queenan et. Al. The mouse intranasal challenge model for potency testing of whole-cell pertussis vaccines. Expert Review of Vaccines. 2014, Vol. 13, No. 10, p. 1265-1270). Vaccine efficacy was determined by determining CFU in the lungs five days after intranasal infection of the vaccinated mice with a virulent strain of Bordetella pertussis. Differences in the effectiveness of the tested vaccines were revealed.
В патенте РФ 2231793 предложен способ оценки защитной активности коклюшных вакцин по количественному содержанию в них коклюшного токсина. Использование в качестве индикатора иммуногенных свойств коклюшных вакцин количества содержащегося в них коклюшного токсина (КТ) обусловлено тем, что КТ является основным протективным антигеном, обеспечивающим активную защиту организма против коклюшной инфекции ("Коклюш" ААР 2000, Red Book; Report the Committee on Infetions Diseases, 25 th, Copyrigth; 2000 American Academy Pediatrics, p. 439; Wendy A. Keitell M.D. "Новые вакцины и новые вакцинные технологии" Infect. Dis. Clin of Noth America. 1999, v. 13, №1, p. 83-84). В предлагаемом способе оценки иммуногенности коклюшные вакцины, содержащие низкое количество КТ, например 8, 40, 81 и 10, 20, 45 мкг/мл, защищали всего 20-40% животных, взятых в опыт, а коклюшные вакцины, содержащие 220 и 241 мкг/мл, защищали от 90% до 95% экспериментальных животных.RF patent 2231793 proposes a method for evaluating the protective activity of pertussis vaccines by the quantitative content of pertussis toxin in them. The use of the amount of pertussis toxin (CT) contained in them as an indicator of the immunogenic properties of pertussis vaccines is due to the fact that CT is the main protective antigen that provides active protection of the body against pertussis infection ("Pertussis" AAP 2000, Red Book; Report the Committee on Infetions Diseases , 25 th, Copyrigth; 2000 American Academy Pediatrics, p. 439; Wendy A. Keitell MD "New Vaccines and New Vaccine Technologies" Infect. Dis. Clin of Noth America. 1999, v. 13, No. 1, p. 83- 84). In the proposed method for assessing the immunogenicity, pertussis vaccines containing a low amount of CT, for example 8, 40, 81 and 10, 20, 45 μg / ml, protected only 20-40% of the animals taken in the experiment, and pertussis vaccines containing 220 and 241 μg / ml, protected from 90% to 95% of the experimental animals.
В публикации WO 2007104451 описан метод оценки эффективности живой вакцины, содержащей аттенуированные бактерии Bordetella pertussis BPZE1, и бесклеточной коклюшной вакцины aPv с последующим интраназальным заражением вакцинированных мышей вирулентным штаммом В. pertussis. Balb/C мыши интраназально вакцинировались 1×106 бактерий BPZE1. При вакцинации aPv (Tetravac; Aventis-Pasteur, France) мышей иммунизировали внутрибрюшинно в количестве 20% от дозы для человека. Спустя одну, две, три или четыре недели после вакцинации BPZE1 или aPv мышей заражали интраназально вирулентными бактериями В. pertussis BPSM/betA-lacZ, через неделю удаляли легкие и определяли КОЕ. Вакцинация BPZE1 в отличие от aPV обеспечивает полную защиту от интраназальной инфекции вирулентным штаммом B. pertussis (наблюдается полный бактериальный клиренс в легких спустя неделю после инфекции и статистически значимое уменьшение бактериальной загрузки через 3 часа после инфекции по сравнению c). При вакцинации aPV отмечено присутствие бактерий B. pertussis в легких животных спустя неделю после инфекции.WO2007104451 describes a method for evaluating the efficacy of a live vaccine containing attenuated Bordetella pertussis BPZE1 bacteria and acellular pertussis aPv vaccine, followed by intranasal infection of vaccinated mice with a virulent B. pertussis strain. Balb / C mice were intranasally vaccinated with 1 × 10 6 BPZE1 bacteria. Upon vaccination with aPv (Tetravac; Aventis-Pasteur, France), mice were immunized intraperitoneally in an amount of 20% of a human dose. One, two, three or four weeks after vaccination with BPZE1 or aPv, the mice were infected with intranasally virulent B. pertussis BPSM / betA-lacZ bacteria, the lungs were removed a week later and CFU was determined. Vaccination with BPZE1, unlike aPV, provides complete protection against intranasal infection with a virulent B. pertussis strain (complete bacterial clearance in the lungs one week after infection and a statistically significant decrease in bacterial load 3 hours after infection compared with c). With aPV vaccination, the presence of B. pertussis bacteria was observed in the lungs of animals one week after infection.
Иммуногенность вакцины против возбудителя коклюша в патенте РФ 2455024 оценивалась по смертности мышей после интрацеребрального заражения бактериями высоковирулентного штамма В. pertussis 18323. При интраназальной иммунизации мышам вводили от 4 до 500 млн. живых микробных клеток в 25 мкл однократно. Через 14 дней после иммунизации мышей заражали интрацеребрально высоковирулентным штаммом В. pertussis 18323. В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3 (Отраслевой стандартный образец корпускулярной коклюшной вакцины, ГИСК им. Л.А. Тарасевича), который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве 10 MOE. После интрацеребрального заражения мышей высоковирулентным штаммом В. pertussis 18323 наблюдали защиту от гибели от 80 до 100% в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации.The immunogenicity of the pertussis pathogen vaccine in RF patent 2455024 was evaluated by the mortality of mice after intracerebral infection with bacteria of the highly virulent B. pertussis 18323 strain. During intranasal immunization, mice were injected with 4 to 500 million live microbial cells in 25 μl once. 14 days after immunization, the mice were infected with an intracerebrally highly virulent B. pertussis 18323 strain. As a positive control, the OSO-3 preparation was used (Sectoral standard sample of corpuscular pertussis vaccine, L.A. Tarasevich GISK), which was administered to the mice intraperitoneally in an amount of 10 MOE . After intracerebral infection of mice with a highly virulent B. pertussis 18323 strain, protection from death from 80 to 100% was observed depending on the number of bacteria used for vaccination.
В исследованиях роли протективных антигенов Bordetella bronchiseptica Zhao Z. с соавт. ("Irnmunogenicity of recombinant protective antigen and efficacy against intranasal challenge with Bordetella bronchiseptica". Vaccine. 2009, (18): 2523-8) продемонстрировали эффективность подкожной иммунизации мышей рекомбинантным белком rF1P2, состоящим из иммунодоминантного протективного домена типа I (F1) FHA (филаментозного гемагглютинина) и высокоиммуногенной области домена II (P2) пертактина, на модели интраназальной инфекции В. bronchiseptica. Иммунизация rF1P2 обеспечивала защиту животных от последующей интраназальной инфекции различными штаммами В. bronchiseptica в летальных дозах по сравнению с контролем (мыши, иммунизированные адьювантом Фрейнда).In studies of the role of protective antigens of Bordetella bronchiseptica Zhao Z. et al. ("Irnmunogenicity of recombinant protective antigen and efficacy against intranasal challenge with Bordetella bronchiseptica". Vaccine. 2009, (18): 2523-8) demonstrated the effectiveness of subcutaneous immunization of mice with recombinant protein rF1P2 consisting of the immunodominant protective domain of type I (F1) FHA ( filamentous hemagglutinin) and the highly immunogenic domain of domain II (P2) pertactin, in a model of intranasal infection of B. bronchiseptica. Immunization with rF1P2 protected animals from subsequent intranasal infection with different strains of B. bronchiseptica in lethal doses compared to control (mice immunized with Freund's adjuvant).
Paul В. Mann и Eric Т. Harvill с соавт. ("Comparative Toll-Like Receptor 4-Mediated Innate Host Defense to Bordetella Infection". Infect Immun. 2005, 73 (12): 8144-8152) изучали TLR4 (Toll-подобный рецептор) - опосредованный иммунитет на модели мышей, инфицированых интраназально В. bronchiseptica и В. pertussis в дозе 5000 КОЕ с последующей количественной оценкой колонизации в легких, как описано в публикации Harvill, E.T. с соавт. (Pregenomic comparative analysis between Bordetella bronchiseptica RB50 and Bordetella pertussis Tohama I in murine models of respiratory tract infection. Infect. Immun. 1999. 67: 6109-6118). У TLR4-дефектных мышей интраназальная инфекция В. bronchiseptica в дозе 5×105 КОЕ приводила к летальному исходу в течение 96 часов. Однако, при интраназальной инфекции В. pertussis в той же дозе, у TLR4-дефектных мышей не было выявлено симптомов болезни. Бактериальный рост в легких измерялся в 0, 2, 6, 12, 24, 48 и 72 часа после инфекции. Легкие инфицированных WT-мышей (дикого типа) содержали приблизительно 106 КОЕ B. bronchiseptica, в то время как легкие инфицированных TLR4-дефектных мышей содержали приблизительно 109 КОЕ бактерий.Paul B. Mann and Eric T. Harvill et al. (Comparative Toll-Like Receptor 4-Mediated Innate Host Defense to Bordetella Infection. Infect Immun. 2005, 73 (12): 8144-8152) studied TLR4 (Toll-like receptor) - mediated immunity in mice infected with intranasally B bronchiseptica and B. pertussis at a dose of 5000 CFU followed by quantification of colonization in the lungs, as described in Harvill, et al. (Pregenomic comparative analysis between Bordetella bronchiseptica RB50 and Bordetella pertussis Tohama I in murine models of respiratory tract infection. Infect. Immun. 1999. 67: 6109-6118). In TLR4-defective mice, an intranasal infection of B. bronchiseptica at a dose of 5 × 10 5 CFU led to death within 96 hours. However, with the same dose of B. pertussis intranasal infection, no symptoms of the disease were detected in TLR4-defective mice. Bacterial growth in the lungs was measured at 0, 2, 6, 12, 24, 48, and 72 hours after infection. The lungs of infected WT mice (wild-type) contained approximately 10 6 CFU of B. bronchiseptica, while the lungs of infected TLR4-defective mice contained approximately 10 9 CFU of bacteria.
Экспериментальная модель интраназальной инфекции мышей была использована при анализе in vivo роли бактерий В. bronchiseptica, отличающихся повышенной вирулентностью для человека, с последующей количественной оценкой колонизации в легких ("Phenotypic and Genomic Analysis of Hypervirulent Human-associated Bordetella bronchiseptica". Umesh Ahuja et. al. BMC Microbiol. 2012, 12: 167). Мышей линии C57B L/6NCr инфицировали интраназально и изучали колонизацию бактерий в легких. При интраназальном инфицировании мышей C57B L/6NCr бактериями В. bronchiseptica RB50 комплекса IV в дозе 5×105 КОЕ и спустя 3 дня в легких регистрировали в 10 до 30 раз больше КОЕ, чем после инфекции менее вирулентными для человека бактериями В. bronchiseptica комплекса I (p<0.001).An experimental model of intranasal infection of mice was used in an in vivo analysis of the role of B. bronchiseptica bacteria, which are distinguished by increased virulence in humans, followed by quantitative assessment of lung colonization (Phenotypic and Genomic Analysis of Hypervirulent Human-associated Bordetella bronchiseptica. Umesh Ahuja et. Al. Al. . BMC Microbiol. 2012, 12: 167). C57B L / 6NCr mice were infected intranasally and studied colonization of bacteria in the lungs. In case of intranasal infection of C57B L / 6NCr mice with B. bronchiseptica RB50 complex IV bacteria at a dose of 5 × 10 5 CFU and after 3 days, 10 to 30 times more CFU were recorded in the lungs than after infection with bacteria less virulent for humans B. bronchiseptica complex I (p <0.001).
Бактерии B. bronchiceptica, отличающиеся по уровню вирулентности, использовали для достижения гибели мышей при интраназальном заражении ("Replacement of Adenylate Cyclase Toxin in a Lineage of Bordetella bronchiseptica". Anne M. Buboltz, Eric T. Harvill et. al. J Bacteriol. 2008, 190(15): 5502-5511). При инокуляции мышей гипервирулентным штаммом В. bronchiseptica (RB50) в дозах 106.1, 106.3 или 106.6 КОЕ количество выживших мышей составляло 100%, 50% и 0% соответственно. При инокуляции мышей гиповирулентным штаммом В. bronchiseptica (253) в дозах 106.5, 107.3 или 107.5 КОЕ количество выживших мышей составляло 100%, 50% и 33% соответственно. Полученные результаты указывают на то, что LD50 для гиповирулентного штамма 253 в 10 раз выше (на 17.9 млн. КОЕ), чем для гипервирулентного штамма RB50. Увеличение LD50 для штамма 253 коррелировало с уменьшением бактериальной загрузки респираторного тракта мышей. При заражении мышей бактериями RB50 или 253 в дозе 105.7 КОЕ количество бактерий штамма RB50 в легких составляло 104.9, 106.3, 104.3, 103.5 и 10 (ниже предела обнаружения) КОЕ на 3, 7, 14, 28 и 56 день после заражения соответственно. Количество бактерий штамма 253 в легких составляло 105.6, 105.7, 103.8, 101.5 КОЕ и было ниже предела обнаружения на 3, 7, 14, 28 и 56 день после заражения соответственно.Bacteria of B. bronchiceptica, differing in virulence, were used to achieve the death of mice by intranasal infection ("Replacement of Adenylate Cyclase Toxin in a Lineage of Bordetella bronchiseptica". Anne M. Buboltz, Eric T. Harvill et. Al. J Bacteriol. 2008 190 (15): 5502-5511). Upon inoculation of mice with a hypervirulent strain of B. bronchiseptica (RB50) at doses of 10 6.1 , 10 6.3 or 10 6.6 CFU, the number of surviving mice was 100%, 50% and 0%, respectively. Upon inoculation of mice with a hypovirulent strain of B. bronchiseptica (253) at doses of 10 6.5 , 10 7.3 or 10 7.5 CFU, the number of surviving mice was 100%, 50% and 33%, respectively. The results indicate that the LD 50 for the hypovirulent strain 253 is 10 times higher (17.9 million CFU) than for the hypervirulent strain RB50. The increase in LD 50 for strain 253 correlated with a decrease in the bacterial load of the respiratory tract of mice. When mice were infected with RB50 or 253 bacteria at a dose of 10 5.7 CFU, the number of bacteria of the strain RB50 in the lungs was 10 4.9 , 10 6.3 , 10 4.3 , 10 3.5, and 10 (below the detection limit) CFU at 3, 7, 14, 28, and 56 days after infection accordingly. The number of bacteria of strain 253 in the lungs was 10 5.6 , 10 5.7 , 10 3.8 , 10 1.5 CFU and was below the detection limit at 3, 7, 14, 28 and 56 days after infection, respectively.
Использование интраназального заражения Bordetella bronchiseptica при оценке иммуногенных композиций Bordetella bronchiseptica описано в патенте РФ 255448. Собак вакцинировали подкожно соответствующей вакциной в сутки 0 и 21. На 42-е сутки собак из всех групп обработки подвергали интраназальному заражению Bordetella bronchiseptica посредством распыления аэрозоля в плексигласовой камере в течение 30 минут. Эффективность оценивали по сокращению продолжительности кашля и выделения из носа.The use of intranasal infection of Bordetella bronchiseptica in the evaluation of immunogenic compositions of Bordetella bronchiseptica is described in RF patent 255448. Dogs were vaccinated subcutaneously with the corresponding vaccine on days 0 and 21. On day 42, dogs from all treatment groups were intranasally infected with Bordetella bronchiseptica by spraying in a Plexiglas aerosol within 30 minutes. Efficacy was evaluated by reducing the duration of coughing and nasal discharge.
В настоящее время защитные свойства коммерческих коклюшных вакцин, выпускаемых в серийное производство, определяют по выживаемости вакцинированных мышей после внутримозгового введения вирулентных бактерий В. pertussis. Метод не отражает реальной картины противококлюшного иммунитета и определяет параметры, коррелирующие с защитной активностью вакцин у человека.Currently, the protective properties of commercial pertussis vaccines, which are put into serial production, are determined by the survival rate of vaccinated mice after intracerebral administration of virulent bacteria B. pertussis. The method does not reflect the real picture of pertussis immunity and determines the parameters that correlate with the protective activity of vaccines in humans.
Нормативные документы РФ и рекомендации ВОЗ предусматривают возможность определения защитной активности по изменению бактериальной нагрузки в легких вакцинированных мышей после их интраназального (аэрозольного) заражения вирулентными бактериями В. pertussis. Однако метод подсчета колоний в легких инфицированных мышей в разные сроки после их заражения вирулентными бактериями трудоемок и не позволяет надежно определить количественные характеристики защитной активности.Regulatory documents of the Russian Federation and WHO recommendations provide for the possibility of determining the protective activity by changing the bacterial load in the lungs of vaccinated mice after their intranasal (aerosol) infection with virulent B. pertussis bacteria. However, the method of counting colonies in the lungs of infected mice at different times after their infection with virulent bacteria is laborious and does not allow reliable determination of the quantitative characteristics of the protective activity.
Методы определения защитной активности коклюшных вакцин в результате регистрации выживаемости мышей после интраназального заражения вирулентными бактериями B. pertussis в настоящее время не разработаны.Methods for determining the protective activity of pertussis vaccines as a result of registration of the survival of mice after intranasal infection with virulent bacteria B. pertussis have not been developed.
Таким образом, простых и надежных способов оценки иммуногенных свойств, адекватно отражающих защитную активность коклюшных вакцин, выпускаемых в массовую вакцинопрофилактику, не существует. Метод определения защитной активности вакцин по выживаемости мышей при внутримозговом заражении коррелирует с защитной активностью корпускулярной коклюшной вакцины (ККВ) у людей, но не обеспечивает адекватного моделирования противококлюшного иммунитета у человека. Возможность его применения для оценки живых и бесклеточных KB не установлена. Поэтому разработка новых методов контроля и оценки защитных свойств коклюшных вакцин, в том числе производственных серий, является актуальной задачей современной вакцинопрофилактики. Модель интраназального заражения мышей более адекватна из-за использования естественного способа заражения животных и может рассматриваться как перспективная при разработке новых методов определения защитной активности коклюшных вакцин.Thus, there are no simple and reliable methods for evaluating the immunogenic properties adequately reflecting the protective activity of pertussis vaccines produced in mass vaccine prophylaxis. The method for determining the protective activity of vaccines by the survival of mice during intracerebral infection correlates with the protective activity of corpuscular pertussis vaccine (CCE) in humans, but does not provide adequate modeling of pertussis immunity in humans. The possibility of its use for the assessment of live and cell-free KB has not been established. Therefore, the development of new methods for monitoring and evaluating the protective properties of pertussis vaccines, including production batches, is an urgent task of modern vaccine prevention. The model of intranasal infection of mice is more adequate due to the use of a natural method of infection of animals and can be considered promising when developing new methods for determining the protective activity of pertussis vaccines.
Исследования последнего десятилетия показали, что циркулирующие в настоящее время в разных странах штаммы бактерий B. pertussis содержат последовательности ptx, fga, prn, отличные от последовательностей, ранее циркулирующих, и вакцинных штаммов B. pertussis (Mooi FR. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen. Infect Genet Evol. 2010, v. 10. N 1. p. 36-49). Предполагают, что рост заболеваемости коклюшем связан именно с циркуляцией бактерий «нового» генотипа, в связи с чем рассматривается возможность замены «старых» вакцинных штаммов на «новые» для производства современных вакцин.Studies of the last decade have shown that B. pertussis bacterial strains currently circulating in different countries contain ptx, fga, prn sequences different from the previously circulating sequences of B. pertussis vaccine strains (Mooi FR. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen. Infect Genet Evol. 2010, v. 10. N 1. p. 36-49). It is believed that the increase in the incidence of pertussis is associated precisely with the circulation of bacteria of the “new” genotype, and therefore the possibility of replacing the “old” vaccine strains with “new” ones for the production of modern vaccines is being considered.
Большинство выявленных мутаций в последовательности ptx, кодирующей основной протективный антиген возбудителя коклюша (КТ), расположены в области, ответственной за формирование структур протективных эпитопов КТ. Получены данные, указывающие на роль некоторых мутаций в повышении вирулентности новых генотипов бактерий и изменении эффективности «старых» вакцин по отношению к бактериям «новых» генотипов. Проведено изучение вирулентности бактерий недавно появившегося в большинстве стран генотипа бактерий. Бактерии B. pertussis ptxP3 содержат мутацию в опероне ptx, увеличивающую транскрипцию и экспрессию КТ. В экспериментах in vitro продукция токсина бактериями B. pertussis генотипа ptxP3 возрастает в несколько раз. In vivo продемонстрирована возросшая вирулентность бактерий «нового» генотипа, что, как полагают, обусловлено более высоким уровнем продукции КТ (Komatsu E., Yamaguchi F., Abe A., et al. Weiss AA, Watanabe M. Synergic effect of genotype changes in pertussis toxin and pertactin on adaptation to an acellular pertussisvaccine in the murine intranasal challenge model. Clin Vaccine Immunol. 2010, v. 17. N. 5, p. 807-812). В других экспериментах прямо продемонстрирована сниженная эффективность зашиты животных, вакцинированных убитыми бактериями старого генотипа ptxA1, prn1 от бактерий B. pertussis «нового» генотипа или ptxA2 и prn2 (Higgs R, Higgins S.C., Ross P.J., Mills K.H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunol. 2012, 5: 485-500).Most of the identified mutations in the ptx sequence encoding the main protective antigen of the pertussis pathogen (CT) are located in the region responsible for the formation of structures of protective epitopes of the CT. The data obtained indicate the role of certain mutations in increasing the virulence of new bacterial genotypes and changing the effectiveness of “old” vaccines with respect to bacteria of “new” genotypes. A study was made of the virulence of bacteria recently appeared in most countries of the bacterial genotype. Bacteria B. pertussis ptxP3 contain a mutation in the ptx operon, which increases the transcription and expression of CT. In in vitro experiments, the production of toxin by B. pertussis bacteria of the ptxP3 genotype increases several times. In vivo, the increased virulence of bacteria of the “new” genotype was demonstrated, which is believed to be due to a higher level of CT production (Komatsu E., Yamaguchi F., Abe A., et al. Weiss AA, Watanabe M. Synergic effect of genotype changes in pertussis toxin and pertactin on adaptation to an acellular pertussisvaccine in the murine intranasal challenge model. Clin Vaccine Immunol. 2010, v. 17. N. 5, p. 807-812). Other experiments directly demonstrated the reduced efficiency of protection of animals vaccinated with killed bacteria of the old ptxA1, prn1 genotype from B. pertussis bacteria of the “new” genotype or ptxA2 and prn2 (Higgs R, Higgins SC, Ross PJ, Mills KH Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussisis Mucosal Immunol. 2012, 5: 485-500).
Эти результаты делают актуальным разработку технологии определения защитной активности аттенуированных бактерий «новых» генотипов, сконструированных на основе аттенуированных бактерий.These results make it relevant to develop a technology for determining the protective activity of attenuated bacteria of "new" genotypes constructed on the basis of attenuated bacteria.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Авторами настоящего изобретения впервые предложен способ определения защитной активности коклюшных вакцин, основанный на определении ЛД50 при интраназальном заражения мышей вирулентными бактериями В. bronchiseptica, В. parapertussis и В. pertussis, обеспечивающий простую и надежную оценку защитной активности коклюшных вакцин в процессе их разработки и контроля производственных серий, выпускаемых для массовой вакцинопрофилактики.The authors of the present invention for the first time proposed a method for determining the protective activity of pertussis vaccines, based on the determination of LD 50 for intranasal infection of mice with virulent bacteria B. bronchiseptica, B. parapertussis and B. pertussis, providing a simple and reliable assessment of the protective activity of pertussis vaccines in the process of their development and control production series produced for mass vaccine prophylaxis.
Предложенный способ предусматривает вакцинацию мышей коклюшными вакцинами с последующим заражением вирулентными бактериями В. pertussis, В. bronchiseptica, В. parapertussis и отличается тем, что осуществляют интраназальное заражение вирулентными бактериями В. bronchiseptica, В. parapertussis и В. pertussis в летальных дозах и определяют выживаемость вакцинированных животных.The proposed method involves vaccination of mice with pertussis vaccines followed by infection with virulent bacteria B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis and differs in that they carry out intranasal infection with virulent bacteria B. bronchiseptica, B. parapertussis and B. pertussis in lethal doses and determine survival vaccinated animals.
В одном из предпочтительных вариантов в качестве вирулентного штамма используют штамм В. bronchiseptica 8220-17.In one embodiment, the B. bronchiseptica 8220-17 strain is used as the virulent strain.
В качестве тестируемых вакцин согласно предложенному способу используют цельноклеточные вакцины, состоящие из живых или инактивированных бактерий.As test vaccines according to the proposed method, whole-cell vaccines consisting of live or inactivated bacteria are used.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Настоящее изобретение впервые обеспечивает способ определения защитной активности коклюшных вакцин, предусматривающий вакцинацию мышей коклюшными вакцинами с последующим интраназальным заражением вирулентными бактериями В. pertussis, В. bronchiseptica и B. parapertussis в летальных дозах и определением выживаемости вакцинированных животных.The present invention provides for the first time a method for determining the protective activity of pertussis vaccines, comprising vaccinating mice with pertussis vaccines, followed by intranasal infection with virulent bacteria B. pertussis, B. bronchiseptica and B. parapertussis in lethal doses and determining the survival rate of vaccinated animals.
В соответствии с предложенным способом были использованы вирулентные бактерии B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504.In accordance with the proposed method, virulent bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 and B. parapertussis 504 were used.
Штамм B. pertussis 475 является одним из вакцинных штаммов, используемых в России для производства корпускулярных коклюшных вакцин.Strain B. pertussis 475 is one of the vaccine strains used in Russia for the production of corpuscular pertussis vaccines.
В. bronchiseptica 8220 - штамм бактерий, выделенный от свиней, больных бронхосептикозом (Коллекция штаммов ФГБУ ФНИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи Минздрава России).B. bronchiseptica 8220 - a bacterial strain isolated from pigs suffering from bronchosepticosis (Collection of strains of the Federal State Budget Healthcare Institution named after N.F. Gamalei of the Ministry of Health of Russia).
В. bronchiseptica 8220-17 представляют собой рекомбинантные бактерии, продуцирующие коклюшный токсин B. pertussis (Говорун В.М., Иванова В.Ф., Кирилов М.Ю. и др. Особенности экспрессии оперона коклюшного токсина под контролем собственного и гетерологичного промоторов в клетках Bordetella pertussis. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 1993, №2. стр. 21-27). Рекомбинантные бактерии B. bronchoseptica 8220-17 продуцируют коклюшный токсин, обладающий всеми свойствами КТ бактерий B. pertussis. Интраназальная инокуляция В. bronchiseptica 8220-17 макакам резус сопровождается развитием лейкоцитоза и выработкой специфических антител к КТ (результаты не представлены).B. bronchiseptica 8220-17 are recombinant bacteria producing pertussis toxin B. pertussis (Govorun V.M., Ivanova V.F., Kirilov M.Yu. et al. Features of expression of the pertussis toxin operon under the control of intrinsic and heterologous promoters in Bordetella pertussis cells. Molecular Genetics, Microbiology, Virology. 1993, No. 2, pp. 21-27). Recombinant bacteria B. bronchoseptica 8220-17 produce pertussis toxin, which has all the properties of CT bacteria B. pertussis. Intranasal inoculation of B. bronchiseptica 8220-17 rhesus monkeys is accompanied by the development of leukocytosis and the development of specific antibodies to CT (results not shown).
В. parapertussis 504 выделен от больного паракоклюшем Коллекция штаммов ФГБУ ФНИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи Минздрава России).B. parapertussis 504 isolated from a patient with pertussis. Collection of strains of FSBI Federal Scientific Medical Research Center named after N.F. Gamalei of the Ministry of Health of Russia).
Для интраназальной вакцинации мышей использовали аттенуированные бактерии B. pertussis 4MKS (живая коклюшная вакцин-ЖКВ), имеющие генотип ptxP3 (результаты конструирования не представлены), и бактерии штамма B. pertussis 4М, имеющие генотип ptxP1 (Синяшина Л.Н., Синяшина Л.С., Семин Е.Г., Амелина И.П., Каратаев Г.И. Конструирование генетически аттенуированных бактерий Bordetella pertussis, утративших активность дермонекротического токсина и продуцирующих измененную нетоксичную форму коклюшного токсина. Молек. генетика, Микробиология 2010, №3, стр. 31-36), и коммерческий препарат АКДС С1252/ААП/15ФГУП «НПО «Микроген».For intranasal vaccination of mice, attenuated bacteria B. pertussis 4MKS (live pertussis vaccine-LCV) with the ptxP3 genotype (construction results not shown) and B. pertussis 4M bacteria with the ptxP1 genotype (Sinyashina L.N., Sinyashina L. S., Semin EG, Amelina IP, Karataev GI Construction of genetically attenuated Bordetella pertussis bacteria that have lost the activity of dermonecrotic toxin and produce an altered non-toxic form of pertussis toxin. Molecular Genetics, Microbiology 2010, No. 3, p. . 31-36), and a commercial prep arat AKDS S1252 / AAP / 15FGUP NPO Microgen.
Результаты изучения летальности интраназального инфицирования лабораторных мышей вирулентными бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504 представлены в примере 1 (табл. 1). Гибель животных имеет дозозависимый характер. В течение первых 17 дней погибло 100% животных, инфицированных бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 или B. parapertussis 504 в дозе 2×109, и 70-90% животных, инфицированных 1×109 бактерий. При инфицирующей дозе 0,5×109 погибло около 50% животных.The results of studying the lethality of intranasal infection of laboratory mice with virulent bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220, and B. parapertussis 504 are presented in Example 1 (Table 1). The death of animals has a dose-dependent nature. During the first 17 days, 100% of animals infected with bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 or B. parapertussis 504 at a dose of 2 × 10 9 , and 70-90% of animals infected with 1 × died 10 9 bacteria. At an infectious dose of 0.5 × 10 9 , about 50% of the animals died.
Определение количества КОЕ в легких животных через час после инокуляции показало, что при интраназальном введении 5×108-2×109 бактерий в легких регистрируется 105-106 бактерий B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 или B. parapertussis 504.The determination of the number of CFU in the lungs of animals one hour after inoculation showed that with intranasal administration of 5 × 10 8 -2 × 10 9 bacteria, 10 5 -10 6 bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica are detected in the lungs 8220 or B. parapertussis 504.
Приведенные в табл. 1 результаты показывают, что вирулентные штаммы бактерий B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504 обеспечивают гибель инфицированных интраназально животных при инокуляции 5×108-2×109.Given in the table. 1 results show that virulent strains of bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 and B. parapertussis 504 ensure the death of intranasally infected animals upon inoculation of 5 × 10 8 -2 × 10 9 .
Интраназальное заражение лабораторных мышей бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504 приводит к развитию легочной инфекции, гибели животных в первые 17 дней и/или к значительной потере веса, всклокоченности шерсти и нарушению активности животных.Intranasal infection of laboratory mice with bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 and B. parapertussis 504 leads to the development of pulmonary infection, death of animals in the first 17 days and / or to significant weight loss, hair dislocation and disturbance animal activity.
Использованные для анализа бактерии рода Bordetella отличаются друг от друга продукцией коклюшного токсина. B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17 продуцируют КТ, а у бактерий В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504 КТ отсутствует. Тем не менее мыши, инфицированные всеми использованными штаммами бактерий, гибнут примерно в одни сроки и имеют характерные клинические проявления заболевания. Общим для всех штаммов является способность продуцировать аденилатциклазный токсин, дермонекротический токсин, гемагглютинин, пертактин и некоторые другие факторы вирулентности. Можно предположить, что наблюдаемый патологический процесс у мышей может быть связан с действием токсинов бактерий рода Bordetella.The bacteria of the genus Bordetella used for analysis differ from each other in the production of pertussis toxin. B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17 produce CT, and bacteria B. bronchiseptica 8220 and B. parapertussis 504 do not produce CT. Nevertheless, mice infected with all used bacterial strains die at about the same time and have characteristic clinical manifestations of the disease. Common to all strains is the ability to produce adenylate cyclase toxin, dermonecrotic toxin, hemagglutinin, pertactin and some other virulence factors. It can be assumed that the observed pathological process in mice may be associated with the action of toxins of bacteria of the genus Bordetella.
Защитную активность вакцин определяли по выживаемости лабораторных мышей после интраназального заражения бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17 или B. parapertussis 504 (пример 2, табл. 3).The protective activity of the vaccines was determined by the survival of laboratory mice after intranasal infection with bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17 or B. parapertussis 504 (example 2, table 3).
Данные определения вирулентности бактерий B. pertussis 475 и В. bronchiseptica 8220-17, использованных для интраназального заражения вакцинированных и нативных мышей, представлены в табл. 2 (пример 2).The data for determining the virulence of bacteria B. pertussis 475 and B. bronchiseptica 8220-17 used for intranasal infection of vaccinated and native mice are presented in table. 2 (example 2).
Представленные в табл. 3 результаты показывают, что ЖКВ защищает животных от интраназального заражения бактериями B. pertussis 475 и В. bronchiseptica 8220-17 в дозе, обеспечивающей 100% гибель мышей в первые 17 дней после инфекции (8-10 ЛД50). Зависимость защитной активности от количества аттенуированых бактерий при интраназальном заражении близка к параметрам, полученным при внутримозговом заражении мышей бактериями B. pertussis 18323. Однако выявлены и некоторые количественные отличия. При интраназальном заражении бактериями B. pertussis 475 и В. bronchiseptica 8220-17 70% защита животных обеспечивается при дозе аттенуированных бактерий, равной 0,03×109, что в 5 раз меньше, чем при использовании теста внутримозгового заражения мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323 (табл. 3).Presented in the table. 3 results show that the LCD protects animals from intranasal infection with bacteria B. pertussis 475 and B. bronchiseptica 8220-17 in a dose that ensures 100% death of mice in the first 17 days after infection (8-10 LD 50 ). The dependence of the protective activity on the number of attenuated bacteria during intranasal infection is close to the parameters obtained during intracerebral infection of mice with B. pertussis 18323. However, some quantitative differences were revealed. With intranasal infection with bacteria B. pertussis 475 and B. bronchiseptica 8220-17, 70% of the animals are protected with a dose of attenuated bacteria equal to 0.03 × 10 9 , which is 5 times less than when using the intracerebral infection test of mice with virulent bacteria B. pertussis 18323 (tab. 3).
В соответствии с предложенным способом пригодные для использования в качестве коклюшных вакцин штаммы бактерий В. pertussis должны обеспечивать 70% защиту от интраназального заражения вирулентными бактериями в дозе, составляющей 8-10 ЛД50 (табл. 2, 3).In accordance with the proposed method, bacterial strains of B. pertussis suitable for use as pertussis vaccines should provide 70% protection against intranasal infection with virulent bacteria at a dose of 8-10 LD 50 (Tables 2, 3).
Не было выявлено существенной разницы в результатах тестирования ЖКВ, полученных при использовании бактерий B. pertussis 475 и В. bronchiseptica 8220-17. Вариант предложенного способа с использованием рекомбинантных бактерий В. bronchiseptica 8220-17 является хорошей альтернативой используемому в настоящее время и требующему высокой квалификации методу внутримозгового заражения мышей бактериями B. pertussis 18323. Дополнительным преимуществом предлагаемого способа является простота работы с бактериями В. bronchiseptica 8220-17 по сравнению с медленно растущими и требующими стандартных сред и крови бактериями B. pertussis 475 и B. pertussis 18323.There was no significant difference in the results of testing of LCS obtained using bacteria B. pertussis 475 and B. bronchiseptica 8220-17. A variant of the proposed method using recombinant bacteria B. bronchiseptica 8220-17 is a good alternative to the currently used and highly qualified method of intracerebral infection of mice with bacteria B. pertussis 18323. An additional advantage of the proposed method is the ease of use with bacteria B. bronchiseptica 8220-17 according to compared with the slowly growing and requiring standard media and blood bacteria B. pertussis 475 and B. pertussis 18323.
Сравнительное изучение защитной активности аттенуированных бактерий «старого» генотипа ptxP1 B. pertussis 4М и нового ptxP3 B. pertussis 4MKS осуществлялось в экспериментах по определению выживаемости вакцинированных лабораторных мышей после интраназального заражения бактериями B. pertussis 475 (Пример 3, табл. 4).A comparative study of the protective activity of attenuated bacteria of the “old” B. ptxP1 genotype of B. pertussis 4M and the new ptxP3 of B. pertussis 4MKS was carried out in experiments to determine the survival of vaccinated laboratory mice after intranasal infection with B. pertussis 475 bacteria (Example 3, Table 4).
Использование предложенного способа позволит экономить время, средства при оценке защитной активности противококлюшных вакцин, в том числе полученных из нативных и рекомбинантных бактерий B. pertussis «нового» генотипа, в процессе их экспериментальной проверки и тестирования производственных серий.Using the proposed method will save time, money when evaluating the protective activity of pertussis vaccines, including those obtained from native and recombinant bacteria B. pertussis of the "new" genotype, during their experimental verification and testing of production batches.
Изобретение иллюстрируется следующими примерамиThe invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Изучение летальности интраназального инфицирования лабораторных мышей вирулентными бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 или B. parapertussis 504.Example 1. The study of the lethality of intranasal infection of laboratory mice with virulent bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 or B. parapertussis 504.
В эксперименте использовали мышей линии Balb/C1 весом 10-12 гр. Бактерии выращивали на среде КУА с кровью в течение 24 и 12 часов для B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504 соответственно.In the experiment, Balb / C1 mice weighing 10-12 g were used. Bacteria were grown on AMC with blood for 24 and 12 hours for B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 and B. parapertussis 504, respectively.
Культуру собирали с чашки, суспендировали в физрастворе до концентрации 80 MOE (8×1010 бактерий в мл) и 25 мкл суспензии в соответствующих разведениях вводили мышам. Для инокуляции использовали исходную культуру и два ее 2-кратных разведения, содержащих соответственно 2×109, 109 и 5×108 бактерий. На каждую дозу использовали по 10 животных. Контролем служили животные, которым интраназально вводили 25 мкл физраствора. За животными наблюдали в течение 30 дней. Препараты вводили интраназально в объеме 10-30 мкл под наркозом, поднося шприц к ноздре животного и добиваясь проникновения препарата без пузырей и разбрызгивания. Перед заражением мышам вводили 0,03 мл золетила в концентрации 4 мг/мл. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.The culture was collected from a plate, suspended in saline to a concentration of 80 MOE (8 × 10 10 bacteria per ml) and 25 μl of the suspension in appropriate dilutions was injected into mice. For inoculation used the original culture and two of its 2-fold dilutions containing, respectively, 2 × 10 9 , 10 9 and 5 × 10 8 bacteria. 10 animals were used for each dose. The control was animals that were intranasally injected with 25 μl of saline. The animals were observed for 30 days. The drugs were administered intranasally in a volume of 10-30 μl under anesthesia, bringing the syringe to the animal’s nostril and getting the drug to penetrate without blisters and spraying. Before infection, mice were injected with 0.03 ml of zoletil at a concentration of 4 mg / ml. The experimental results are presented in table. one.
ЛД50 рассчитывали по методу Кербра (Приложение 2 "Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий" М., 1987).LD 50 was calculated by the method of Kerr (Appendix 2 "Instructions for the selection, verification and storage of production strains of pertussis bacteria" M., 1987).
Из данных, представленных в табл. 1, следует, что 100% животных погибло после инфекции бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504 в дозе 2×109 и погибло 70-90% животных при инфицирующей дозе 1×109 бактерий. При инфицирующей дозе 0,5×109 погибло более 50% животных. Расчетное значение ЛД50 для разных видов бактерий рода Bordetella в данном эксперименте составило (0,41-0,47)×109 инокулированных бактерий. Инфицированные животные теряли в весе, имели выраженные изменения в шерстяном покрове (взъерошенная шерсть) и значительно сниженную активность (сбивались в кучу и сидели без движения). После 20-го дня гибели животных не наблюдали. Состояние выживших мышей приходило в норму, наблюдался прирост веса животных.From the data presented in table. 1, it follows that 100% of the animals died after infection with bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 and B. parapertussis 504 at a dose of 2 × 10 9 and 70-90% of animals died at an infectious dose of 1 × 10 9 bacteria. With an infectious dose of 0.5 × 10 9 , more than 50% of the animals died. The calculated value of LD 50 for different types of bacteria of the genus Bordetella in this experiment was (0.41-0.47) × 10 9 inoculated bacteria. Infected animals lost weight, had pronounced changes in the coat (tousled hair) and significantly reduced activity (strayed together and sat motionless). After the 20th day, no deaths were observed. The condition of the surviving mice returned to normal, an increase in the weight of animals was observed.
Определение количества КОЕ в легких животных через час после инокуляции показало, что при интраназальном введении 5×108-2×109 бактерий в легких регистрируется около 105-106 бактерий B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 или B. parapertussis 504. Таким образом, количество бактерий в легких инфицированных животных меньше количества бактерий, введенных интраназально.Determination of the number of CFU in the lungs of animals one hour after inoculation showed that with intranasal administration of 5 × 10 8 -2 × 10 9 bacteria, about 10 5 -10 6 bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 or B. parapertussis 504. Thus, the number of bacteria in the lungs of infected animals is less than the number of bacteria introduced intranasally.
Приведенные в табл. 1 результаты показывают, что штаммы бактерий B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504 имеют высокую вирулентность, обеспечивающую гибель инфицированных интраназально мышей в дозах, равных или меньше 106 бактерий.Given in the table. 1 results show that the bacterial strains B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 and B. parapertussis 504 have high virulence, which ensures the death of intranasally infected mice in doses equal to or less than 10 6 bacteria.
Таким образом, интраназальное заражение лабораторных мышей бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17, В. bronchiseptica 8220 и B. parapertussis 504 приводит к развитию легочной инфекции и гибели животных в первые 17 дней при инокуляции в дозе 5×108-2×109 и регистрации в легких 105-106 бактерий.Thus, intranasal infection of laboratory mice with bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 and B. parapertussis 504 leads to the development of pulmonary infection and death of animals in the first 17 days with inoculation at a dose of 5 × 10 8 - 2 × 10 9 and registration in the lungs of 10 5 -10 6 bacteria.
Разница в количестве введенных интраназально и зарегистрированных в легких бактерий сразу после инфекции указывает, вероятно, на попадание в легкие только малой части инокулируемых бактерий.The difference in the number of bacteria introduced intranasally and registered in the lungs of the lungs immediately after the infection probably indicates only a small part of the inoculated bacteria entering the lungs.
Пример 2. Изучение защитной активности вакцин способом определения выживаемости лабораторных мышей после интраназального заражения бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17 и B. parapertussis 504.Example 2. The study of the protective activity of vaccines by determining the survival rate of laboratory mice after intranasal infection with bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17 and B. parapertussis 504.
Для интраназальной вакцинации использовались мыши линии Balb/C1 весом 10-12 гр. Вакцинацию проводили тремя сериями ЖКВ в приведенных в таблице дозах, содержащихся в 25 мкл суспензии. Для интраназального заражения контрольных мышей и определения ЛД50 использовали 25 мкл суспензии, содержащей 3×109, 1×109 и 0,3×109 бактерий B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17 или B. parapertussis 504. В таблице 2 приведены результаты определения вирулентности (ЛД50) использованных в эксперименте штаммов бактерий рода Bordetella. Для интраназального заражения вакцинированных животных использовали разрешающую дозу 3×109 бактерий, вызывающую 100% гибель нативных животных и составляющую примерно 8-10 ЛД50 (табл. 2).For intranasal vaccination, Balb / C1 mice weighing 10-12 g were used. Vaccination was carried out in three series of ZhKV in the doses shown in the table contained in 25 μl of suspension. For intranasal infection of control mice and determination of LD 50 , 25 μl of a suspension containing 3 × 10 9 , 1 × 10 9 and 0.3 × 10 9 bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17 or B. parapertussis 504. B was used. table 2 shows the results of the determination of virulence (LD 50 ) used in the experiment of strains of bacteria of the genus Bordetella. For intranasal infection of vaccinated animals, a resolving dose of 3 × 10 9 bacteria was used, causing 100% death of native animals and approximately 8-10 LD 50 (Table 2).
Результаты изучения защитной активности ЖКВ при интраназальном заражении мышей живыми бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17 и B. parapertussis 504 представлены в табл.3The results of studying the protective activity of gastrointestinal infections during intranasal infection of mice with live bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17 and B. parapertussis 504 are presented in Table 3
Для сравнения приведены данные защитной активности трех серий ЖКВ и АКДС, определенные в тесте выживаемости вакцинированных мышей после внутримозгового введения около 300 ЛД50 вирулентных бактерий B. pertussis 18323 (Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий. Методические указания МУК 4.2.2317-08).For comparison, the data on the protective activity of three series of LCV and DTP determined in the survival test of vaccinated mice after intracerebral injection of about 300 LD 50 of virulent bacteria B. pertussis 18323 (Control methods. Biological and microbiological factors. Selection, verification and storage of production strains of pertussis, pertussis and bronchiseptic bacteria. Guidelines MUK 4.2.2317-08).
Представленные в табл. 3 результаты показывают, что все серии ЖКВ защищают животных от интраназального заражения бактериями B. pertussis 475 и В. bronchiseptica 8220-17 в дозе, обеспечивающей 100% гибель (примерно 10 ЛД50). Зависимость защитной активности от количества аттенуированых бактерий при интраназальном заражении близка к параметрам, полученным при внутримозговом заражении мышей бактериями B. pertussis 18323.Presented in the table. 3 results show that all series of LCVs protect animals from intranasal infection with bacteria B. pertussis 475 and B. bronchiseptica 8220-17 in a dose that provides 100% death (approximately 10 LD 50 ). The dependence of the protective activity on the number of attenuated bacteria during intranasal infection is close to the parameters obtained during intracerebral infection of mice with B. pertussis 18323 bacteria.
При интраназальном заражении бактериями B. pertussis 475 и В. ronchiseptica 8220-17 70% защита животных обеспечивается при дозе аттенуированных бактерий, равной 0,03×109, что в 5 раз меньше, чем при внутримозговом заражении мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323. Эти данные могут означать, что эффективность вакцин при использовании интраназального заражения несколько выше, чем при внутримозговом заражении.With intranasal infection with bacteria B. pertussis 475 and B. ronchiseptica 8220-17, 70% of the animals are protected with a dose of attenuated bacteria equal to 0.03 × 10 9 , which is 5 times less than with intracerebral infection of mice with virulent bacteria B. pertussis 18323 These data may indicate that the efficacy of vaccines with intranasal infection is slightly higher than with intracerebral infection.
Не было выявлено существенной разницы в результатах тестирования ЖКВ, полученных при использовании бактерий B. pertussis 475 и В. bronchiseptica 8220-17.There was no significant difference in the results of testing of LCS obtained using bacteria B. pertussis 475 and B. bronchiseptica 8220-17.
Таким образом, в соответствии с предложенным способом защитная активность коклюшных вакцин может быть оценена путем определения выживаемости мышей после их вакцинации и последующего интраназального заражения вирулентными бактериями B. pertussis 475, В. bronchiseptica 8220-17 и B. parapertussis 504 в дозах, составляющих 8-10 ЛД50.Thus, in accordance with the proposed method, the protective activity of pertussis vaccines can be evaluated by determining the survival rate of mice after vaccination and subsequent intranasal infection with virulent bacteria B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17 and B. parapertussis 504 in doses of 8- 10 LD 50 .
Вариант предложенного способа с использованием рекомбинантных бактерий В. bronchiseptica 8220-17 является хорошей альтернативой используемому в настоящее время, требующему высокой квалификации методу внутримозгового заражения мышей бактериями B. pertussis 18323. Дополнительным преимуществом предлагаемого способа является простота работы с бактериями В. bronchiseptica 8220-17 по сравнению с медленно растущими и требующими стандартных сред и крови бактериями B. pertussis 475 и B. pertussis 18323.A variant of the proposed method using recombinant bacteria B. bronchiseptica 8220-17 is a good alternative to the currently used, highly qualified method of intracerebral infection of mice with bacteria B. pertussis 18323. An additional advantage of the proposed method is the ease of use with bacteria B. bronchiseptica 8220-17 compared with the slowly growing and requiring standard media and blood bacteria B. pertussis 475 and B. pertussis 18323.
Пример 3. Сравнительное изучение защитной активности аттенуированных бактерий B. pertussis 4М и B. pertussis 4MKS (ЖКВ) при интраназальной инфекции лабораторных мышей вирулентными бактериями B. pertussis 475.Example 3. A comparative study of the protective activity of attenuated bacteria B. pertussis 4M and B. pertussis 4MKS (LCD) in case of intranasal infection of laboratory mice with virulent bacteria B. pertussis 475.
Результаты сравнительного изучения защитной активности аттенуированных бактерий «старого» генотипа ptxP1 B. pertussis 4М и нового ptxP3 B. pertussis 4MKS в тесте выживаемости вакцинированных лабораторных мышей после интраназального заражения бактериями B. pertussis 475 представлены в табл. 4. При вакцинации использовано интраназальное введение аттенуированных бактерий (ЖКВ).The results of a comparative study of the protective activity of attenuated bacteria of the “old” B. ptxP1 genotype of B. pertussis 4M and the new ptxP3 B. pertussis 4MKS in the survival test of vaccinated laboratory mice after intranasal infection with B. pertussis 475 bacteria are presented in Table. 4. For vaccination, the intranasal administration of attenuated bacteria (LCD) was used.
Для заражения использованы вирулентные бактерии B. pertussis 475 в дозе 3×109 в 25 мкл суспензии на мышь, соответствующей 8-10 ЛД50.For infection, virulent bacteria B. pertussis 475 were used at a dose of 3 × 10 9 in 25 μl of a suspension per mouse corresponding to 8-10 LD 50 .
Представленные в табл. 4 результаты показывают возможность использования метода интраназального заражения вакцинированных мышей вирулентными бактериями B. pertussis для оценки защитной активности кандидатных живых вакцин, независимо от генотипа аттенуированных бактерий. Отмечена тенденция увеличения защитной активности ЖКВ при использовании бактерий B. pertussis 4MKS по сравнению с B. pertussis 4М.Presented in the table. 4 results show the possibility of using the method of intranasal infection of vaccinated mice with virulent bacteria B. pertussis to assess the protective activity of candidate live vaccines, regardless of the genotype of the attenuated bacteria. There is a tendency toward an increase in the protective activity of FAs using B. pertussis 4MKS bacteria compared to B. pertussis 4M.
Предложенный способ позволяет экономить время и средства при оценке защитной активности противококлюшных вакцин, независимо от генотипа бактерий, использованных при их создании. Способ может быть полезен для оценки эффективности вакцин со «старым» генотипом для защиты животных от заражения вирулентными бактериями «новых» генотипов и определения целесообразности замены вакцинных штаммов на «новые» при производстве современных коклюшных вакцин.The proposed method allows to save time and money when evaluating the protective activity of pertussis vaccines, regardless of the genotype of the bacteria used to create them. The method can be useful for evaluating the effectiveness of vaccines with the "old" genotype to protect animals from infection with virulent bacteria of the "new" genotypes and determine the feasibility of replacing vaccine strains with "new" ones in the production of modern pertussis vaccines.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015148021A RU2623314C2 (en) | 2015-11-09 | 2015-11-09 | Assessment method for protective potency of pertussis vaccines |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015148021A RU2623314C2 (en) | 2015-11-09 | 2015-11-09 | Assessment method for protective potency of pertussis vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015148021A RU2015148021A (en) | 2017-05-16 |
| RU2623314C2 true RU2623314C2 (en) | 2017-06-23 |
Family
ID=58715232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015148021A RU2623314C2 (en) | 2015-11-09 | 2015-11-09 | Assessment method for protective potency of pertussis vaccines |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2623314C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2799018C2 (en) * | 2021-10-12 | 2023-06-30 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | METHODS FOR ASSESSING THE PROTECTIVE ACTIVITY AND IMMUNOGENICITY OF PERTUSSIS VACCINES IN HUMANS, THE USE OF LIVE PERTUSSIS RECOMBINANT VACCINE GamFA |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2231793C1 (en) * | 2003-03-11 | 2004-06-27 | Москаленко Екатерина Петровна | Method for evaluating anti-whooping vaccine immunogenicity |
| WO2007104451A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Institut Pasteur De Lille | Live attenuated bordetella strains as a single dose vaccine against whooping cough |
| CN101074442A (en) * | 2007-04-29 | 2007-11-21 | 中国药品生物制品检定所 | Recombinant expression and use for pertussis vaccine protective antigen |
| RU2455024C1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития РФ" | Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine |
| US8465754B2 (en) * | 2007-05-28 | 2013-06-18 | Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. | Bordetella parapertussis whole-cell vaccine composition |
-
2015
- 2015-11-09 RU RU2015148021A patent/RU2623314C2/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2231793C1 (en) * | 2003-03-11 | 2004-06-27 | Москаленко Екатерина Петровна | Method for evaluating anti-whooping vaccine immunogenicity |
| WO2007104451A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Institut Pasteur De Lille | Live attenuated bordetella strains as a single dose vaccine against whooping cough |
| CN101074442A (en) * | 2007-04-29 | 2007-11-21 | 中国药品生物制品检定所 | Recombinant expression and use for pertussis vaccine protective antigen |
| US8465754B2 (en) * | 2007-05-28 | 2013-06-18 | Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. | Bordetella parapertussis whole-cell vaccine composition |
| RU2455024C1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития РФ" | Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ZHAO Z. et al. Immunogenicity of recombinant protective antigen and efficacy against intranasal challenge with Bordetella bronchiseptica. Vaccine, 2009, (18): 2523-8. * |
| Коклюш: симптомы, лечение, профилактика 12.02.2012 http://antivakcina.org/koklyush-simptomy-lechenie-profilaktika/. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2799018C2 (en) * | 2021-10-12 | 2023-06-30 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | METHODS FOR ASSESSING THE PROTECTIVE ACTIVITY AND IMMUNOGENICITY OF PERTUSSIS VACCINES IN HUMANS, THE USE OF LIVE PERTUSSIS RECOMBINANT VACCINE GamFA |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015148021A (en) | 2017-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Choh et al. | Burkholderia vaccines: are we moving forward? | |
| Ghunaim et al. | Advances in vaccination against avian pathogenic Escherichia coli respiratory disease: potentials and limitations | |
| Hegerle et al. | Pertactin deficient Bordetella pertussis present a better fitness in mice immunized with an acellular pertussis vaccine | |
| Conlan et al. | Differential ability of novel attenuated targeted deletion mutants of Francisella tularensis subspecies tularensis strain SCHU S4 to protect mice against aerosol challenge with virulent bacteria: effects of host background and route of immunization | |
| AU2013280718B2 (en) | Attenuated Streptococcus suis vaccines and methods of making and use thereof | |
| Wang et al. | Research progress in live attenuated Brucella vaccine development | |
| Long et al. | Contributions of lipopolysaccharide and the type IVB secretion system to Coxiella burnetii vaccine efficacy and reactogenicity | |
| David et al. | Efficacies of whole cell and acellular pertussis vaccines against Bordetella parapertussis in a mouse model | |
| Elahi et al. | Protective role of passively transferred maternal cytokines against Bordetella pertussis infection in newborn piglets | |
| Sanapala et al. | Multiple antigens of Yersinia pestis delivered by live recombinant attenuated Salmonella vaccine strains elicit protective immunity against plague | |
| Yang et al. | Vaccination with a ΔnorD ΔznuA Brucella abortus mutant confers potent protection against virulent challenge | |
| Belcher et al. | Live attenuated Bordetella pertussis vaccine candidate BPZE1 transiently protects against lethal pneumococcal disease in mice | |
| Byvalov et al. | Yersinia outer membrane vesicles as potential vaccine candidates in protecting against plague | |
| Jain-Gupta et al. | Rough Brucella neotomae provides protection against Brucella suis challenge in mice | |
| Ji et al. | Radiation-inactivated S. gallinarum vaccine provides a high protective immune response by activating both humoral and cellular immunity | |
| Pesciaroli et al. | Salmonella Typhimurium lacking the Znuabc transporter is attenuated and immunogenic in pigs | |
| KR102040665B1 (en) | Pharmaceutical composition containing attenuated streptococcus pneumoniae and uses thereof | |
| Gregory et al. | Detoxified endotoxin vaccine (J5dLPS/OMP) protects mice against lethal respiratory challenge with Francisella tularensis SchuS4 | |
| RU2623314C2 (en) | Assessment method for protective potency of pertussis vaccines | |
| Wang et al. | Evaluation of a Brucella melitensis mutant deficient in O-polysaccharide export system ATP-binding protein as a rough vaccine candidate | |
| Oremeyi et al. | Cellular and mucosal immune responses in the respiratory tract of Nigerian goats following intranasal administration of inactivated Recombinant Mannheimia hemolytica bacterine | |
| US11717566B2 (en) | Brucella canis vaccine for dogs | |
| Kramskaya et al. | Combined immunization with attenuated live influenza vaccine and chimeric pneumococcal recombinant protein improves the outcome of virus-bacterial infection in mice | |
| Mascart et al. | to pertussis and pertussis vaccines | |
| Kwon et al. | Immunogenicity and protective efficacy of RipA, a peptidoglycan hydrolase, against Mycobacterium tuberculosis Beijing outbreak strains |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |