RU2455024C1 - Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine - Google Patents
Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2455024C1 RU2455024C1 RU2010154228/10A RU2010154228A RU2455024C1 RU 2455024 C1 RU2455024 C1 RU 2455024C1 RU 2010154228/10 A RU2010154228/10 A RU 2010154228/10A RU 2010154228 A RU2010154228 A RU 2010154228A RU 2455024 C1 RU2455024 C1 RU 2455024C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pertussis
- bacteria
- dnt
- attenuated
- vaccine
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается аттенуированных бактерий В.pertussis, содержащих нокаутную мутацию в гене dnt и продуцирующих нетоксическую, иммунологически активную, токсоидную форму коклюшного токсина, их применению в качестве живой и инактивированной вакцин и вектора для поливалентной вакцины. Интраназальная иммунизация мышей живыми и инактивированными аттенуированными бактериями B.pertussis обеспечивает эффективную и пролонгированную защиту от заражения вирулентным штаммом возбудителя коклюша.The invention relates to biotechnology and medicine, and relates to attenuated B.pertussis bacteria containing a knockout mutation in the dnt gene and producing a non-toxic, immunologically active, toxoid form of pertussis toxin, their use as a live and inactivated vaccine and vector for a multivalent vaccine. Intranasal immunization of mice with live and inactivated, attenuated B.pertussis bacteria provides effective and prolonged protection against infection with a virulent strain of pertussis pathogen.
Уровень техникиState of the art
Вакцинация против коклюша в течение многих лет проводится коклюшной корпускулярной вакциной (ККВ). ККВ обеспечивает защиту от заболевания более 85% привитых детей. Тем не менее, из-за возникающих разнообразных побочных реакций после вакцинации в ряде развитых стран, а также у нас в стране, наблюдалось снижение охвата детского населения прививками. Как следствие, увеличилась заболеваемость не только новорожденных детей, но и детей школьного возраста и взрослых, особенно, находящихся в контакте с детьми в организованных коллективах [Centers for Disease Control and Prevention. Pertussis United States, 1997-2000. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2002, 51:73-76].Vaccination against pertussis has been carried out for many years with pertussis corpuscular vaccine (CCV). CCV provides protection against disease in more than 85% of vaccinated children. Nevertheless, due to a variety of adverse reactions after vaccination in a number of developed countries, as well as in our country, there has been a decrease in vaccination coverage for children. As a result, the incidence of not only newborn children, but also school children and adults, especially those in contact with children in organized groups [Centers for Disease Control and Prevention. Pertussis United States, 1997-2000. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2002, 51: 73-76].
Детальное изучение иммунобиологических свойств возбудителя коклюша позволило установить роль конкретных факторов вирулентности в патогенезе заболевания, формировании иммунного ответа и разработать менее реактогенные бесклеточные коклюшные вакцины (БКВ). Показано, что ведущим фактором, определяющим патогенез, клинику заболевания и обеспечивающим формирование иммунитета, является коклюшный токсин (КТ).A detailed study of the immunobiological properties of the pertussis pathogen made it possible to establish the role of specific virulence factors in the pathogenesis of the disease, the formation of the immune response and to develop less reactogenic acellular pertussis vaccines (BAC). It has been shown that pertussis toxin (CT) is the leading factor determining the pathogenesis, clinic of the disease and ensuring the formation of immunity.
Используемые в настоящее время бесклеточные KB значительно различаются по составу антигенов коклюшного микроба, методам их очистки и обезвреживания KT [Mooi, F.R., I.H. van Loo, A.J.King. Emerg. Infect. Dis. 2001, 7:.526-28]. При производстве БКВ используются трудоемкие и дорогостоящие технологические операции, а их хранение требует специальных условий. Несмотря на то, что бесклеточные KB, по сравнению с ККВ, обладают более низкой реактогенностью, отмечены случаи неврологических осложнений и смертей новорожденных, связанные с вакцинацией БКВ [Чупринина Р.П., Озерецковский Н.А., Алексеева И.А., 2001, 3:19-22]. Эффективность поликомпонентных БКВ и высокий стабильный уровень защитной активности ККВ подтверждает важную роль в защите против коклюша белков, связанных с наружной мембраной клетки, в частности филаментозного гемагглютинина, пертактина, агглютиногенов 2 и 3.Currently used cell-free KB vary significantly in the composition of pertussis microbial antigens, methods for their purification and neutralization of KT [Mooi, F.R., I.H. van Loo, A.J. King. Emerg. Infect. Dis. 2001, 7: .526-28]. In the production of BKV, labor-intensive and expensive technological operations are used, and their storage requires special conditions. Despite the fact that cell-free KB, in comparison with CCV, has a lower reactogenicity, there have been cases of neurological complications and deaths of newborns associated with vaccination of CCV [Chuprinina RP, Ozeretskovsky NA, Alekseeva IA, 2001 , 3: 19-22]. The effectiveness of multicomponent BKV and a high stable level of protective activity of KKV confirms an important role in the protection against pertussis of proteins associated with the outer membrane of the cell, in particular filamentous hemagglutinin, pertactin,
Опыт применения моно- и поликомпонентных БКВ показал, что их низкая реактогенность обусловлена, в частности, практически полным отсутствием в препаратах термолабильного или дермонекротического эндотоксина (ДНТ). Этот факт позволяет предположить, что бактерии, не продуцирующие эндотоксин, наиболее перспективны для производства безвредных вакцин, интраназальное введение которых будет нивелировать и отрицательный эффект липополисахарида. Наблюдения за профилактической эффективностью противококлюшных вакцин в течение последних 20 лет свидетельствуют о том, что иммунитет после вакцинации БКВ сохраняется не более 4-х лет, после иммунизации ККВ 5-6 лет, а после перенесенного заболевания продолжительность напряженного иммунитета достигает 10 лет [Guiso.N, Njamkepo Е., Vié Ie Sage.F, et al. Vaccine. 2007, 25:1390-13907; Mattoo S., James D. Clinical Microbiology Reviews. 2005, 18:326-382; Purdy K..W, Hay J..W, Botteman M..F, Ward J..I. Clin Infect Dis. 2004, 39:29-30].The experience of using mono- and multicomponent BKV has shown that their low reactogenicity is due, in particular, to the almost complete absence of thermolabile or dermonecrotic endotoxin (DNT) in the preparations. This fact suggests that bacteria that do not produce endotoxin are most promising for the production of harmless vaccines, the intranasal administration of which will neutralize the negative effect of lipopolysaccharide. Observations of the prophylactic efficacy of pertussis vaccines over the past 20 years suggest that immunity after vaccination with BKV lasts no more than 4 years, after immunization with
Таким образом, максимальная длительность и напряженность иммунитета, скорее всего, могут быть обеспечены в результате использования для массовой вакцинации (ревакцинации) детей и взрослых живой вакцины интраназального применения, созданной на основе полноценных аттенуированных бактерий В.pertussis. Возможность разработки такой вакцины продемонстрирована в ряде исследований [Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. PLoS Pathogens. 2006, 2:0662-70; Stevenson A, Roberts M. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003, 37:121-128]. Показано также, что бактерии В.pertussis могут быть использованы в качестве вектора для конструирования поливалентных живых вакцин, предназначенных для интраназальной иммунизации. Интраназальная иммунизация животных бактериями, продуцирующими гетерологичные антигены, сопровождается выработкой IgG и IgA как против филаментозного гемагглютинина B.pertussis, так и против слитых с ним гетерологичных антигенов. При этом антитела обнаруживаются не только в сыворотке крови, но и в выделениях генитального тракта мышей [Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. PLoS Pathogens. 2006, 2:0662-70; Stevenson A., Roberts M. FEMS Immunol. Med.Microbiol. 2003, 37:121-128].Thus, the maximum duration and intensity of immunity can most likely be ensured as a result of the use of a live vaccine of intranasal use, created on the basis of complete attenuated B.pertussis bacteria, for mass vaccination (revaccination) of children and adults. The possibility of developing such a vaccine has been demonstrated in a number of studies [Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. Plos pathogens. 2006, 2: 0662-70; Stevenson A, Roberts M. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003, 37: 121-128]. It was also shown that B.pertussis bacteria can be used as a vector for the construction of multivalent live vaccines intended for intranasal immunization. Intranasal immunization of animals with bacteria that produce heterologous antigens is accompanied by the production of IgG and IgA both against filamentous hemagglutinin B.pertussis and against heterologous antigens fused with it. In this case, antibodies are found not only in the blood serum, but also in the secretions of the genital tract of mice [Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. Plos pathogens. 2006, 2: 0662-70; Stevenson A., Roberts M. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003, 37: 121-128].
Направленная аттенуация бактерий B.pertussis путем конструирования мутантов B.pertussis, продуцирующих токсоид КТ, описана ранее [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Однако одним из существенных недостатков указанного аттенуированного штамма является способность продуцировать дермонекротический токсин, кодируемый геном dnt, являющийся одним из факторов патогенности бактерий рода Bordetella, определяющим реактогенность вакцины. Как отмечено выше, дермонекротический токсин, кодируемый последовательностью хромосомы dnt, является второй важной мишенью для снижения токсичности бактерий рода Bordetella. Гены dnt присутствуют в хромосомах практически всех представителей рода Bordetella и почти не отличаются друг от друга [Kashimoto Т., Katahira J., Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Parkhill J., Sebaihia M., Preston A. et al. Nat. Genet. 2003, 35:32-4; Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71; Schmidt G., U.M. Goehring, J. Schirmer, et al. J. Bio Chem. 1999, 274:31875-3188]. Исключение составляют некоторые штаммы, так называемого комплекса IV В. bronchiseptica, выделенные от людей и утратившие ген dnt [Diavatopoulos D.A., Craig A. et al. PLOS Pathogens. 2005, 1:373-383]. Синтез ДНТ находится под контролем bvg-локуса. Bvg- клетки B.pertussis не продуцируют ДНТ [Stibitz S., Miller J.F. In V.L.Miller, J.B.Kaper, D.A.Portney, R.R.Isberg (ed.), Molecular genetics of bacterial pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1994, 407-422]. Нет данных, указывающих на участие ДНТ в формировании иммунного ответа. Дермонекротический, термолабильный или летальный мышиный токсин представляет собой белковую молекулу, состоящую из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 140 кДа. ДНТ является эндотоксином, локализован в цитоплазме и клеточной стенке бактерий, инактивируется нагреванием при 56°С [Horiguchi Y, Nakai Т, Kume К.. Infect. Immun. 1991, 59: 1112-1116; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J.Cell Sci. 1995, 108:3243-51; Kashimoto Т, Katahira J, Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71]. При внутрикожном введении животным ДНТ вызывает некрозы. После внутривенного и внутрибрюшинного введения животным ДНТ наблюдаются значительные некрозы, кровоизлияния, отеки и дегенеративные изменения в печени, почках, селезенке. Сообщалось, что ДНТ ингибирует активность щелочной фосфатазы и уменьшает накопление коллагена 1 типа в остеобласто-подобных клетках. Предполагается, что ДНТ может влиять на способность клеток к дифференциации, стимулирует синтез ДНК и белка, что является следствием модификации GTF- связывающего белка RhoA эукариотических клеток [Horiguchi Y., Nakai Т., Kume К. Infect. Immun. 1991, 59:1112-1116; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J. Cell Sci. 1995, 108:3243-51]. Картирована область ферментативного центра и участка, ответственного за связывание ДНТ с рецептором эукариотической клетки [13, 20]. Роль ДНТ в патогенезе коклюша изучена недостаточно. Предполагается, что ДНТ принимает участие в приживлении и колонизации коклюшного микроба [Diavatopoulos D.A., Craig A. et al. PLOS Pathogens. 2005, 1:373-383; Horiguchi Y., Senda Т., Sugimoto N. et al. J. Cell Sci. 1995, 108:3243-51].The directed attenuation of B.pertussis bacteria by constructing B.pertussis mutants producing CT toxoid has been described previously [Sinyashina LN, Nechaeva EV, Amelina IP, Karataev GI, ZhMEI, 2009]. However, one of the significant disadvantages of this attenuated strain is the ability to produce a dermonecrotic toxin encoded by the dnt gene, which is one of the pathogenicity factors of bacteria of the genus Bordetella that determines the reactogenicity of the vaccine. As noted above, the dermonecrotic toxin encoded by the dnt chromosome sequence is the second important target for reducing the toxicity of Bordetella bacteria. Dnt genes are present on the chromosomes of almost all representatives of the genus Bordetella and almost do not differ from each other [Kashimoto T., Katahira J., Cornejo WR et al. Infect Immun. 1999, 67: 3727-32; Parkhill J., Sebaihia M., Preston A. et al. Nat. Genet. 2003, 35: 32-4; Pullinger GD, Adams T.E., Mullan PB et al. Infect Immun. 1996, 64: 4163-71; Schmidt G., UM Goehring, J. Schirmer, et al. J. Bio Chem. 1999, 274: 31875-3188]. The exception is some strains, the so-called complex of B. IV bronchiseptica, isolated from humans and have lost the dnt gene [Diavatopoulos DA, Craig A. et al. PLOS Pathogens. 2005, 1: 373-383]. The synthesis of DNT is controlled by the bvg locus. Bvg - B.pertussis cells do not produce DNT [Stibitz S., Miller JF In VLMiller, JBKaper, DAPortney, RRIsberg (ed.), Molecular genetics of bacterial pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, DC, 1994, 407-422]. There is no data indicating the involvement of DNT in the formation of the immune response. A dermonecrotic, thermolabile, or lethal mouse toxin is a protein molecule consisting of a single polypeptide chain with a molecular weight of 140 kDa. DNT is an endotoxin, localized in the cytoplasm and cell wall of bacteria, inactivated by heating at 56 ° C [Horiguchi Y, Nakai T, Kume K. .. Infect. Immun. 1991, 59: 1112-1116; Horiguchi Y., Senda T., Sugimoto N. et al. J. Cell Sci. 1995, 108: 3243-51; Kashimoto T, Katahira J, Cornejo WR et al. Infect Immun. 1999, 67: 3727-32; Pullinger GD, Adams T.E., Mullan PB et al. Infect Immun. 1996, 64: 4163-71]. When administered intradermally to animals, DNT causes necrosis. After intravenous and intraperitoneal administration of DNT to animals, significant necrosis, hemorrhage, edema and degenerative changes in the liver, kidneys, and spleen are observed. It has been reported that DNT inhibits alkaline phosphatase activity and reduces the accumulation of
Известен аттенуированный штамм Bordetella pertussis, содержащий мутацию в гене ptx, делецию гена dnt и гетерологичный ген ampG, продукт которого значительно снижает количество трахеального цитотоксина (WO/2007/104451). В экспериментах на новорожденных мышах показано, что штамм способен индуцировать иммунный ответ у лабораторных животных. Однако защитные свойства аттенуированного тройного мутанта Bordetella pertussis оценивались по способности бактерий вирулентного штамма размножаться в носоглотке и легких мышей после их интраназальной вакцинации аттенуированными бактериями, что не соответствует тесту, рекомендованному Всемирной Организацией здравоохранения и используемому в большинстве стран, включая Россию, для оценки протективности коклюшной вакцины. Несоответствие условий анализа протективности международным стандартам (в значительной степени заниженные дозы заражения бактериями вирулентного штамма, способ заражения и метод оценки протективности) не позволяют оценить пригодность известного аттенуированного тройного мутанта Bordetella в качестве кандидата живой вакцины.An attenuated Bordetella pertussis strain is known that contains a mutation in the ptx gene, a deletion of the dnt gene, and a heterologous ampG gene, the product of which significantly reduces the amount of tracheal cytotoxin (WO / 2007/104451). In experiments on newborn mice, it was shown that the strain is able to induce an immune response in laboratory animals. However, the protective properties of the attenuated triple mutant Bordetella pertussis were evaluated by the ability of the bacteria of the virulent strain to multiply in the nasopharynx and lungs of mice after their intranasal vaccination with attenuated bacteria, which does not correspond to the test recommended by the World Health Organization and used in most countries, including Russia, to evaluate the pertussis vaccine efficacy . Inconsistency of the conditions of the analysis of protectiveness with international standards (significantly reduced doses of infection with bacteria of the virulent strain, the method of infection and the method of evaluating the protectiveness) do not allow us to assess the suitability of the known attenuated triple mutant Bordetella as a candidate for a live vaccine.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Авторами настоящего изобретения впервые предложен штамм аттенуированных бактерий B.pertussis, не проявляющих активности дермонекротического токсина и продуцирующих генетически измененную иммунологически активную нетоксичную, токсоидную форму коклюшного токсина, способный обеспечивать при интраназальном способе вакцинации эффективный иммунитет против вирулентного штамма бактерий B.pertussis.The authors of the present invention for the first time proposed a strain of attenuated B.pertussis bacteria that do not exhibit dermonecrotic toxin activity and produce a genetically modified immunologically active non-toxic, toxoid form of pertussis toxin that can provide effective immunity against a virulent B.pertussis bacterial strain with the intranasal method of vaccination.
Другой аспект изобретения касается живой вакцины против возбудителя коклюша B.pertusis на основе аттенуированного двойного мутанта B.pertusis KS. Еще один аспект изобретения касается инактивированной цельноклеточной (корпускулярной) вакцины на основе аттенуированного штамма, содержащего мутантные гены ptx и dnt.Another aspect of the invention relates to a live vaccine against pertussis pathogen B.pertusis based on the attenuated double mutant B.pertusis KS. Another aspect of the invention relates to an inactivated whole-cell (corpuscular) vaccine based on an attenuated strain containing mutant ptx and dnt genes.
Еще один аспект изобретения касается использования аттенуированного штамма Bordetella в качестве вектора при создании поливалентной вакцины для профилактики или лечения инфекций, вызываемых различными патогенами, в частности возбудителем туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis).Another aspect of the invention relates to the use of an attenuated Bordetella strain as a vector in the development of a multivalent vaccine for the prevention or treatment of infections caused by various pathogens, in particular tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis).
В еще одном аспекте изобретение обеспечивает штамм аттенуированных бактерий В.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, деропонированный в Коллекции штаммов бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» № 171/331 B.p KS-4.In yet another aspect, the invention provides a strain of attenuated B.pertussis bacteria containing mutant ptx and dnt genes, which is deproned in the Collection of bacterial strains of the Federal State Budgetary Institution Scientific Institute of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamalei of the Ministry of Health and Social Development Of the Russian Federation ”No. 171/331 Bp KS-4.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг.1а. Схема конструирования и структура рекомбинантной плазмиды pKS1.Figa. The design scheme and structure of the recombinant plasmid pKS1.
Стрелками обозначены последовательности генов в составе рекомбинантных плазмид: cat - серая, dnt - черная, bla - незакрашенная, tet - косая штриховка. Ломаными линиями обозначены положения праймеров Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg), Др (Tcg ttc aac аса tcc aag gc), использованных для амплификации и клонирования фрагмента последовательности гена dnt и идентификации последовательности гена cad в составе рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3 и хромосомы рекомбинанта KS B.pertussis, содержащей мутантный ген dnt.The arrows indicate the sequence of genes in the composition of recombinant plasmids: cat - gray, dnt - black, bla - unpainted, tet - oblique hatching. The broken lines denote the positions of the primers Df (Cga tat tcc agt cgt tcg tg), Dp (Tcg ttc aac asa tcc aag gc) used to amplify and clone a fragment of the dnt gene sequence and identify the cad gene sequence in recombinant pKS2 and pKS3 chromosome plasmids and recombinant KS B.pertussis containing the mutant dnt gene.
Фиг.1б. Схема конструирования и структура рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3.Fig.1b. Design scheme and structure of recombinant plasmids pKS2 and pKS3.
Стрелками обозначены последовательности генов в составе рекомбинантных плазмид: cat - серая, dnt - черная, bla - незакрашенная, tet - косая штриховка. Ломаными линиями обозначены положения праймеров Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg), Др (Tcg ttc aac аса tcc aag gc), использованных для амплификации и клонирования фрагмента последовательности гена dnt и идентификации последовательности гена cad в составе рекомбинантных плазмид pKS2 и pKS3 и хромосомы рекомбинанта KS B.pertussis, содержащей мутантный ген dnt.The arrows indicate the sequence of genes in the composition of recombinant plasmids: cat - gray, dnt - black, bla - unpainted, tet - oblique hatching. The broken lines denote the positions of the primers Df (Cga tat tcc agt cgt tcg tg), Dp (Tcg ttc aac asa tcc aag gc) used to amplify and clone a fragment of the dnt gene sequence and identify the cad gene sequence in recombinant pKS2 and pKS3 chromosome plasmids and recombinant KS B.pertussis containing the mutant dnt gene.
Фиг.2. Схема аллельного обмена между копиями фрагментов мутантных (плазмида и pKS3) и нативных (хромосома B.pertussis 5) последовательностей гена dnt. Структура фрагмента хромосомы KS B.pertussis, содержащего мутантный ген dnt.Figure 2. Allelic exchange pattern between copies of fragments of mutant (plasmid and pKS3) and native (
Ломаными линиями обозначены положения праймеров 
Фиг.3. Электрофорез продуктов ПЦР ДНК B.pertussis KS.Figure 3. Electrophoresis of PCR DNA products of B.pertussis KS.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Настоящее изобретение впервые обеспечивает аттенуированные бактерии B.pertussis, не проявляющие активности дермонекротического токсина, коклюшного токсина и общей токсической активности, но сохранивших способность связывания с рецепторами эукариотической клетки (мутацией не затронута область гена dnt, кодирующая участок связывания токсина с рецептором эукариотической клетки) и продуцирующих генетически измененную иммунологически активную нетоксичную, токсоидную форму коклюшного токсина (оперон ptx), причем аттенуированные двойные мутанты B.pertussis являются нереактогененными и обеспечивает эффективную защиту лабораторных животных, вакцинированных интраназально, против интрацеребральной инфекции вирулентным штаммом B.pertussis.The present invention for the first time provides attenuated B.pertussis bacteria that do not exhibit dermonecrotic toxin, pertussis toxin activity, and general toxic activity, but retain the ability to bind to eukaryotic cell receptors (the region of the dnt gene encoding the toxin binding site of the eukaryotic cell is not mutated) and producing genetically modified immunologically active non-toxic, toxoid form of pertussis toxin (ptx operon), with attenuated double mutans s are nereaktogenennymi B.pertussis and provides effective protection of laboratory animals vaccinated intranasally against intracerebral infections with virulent strain B.pertussis.
В одном из аспектов изобретение направлено на аттенуированные бактерии В.pertussis KS, несущие нокаутную мутацию в гене dnt, сконструированные на основе описанного ранее мутанта В.pertussis 5, продуцирующего токсоид КТ (Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009). Согласно современной классификации бактерии исходного вирулентного штамма В.pertussis 173 и мутанта В.pertussis 5 относятся к генотипу ptxS1A4, соответствующему генотипу большинства штаммов бактерий B.pertussis, используемых на протяжении последних 60 лет для производства противококлюшных вакцин в РФ и ряде зарубежных стран [Borisova. О; Kombarova S.Y.; Zakharova, N.S. et al. Clin vaccine Immunol. 2007; 14:234-238; Audrey J King, Tamara van Gorkom, Jeroen L.A.; Penningsye at al. BMC Genomics. 2010; 11:196]. В качестве бактерий используемых для конструирования двойных мутантов, содержащих описанные мутации в опероне ptx и гене dnt, могут быть использованы не только бактерии B.pertusis 173 и B.pertusis 5, имеющие генотип ptxS1A4, но и бактерии с другими генотипами, в частности ptxS1 A1, выделяемые от больных коклюшем в настоящее время.In one aspect, the invention is directed to attenuated B.pertussis KS bacteria carrying a knockout mutation in the dnt gene, constructed on the basis of the previously described
Согласно предложенному изобретению для мутагенеза была выбрана область гена dnt, кодирующая токсический центр белка. В отличие от описанной ранее делеции [Kashimoto Т., Katahira J. Cornejo W.R. et al. Infect Immun. 1999, 67:3727-32; Pullinger G.D., Adams Т.Е., Mullan P.B. et al. Infect Immun. 1996, 64:4163-71] используемая согласно изобретению инсерция последовательности гена cad в Tth1111 сайт гена dnt не затрагивает область гена, кодирующего участок связывания ДНТ с рецептором эукариотической клетки.According to the proposed invention, a region of the dnt gene encoding the toxic center of the protein was selected for mutagenesis. In contrast to the previously described deletion [Kashimoto T., Katahira J. Cornejo WR et al. Infect Immun. 1999, 67: 3727-32; Pullinger GD, Adams T.E. , Mullan PB et al. Infect Immun. 1996, 64: 4163-71] used according to the invention, the insertion of the cad gene sequence in the Tth1111 site of the dnt gene does not affect the region of the gene encoding the binding site of DNT to the eukaryotic cell receptor.
Конъюгативная плазмида pKS3, несущая фрагмент последовательности dnt, содержащий инсерцию гена cad и не реплицирующаяся в клетках микроорганизмов рода Bordetella, получена для конструирования аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, согласно изобретению (Фиг.1б, пример 2). Бактерии B.pertussis, содержащие мутации ptxS1 и нокаутную мутацию dnt в хромосоме, сконструированы в результате аллельного обмена между природной копией оперона dnt в составе хромосомы реципиента и мутантной копией в составе плазмиды pKS3 (фиг.2, пример 3). Плазмиду pKS3 передавали в бактерии B.pertussis в результате скрещивания S17 Е.coli/pKS3XKmRRifR и В. pertussis 5. Локализация инсерции последовательности в гене dnt подтверждена путем проведения ПЦР на ДНК хромосомы трансконъюганта с праймерами Дфв (Gct gct ggg caa tgt gtt cg) - Cp (Ctc aat gta cct ata acc aga. ccg ttc) (фиг.3, пример 3).The conjugative plasmid pKS3 carrying the fragment of the dnt sequence containing the insertion of the cad gene and not replicating in the cells of microorganisms of the genus Bordetella was obtained for constructing attenuated B.pertussis bacteria containing the mutant ptx and dnt genes according to the invention (Fig. 1b, example 2). Bacteria B.pertussis containing ptxS1 mutations and a knockout dnt mutation in the chromosome were constructed as a result of an allelic exchange between a natural copy of the dnt operon in the chromosome of the recipient and a mutant copy in the plasmid pKS3 (Fig. 2, example 3). Plasmid pKS3 was transferred to B.pertussis bacteria by crossing S17 of E. coli / pKS3XKm R Rif R and
Таким образом, в соответствии с изобретением сконструированы бактерии B.pertussis KS, содержащие мутантный оперон ptx, инсерцию гена kan, расположенную вблизи мутантного оперона в участке, не оказывающем влияния на экспрессию оперона ptx или транспорт субъединиц рекомбинантного белка через бактериальную стенку, и инактивированную инсерцией гена cad последовательность гена dnt.Thus, in accordance with the invention, B.pertussis KS bacteria are constructed containing the mutant ptx operon, the insertion of the kan gene located near the mutant operon in a region that does not affect the expression of the ptx operon or the transport of recombinant protein subunits through the bacterial wall, and the inactivation of the gene insertion cad dnt gene sequence.
В еще одном аспекте изобретение обеспечивает штамм аттенуированных бактерий B.pertussis, содержащих мутантные гены ptx и dnt, деропонированный в Коллекции штаммов бактерий Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» под № 171/331 B.p KS-4.In yet another aspect, the invention provides a strain of attenuated B.pertussis bacteria containing mutant ptx and dnt genes that is deproned in the Collection of bacteria strains of the Federal State Budgetary Institution Scientific Institute of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamalei of the Ministry of Health and Social Development Of the Russian Federation ”under No. 171/331 Bp KS-4.
Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого аттенуированными бактериями B.pertussis согласно изобретению, была оценена в экспериментах по определению степени лейкоцитоза и гистаминсенсибилизации у мышей и эффекта образования кластеров клеток СНО, результаты представлены в табл.1.The specific toxic activity of CT synthesized by attenuated B.pertussis bacteria according to the invention was evaluated in experiments to determine the degree of leukocytosis and histamine sensitization in mice and the effect of the formation of CHO cell clusters, the results are presented in Table 1.
Из данных, представленных в табл.1, видно, что количество КТ, продуцируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS, практически не отличается от количества КТ, продуцируемого бактериями вирулентного штамма B.pertussis 173. Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS согласно изобретению, напротив, значительно отличается от специфической токсической активности КТ, синтезируемого бактериями вирулентного штамма B.pertussis 173. Аттенуированные бактерии B.pertussis, синтезирующие мутантный КТ, вызывают более низкий лейкоцитоз (ЛСА 21×103 против 63×103), гистаминсенсибилизацию у мышей (ГСД50 2.4×109 против 6,9×103) и эффект образования кластеров клеток СНО при значительно большей концентрации токсоида, чем КТ, продуцируемый природными вирулентными бактериями (одинаковый кластер-эффект при концентрации токсина меньшей в 104 раз, чем токсоида).From the data presented in Table 1, it is seen that the amount of CT produced by the recombinant bacteria B.pertussis KS is practically the same as the amount of CT produced by the bacteria of the virulent B.pertussis strain 173. The specific toxic activity of CT synthesized by recombinant B.pertussis bacteria KS according to the invention, in contrast, is significantly different from the specific toxic activity of CT synthesized by the bacteria of the virulent strain B.pertussis 173. The attenuated B.pertussis bacteria synthesizing mutant CT cause no more mild leukocytosis (LSA 21 × 10 3 versus 63 × 10 3 ), histamine sensitization in mice (GDS 50 2.4 × 10 9 versus 6.9 × 10 3 ) and the effect of CHO cell clustering at a significantly higher concentration of toxoid than CT produced by natural virulent bacteria (the same cluster effect at a toxin concentration less than 10 4 times that of the toxoid).
Определение токсической активности ДНТ рекомбинантных клеток B.pertussis KS определяли в опытах на животных (морских свинках и мышах), результаты представлены в табл.2.Determination of the toxic activity of DNT of recombinant B.pertussis KS cells was determined in experiments on animals (guinea pigs and mice), the results are presented in table 2.
Данные, представленные в табл.2, демонстрируют, что аттенуированные рекомбинантные бактерии B.pertussis KS, в отличие от бактерий исходного вирулентного штамма 173 и бактерий B.pertussis 5, не вызывают гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах.The data presented in Table 2 demonstrate that the attenuated recombinant bacteria B.pertussis KS, in contrast to the bacteria of the initial virulent strain 173 and
Общую токсичность аттенуированных бактерий B.pertussis KS согласно изобретению, характеризующую действие на организм мышей всех токсинов возбудителя коклюша, в том числе и цитотоксина, определяли в соответствии с требованиями РФ после введения инактивированной прогреванием бактериальной суспензии лабораторным мышам внутрибрюшинно [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. Результаты теста изменения массы тела мышей (табл.3) показали, что в отличие от инактивированных бактерий вирулентного штамма B.pertussis 173, живые аттенуированные бактерии B.pertussis KS при внутрибрюшинном введении 10 МОЕ (Международный оптический стандарт микробных клеток, 1 МОЕ соответствует 1 миллиарду микробных клеток) в 0,5 мл 0,85% раствора хлорида натрия проявляли низкую токсичность.The general toxicity of the attenuated B.pertussis KS bacteria according to the invention, which characterizes the effect on mice of all toxins of the pertussis pathogen, including cytotoxin, was determined in accordance with the requirements of the Russian Federation after administration of bacterial suspension inactivated by heating the bacterial suspension intraperitoneally [Instructions for selection, verification and storage B.pertussis strains for the manufacture of pertussis vaccine and the pertussis component of associated vaccines. 1987, Moscow]. The results of the mouse body mass change test (Table 3) showed that, in contrast to inactivated bacteria of the virulent strain B.pertussis 173, live attenuated bacteria B.pertussis KS with an intraperitoneal injection of 10 MOU (International Optical Standard for Microbial Cells, 1 MOE corresponds to 1 billion microbial cells) in 0.5 ml of a 0.85% sodium chloride solution showed low toxicity.
Защитные свойства бактерий определяли по проценту выживаемости мышей при иммунизации их определенным количеством микробных клеток в соответствии с международными стандартами, принятыми в РФ [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов В.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва], результаты представлены в табл.4.The protective properties of bacteria were determined by the percentage of survival of mice when immunized with a certain number of microbial cells in accordance with international standards adopted in the Russian Federation [Instructions for the selection, verification and storage of B. pertussis strains for the manufacture of pertussis vaccine and pertussis component of associated vaccines. 1987, Moscow], the results are presented in table.4.
При интраназальной иммунизации мышам вводили от 4 до 500 млн живых микробных клеток в 25 мкл, однократно. Через 14 дней после иммунизации мышей заражали интрацеребрально высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323. В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3 (Отраслевой стандартный образец корпускулярной коклюшной вакцины, ГИСК им.Л.А.Тарасевича), который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве 10 МОЕ. После интрацеребрального заражения мышей высоковирулентным штаммом 18323 наблюдали защиту от гибели от 80 до 100% в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации.During intranasal immunization, mice were injected with 4 to 500 million live microbial cells in 25 μl, once. 14 days after immunization, the mice were infected with an intracerebrally highly virulent B.pertussis 18323 strain. As a positive control, the OSO-3 preparation (Sectoral standard sample of corpuscular pertussis vaccine, L.A. Tarasevich GISK) was used, which was administered to the mice intraperitoneally in the amount of 10 MOU . After intracerebral infection of mice with the highly virulent strain 18323, protection from death from 80 to 100% was observed depending on the number of bacteria used for vaccination.
Еще один аспект изобретения касается использования аттенуированных двойных мутантов B.pertusis KS в качестве живой вакцины против возбудителя коклюша B.pertusis. Вакцина согласно изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель, а также адъюванты, например двуокись алюминия. Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются, фосфатным буфером, дистиллированной водой, эмульсиями "масло в воде" и т.п. Предпочтительно вакцина согласно изобретению вводится интраназально в одной дозе.Another aspect of the invention relates to the use of attenuated double mutants of B.pertusis KS as a live vaccine against B. pertusis pertussis pathogen. The vaccine according to the invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient, as well as adjuvants, for example aluminum dioxide. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, phosphate buffer, distilled water, oil-in-water emulsions, and the like. Preferably, the vaccine according to the invention is administered intranasally in a single dose.
Еще один аспект изобретение касается инактивированной цельноклеточной вакцины на основе аттенуированных бактерий, содержащих мутантные гены ptx и dnt. Инактивация живых бактерий аттенуированного двойного мутанта B.pertusis KS производится с помощью обработки гексаметилентетрамином (ГМТА) в соответствии с описанным ранее методом (Авт. свид. №1497802). Токсическую активность определяли в опытах на мышах, морских свинках и кроликах, результаты экспериментов приведены в табл.4 и 5 (Пример 5). Данные, представленные в таблицах 4 и 5, демонстрируют, что корпускулярная вакцина, содержащая инактивированные аттенуированные рекомбинантные бактерии B.pertussis KS, не имеет специфической активности коклюшного и дермонекротического токсинов (уровень ЛСА и ГСА ниже, чем у ОСО-3), не вызывает гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах.Another aspect of the invention relates to an inactivated whole cell vaccine based on attenuated bacteria containing mutant ptx and dnt genes. The inactivation of living bacteria of the attenuated double mutant B.pertusis KS is performed by treatment with hexamethylenetetramine (HMTA) in accordance with the previously described method (Auth. Certificate. No. 1497802). Toxic activity was determined in experiments on mice, guinea pigs and rabbits, the experimental results are shown in tables 4 and 5 (Example 5). The data presented in tables 4 and 5 demonstrate that the corpuscular vaccine containing inactivated attenuated recombinant bacteria B.pertussis KS does not have specific activity of pertussis and dermonecrotic toxins (the level of LSA and HCA is lower than that of OCO-3), does not cause death mice with intraperitoneal administration of drugs and necrosis in a skin test in guinea pigs and rabbits.
Защитные свойства корпускулярной вакцины на основе инактивированных аттенуированных бактерий B.pertussis KS определяли при интрацеребральном заражении высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323 (табл.6, пример 5). В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем опытным образцам - 0,5; 0,1; 0,02×109 микробных клеток. После внутрибрюшинного введения животным инактивированных бактерий B.pertussis KS, в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали защиту мышей от 80 до 100% от последующего интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.The protective properties of the corpuscular vaccine based on inactivated attenuated bacteria B.pertussis KS were determined during intracerebral infection with a highly virulent B.pertussis 18323 strain (Table 6, example 5). As a positive control, the OSO-3 preparation was used, which was administered intraperitoneally to mice in an amount corresponding to the experimental samples — 0.5; 0.1; 0.02 × 10 9 microbial cells. After intraperitoneal administration of inactivated B.pertussis KS bacteria to animals, depending on the number of bacteria used for vaccination, protection of mice from 80 to 100% from subsequent intracerebral infection with virulent bacteria B.pertusis 18323 was observed.
Инактивированная цельноклеточная вакцина согласно изобретению может содержать перечисленные выше фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель, используемые для живой вакцины, а также адъюванты, например двуокись алюминия. Инактивированная цельноклеточная вакцина согласно изобретению вводится подкожно.The inactivated whole-cell vaccine according to the invention may contain the above pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient used for a live vaccine, as well as adjuvants, for example aluminum dioxide. The inactivated whole-cell vaccine according to the invention is administered subcutaneously.
В еще одном из аспектов изобретение обеспечивает поливалентную вакцину на основе аттенуированных двойных мутантов Bordetella pertussis в качестве вектора. Поливалентный вакцинный штамм В. pertussis продуцирует антигены возбудителя туберкулеза ESAT-6, CFP-10 и Ag85A (заявки на патент РФ 2010123879, 2010123883, 2010123865, соответственно) в составе слитого комплекса с адгезином FGA или/и автотранспортным белком BrkA возбудителя коклюша. Белки ESAT-6, CFP10 и Ag85A экспонированы на С-конце химерного белка, что обеспечивает их представление на поверхности бактерии-вектора и сохранение их иммуногенных свойств, и, как следствие, индукцию выработки специфических защитных антител против возбудителя коклюша и основных протективных антигенов возбудителя туберкулеза при интраназальном введении человеку.In yet another aspect, the invention provides a multivalent vaccine based on the attenuated double mutants of Bordetella pertussis as a vector. The multivalent vaccine strain B. pertussis produces antigens of the tuberculosis pathogen ESAT-6, CFP-10 and Ag85A (patent applications of the Russian Federation 2010123879, 2010123883, 2010123865, respectively) as part of a fusion complex with adhesion FGA and / or motor protein BrkA of the pertussis pathogen. The ESAT-6, CFP10, and Ag85A proteins are exposed at the C-terminus of the chimeric protein, which ensures their presentation on the surface of the vector bacterium and the preservation of their immunogenic properties, and, as a consequence, the induction of the production of specific protective antibodies against pertussis and the main protective antigens of the tuberculosis causative agent with intranasal administration to humans.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения объема притязаний.The invention is illustrated by the following examples presented to confirm, but not limit the scope of the claims.
Пример 1. Бактериальные штаммы E.coli, В.pertussis и условия их культивированияExample 1. Bacterial strains of E. coli, B.pertussis and conditions for their cultivation
Штаммы В. Pertussis 173 [Rifr, Серовар 1.2.3.7.13., ЛСА (40-50)], полученный из коллекция штаммов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, и B.pertussis 5 [Rifr, Kmr, Серовар 1.2.0.7.13; ЛСА 17-20 т., ptx(M)], а также бактерии B.pertussis KS [Rifr, Kmr, Cmr, DNT], полученные согласно изобретению, выращивались на среде Борде-Жангу с добавлением 10% дефибринированной крови барана и жидкой питательной среде типа Коен-Уиллер.Strains B. Pertussis 173 [Rif r , Serovar 1.2.3.7.13., LSA (40-50)], obtained from the collection of strains NIIEM them.N.F. Gamalei, and B.pertussis 5 [Rif r , Km r , Serovar 1.2.0.7.13; LSA 17-20 t., Ptx (M)], as well as the bacteria B.pertussis KS [Rif r , Km r , Cm r , DNT], obtained according to the invention, were grown on Borde-Zhangu medium with the addition of 10% defibrinated sheep blood and Koen-Wheeler type liquid culture media.
Штаммы E.coli S17-1 λpir [TprSmr recA, thi, pro, hsdR-M+ RP4:2-Tc:Mu::Km Tn7 λpir], E.coli Dh5 α [F, Ф80dА (lacZ)ml5, recAl, endAl, gyrA96, thi-1 hsdR17(rk--mk+), supE44, relAl, glnV44, deoR, Δ(lacZYA-argF)U169], E.coli Dh5 α CmrApr/pBScad, полученные из коллекции штаммов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, и штаммы E.coli Dh5α/pKS1, E.coli Dh5α/pKS2, E.coliS17-1 λpir)/pKnock-Tc и E.coli S17-1 λpir/pKS3, полученные согласно изобретению, выращивались в жидкой или на агаризованной среде «L», казеиновоугольном агаре (КУА). Антибиотики добавляли в концентрациях (мкг/мл): ампициллин - 100; канамицин - 25, рифампицин - 100, хлорамфеникол - 25, тетрациклин - 20.Strains E. coli S17-1 λpir [Tp r Sm r recA, thi, pro, hsdR-M + RP4: 2-Tc: Mu :: Km Tn7 λpir], E.coli Dh5 α [F, Ф80dА (lacZ) ml5 , recAl, endAl, gyrA96, thi-1 hsdR17 (r k- -m k + ), supE44, relAl, glnV44, deoR, Δ (lacZYA-argF) U169], E. coli Dh5 α Cm r Ap r / pBScad, obtained from the collection of strains NIIEM them. NF Gamalei, and strains of E. coli Dh5α / pKS1, E. coli Dh5α / pKS2, E. coliS17-1 λpir) / pKnock-Tc and E.coli S17-1 λpir / pKS3, obtained according to the invention, were grown in liquid or on agar medium “L”, casein-angular agar (AMC). Antibiotics were added in concentrations (μg / ml): ampicillin - 100; kanamycin - 25, rifampicin - 100, chloramphenicol - 25, tetracycline - 20.
Пример 2. Конструирование плазмиды для рекомбинационного обмена между копиями нативного и мутантного генов dntExample 2. Construction of a plasmid for recombination exchange between copies of the native and mutant dnt genes
Для конструирования плазмиды с целью рекомбинационного обмена между копиями нативного и мутантного генов dnt был использован конъюгативный вектор pKnock - Тс [Tet ori-R6K mob RP4], не способный реплицироваться в бактериях рода Bordetella [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Схема конструирования плазмиды pKS3 и ее структура представлены на фиг.1б. Плазмида pKSl [pGEM (dnt)], содержащая последовательность гена dnt, инактивированную инсерцией гена cad (Фиг.1а), получена в результате клонирования продукта ПЦР ДНК B.pertusis-5 с праймерами Дф (Cga tat tcc agt cgt tcg tg) и, Дp (Tcg ttc aac аса tcc aag gc) в вектор pGem (PromegaUSA) и последующей интеграции гена cad (фрагмента Acc1 плазмиды pBScad) в TthlllI сайт гена dnt (плазмида pKS2). Структура рекомбинантной плазмиды pKS2 представлена на Фиг.1б. Плазмида pKS3 получена в результате переклонирования (SaeII-NotI) фрагмента плазмиды pKS2 в соответствующие сайты плазмиды pKnock-Tc (фиг.1б). Структура рекомбинантных плазмид подтверждена с помощью рестрикционного анализа и ПЦР с использованием различных сочетаний праймеров 
Рестрикционный анализ, лигирование, электрофорез ДНК, клонирование последовательностей ДНК проводили в соответствии с методическим руководством Маниатиса с соавт. [Маниатис Т., Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 1984]. Выделение ДНК плазмид, хромосомы и продуктов ПЦР из геля проводили с помощью систем Wizard Plus SV MiniPrepsDNA purification system (Promega США), Wizard Plus MiniPrepsDNA purification system (Promega США) и Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе «Терцик» (Россия) при использовании праймеров, синтезированных АО "Синтол".Restriction analysis, ligation, DNA electrophoresis, cloning of DNA sequences was carried out in accordance with the manual of Maniatis et al. [Maniatis T., E. Fritsch, J. Sambrook. Molecular Cloning World, Moscow, 1984]. DNA isolation of plasmids, chromosomes, and PCR products from the gel was performed using Wizard Plus SV MiniPrepsDNA purification system (Promega USA), Wizard Plus MiniPrepsDNA purification system (Promega USA) and Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega USA). The polymerase chain reaction (PCR) was performed on a Tertsik device (Russia) using primers synthesized by Syntol JSC.
Пример 3. Конструирование бактерий В.pertussis SK, содержащих мутантный ген dnt в составе хромосомыExample 3. Construction of bacteria B.pertussis SK containing mutant dnt gene in the chromosome
Трансформацию клеток E.coli ДНК плазмид и лигированной смесью проводили в соответствии с методическим руководством Маниатиса с соавт. [Маниатис Т., Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 1984]. Скрещивание между бактериями E.coli S17 и В.pertussis проводили в соответствии с методическим руководством Миллера [Миллер Дж. В. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир, Москва, 1984. 436]. В качестве реципиента для конструирования аттенуированных бактерий использовался охарактеризованный ранее KmRRifR штамм В.pertussis 5, содержащий мутацию в гене ptx.Transformation of E. coli cells with plasmid DNA and the ligation mixture was carried out in accordance with the manual of Maniatis et al. [Maniatis T., E. Fritsch, J. Sambrook. Molecular Cloning World, Moscow, 1984]. The crossing between the bacteria E. coli S17 and B.pertussis was carried out in accordance with the methodological guidelines of Miller [Miller JV Experiments in molecular genetics. Mir, Moscow, 1984. 436]. As a recipient for the construction of attenuated bacteria, the
Бактерии В.pertussis, содержащие мутации ptxS1 и нокаутную мутацию dnt в хромосоме, сконструированы в результате аллельного обмена между природной копией оперона dnt в составе хромосомы реципиента и мутантной копией в составе плазмиды pKS3 (фиг.2). Плазмиду pKS3 передавали в бактерии В.pertussis в результате скрещивания S17 E.coli/pKS3XKmRRifR и В.pertussis 5. После трехкратной расчистки на среде КУА с хлорамфениколом бактерии проверяли по маркерам антибиотикоустойчивости, наличию плазмидной ДНК и последовательностей генов kan, cad и dnt в ПЦР с праймерами 
Для подтверждения локализации инсерции последовательности в гене dnt проведена ПЦР на ДНК хромосомы трансконъюганта с праймерами Дфв-Ср (фиг.3). Так как праймер Дфв (Ccg caa tgg gcc gag ctg tt) расположен за пределами фрагмента dnt, клонированного в составе плазмиды pKS3, то в результате ПЦР с праймерами Дфв-Ср образуется специфический продукт размером 870 п.о. только при наличии инсерции последовательности cad в сайт TthlllI последовательности dnt. Специфичность полученных продуктов подтверждена результатами рестрикции эндонуклеазами АсcI и SalGI. Определение последовательности гeнa ptxS1 в составе хромосомы аттенуированных бактерий B.pertussis KS подтвердило наличие замен Arg9-Lys9 и Glul29-Glyl29 в области, кодирующей ферментативный центр КТ.To confirm the localization of the insertion of the sequence in the dnt gene, PCR was performed on the DNA of the transconjugant chromosome with primers Dfv-Cp (Fig.3). Since the Dfv primer (Ccg caa tgg gcc gag ctg tt) is located outside the dnt fragment cloned in the pKS3 plasmid, a specific product of 870 bp is formed as a result of PCR with Dfv-Cp primers. only if there is an insertion of the cad sequence into the TthlllI site of the dnt sequence. The specificity of the products obtained is confirmed by the results of restriction with endonuclease AccI and SalGI. The determination of the ptxS1 gene sequence in the chromosome of the attenuated bacteria B.pertussis KS confirmed the presence of substitutions Arg9-Lys9 and Glul29-Glyl29 in the region encoding the enzymatic center of CT.
Таким образом, в соответствии с изобретением сконструированы бактерии B.pertussis KS, содержащие мутантный оперон ptx, инсерцию гена kan, расположенную вблизи мутантного оперона в участке, не оказывающем влияния на экспрессию оперона ptx или транспорт субъединиц рекомбинантного белка через бактериальную стенку [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009], и инактивированную инсерцией гена cad последовательность гена dnt.Thus, in accordance with the invention, B.pertussis KS bacteria were constructed containing the mutant ptx operon, the insertion of the kan gene located near the mutant operon in a region that does not affect the expression of the ptx operon or the transport of recombinant protein subunits through the bacterial wall [Sinyashina L.N ., Nechaeva EV, Amelina IP, Karataev GI, ZhMEI, 2009], and the dnt gene sequence inactivated by cad gene insertion.
Пример 4. Иммунобиологические свойства аттенуированных бактерий B.pertussis KSExample 4. Immunobiological properties of attenuated bacteria B.pertussis KS
Лейкоцитозстимулирующую (ЛСА) и гистаминсенсибилизирующую (ГСА) активности КТ, а также количество КТ определяли в соответствии с известными методами [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва; Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009]. Из данных, представленных в табл.1 видно, что количество КТ, продуцируемого рекомбинантными бактериями B.pertussis KS, практически не отличается от количества КТ, продуцируемого исходными вирулентными бактериями. Специфическая токсическая активность КТ, синтезируемого аттенуированными рекомбинантными бактериями B.pertussis и бактериями вирулентного штамма, напротив, значительно отличается. Аттенуированные бактерии B.pertussis, синтезирующие мутантный КТ, вызывают более низкий лейкоцитоз, гистаминсенсибилизацию у мышей и эффект образования кластеров клеток СНО при значительно большей концентрации токсоида, чем природного КТ. В таблице 1 снижение токсичности КТ приведено в процентах. Эти цифры отображают отношение концентрации природного токсина к мутантному, при добавлении которых к культуральной среде наблюдается одинаковый кластер - эффект монослоя клеток СНО. Значения измеренных параметров практически не отличаются у одиночных и двойных мутантов и близки к специфической активности токсоида, определенной ранее [Синяшина Л.Н., Нечаева Е.В., Амелина И.П., Каратаев Г.И., ЖМЭИ, 2009; Pizza M., Covacci A., Bartoloni A., et al. Science, 1989, 246: 497-500].Leukocytosis-stimulating (LSA) and histamine-sensitizing (GAA) CT activity, as well as the amount of CT were determined in accordance with known methods [Instructions for the selection, verification and storage of B.pertussis strains for the manufacture of pertussis vaccine and pertussis component of associated vaccines. 1987, Moscow; Sinyashina L.N., Nechaeva E.V., Amelina I.P., Karataev G.I., ZhMEI, 2009]. From the data presented in Table 1, it is seen that the amount of CT produced by recombinant bacteria B.pertussis KS is practically the same as the amount of CT produced by the original virulent bacteria. The specific toxic activity of CT synthesized by attenuated recombinant bacteria B.pertussis and bacteria of the virulent strain, in contrast, is significantly different. The attenuated B.pertussis bacteria synthesizing mutant CT cause lower leukocytosis, histamine sensitization in mice and the effect of CHO cell clustering at a significantly higher concentration of toxoid than natural CT. Table 1 shows the reduction in CT toxicity as a percentage. These figures reflect the ratio of the concentration of natural toxin to the mutant, when added to the culture medium, the same cluster is observed - the effect of a monolayer of CHO cells. The values of the measured parameters practically do not differ in single and double mutants and are close to the specific activity of the toxoid determined earlier [Sinyashina LN, Nechaeva EV, Amelina IP, Karataev GI, ZhMEI, 2009; Pizza M., Covacci A., Bartoloni A., et al. Science, 1989, 246: 497-500].
Токсическую активность ДНТ рекомбинантных клеток определяли в опытах на животных (кроликах, морских свинках и мышах). Кроликам весом 1,5-2,0 кг и морским свинкам весом 300-350 г вводили внутрикожно 2.0 МОЕ, 1 МОЕ и 0,5 МОЕ живых микробных клеток в логарифмической фазе в объеме 0,2 мл. Контроль - ОСО-5 (отраслевой стандартный образец. Тот же, что и ОСО-3, только живые бактерии). Некроз учитывали через 24 и 48 ч.The toxic activity of DNT recombinant cells was determined in experiments on animals (rabbits, guinea pigs and mice). Rabbits weighing 1.5-2.0 kg and guinea pigs weighing 300-350 g were injected intradermally with 2.0 MOU, 1 MOU, and 0.5 MOU of living microbial cells in a logarithmic phase in a volume of 0.2 ml. Control - OSO-5 (industry standard sample. The same as OSO-3, only live bacteria). Necrosis was taken into account after 24 and 48 hours.
При определении активности ДНТ в опытах на мышах определяли 50% летальную дозу [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. Животным весом 10-12 г вводили живые бактерии внутрибрюшинно в соответствующих разведениях. Результаты учитывали в течение 48 ч.When determining the activity of DNT in experiments in mice, a 50% lethal dose was determined [Instructions for the selection, verification and storage of B.pertussis strains for the manufacture of pertussis vaccine and the pertussis component of associated vaccines. 1987, Moscow]. Animals weighing 10-12 g were injected with live bacteria intraperitoneally in appropriate dilutions. The results were taken into account for 48 hours.
Для оценки остаточной токсичности аттенуированные бактерии B.pertussis KS выращивали на среде КУА в течение 36-48 ч, смывали 0.85% раствором хлорида натрия, концентрацию бактериальных клеток доводили до 50-60 МОЕ в 1 мл. Каждой мыши вводили внутрибрюшинно 10 МОЕ в объеме 0,5 мл. Контрольным животным вводили 0.5 мл 0.85% раствора хлорида натрия. За животными наблюдали в течение 7 суток. Массу мышей определяли через 72 ч и через 7 суток после введения. Абсолютный прирост массы тела мышей, которым ввели аттенуированные бактерии, на седьмые сутки был 100% и выше. Относительный прирост массы мышей по сравнению с контрольными мышами, которым вводили 0,85% раствор хлорида натрия, был более 80%. Через 72 ч масса мышей, которым вводили аттенуированные бактерии, была не ниже их массы до введения препарата и составляла 20% относительного прироста массы контрольных мышей.To assess residual toxicity, attenuated B.pertussis KS bacteria were grown on AMC medium for 36-48 h, washed off with a 0.85% sodium chloride solution, and the concentration of bacterial cells was brought to 50-60 MOU in 1 ml. Each mouse was injected intraperitoneally with 10 MOI in a volume of 0.5 ml. The control animals were injected with 0.5 ml of a 0.85% sodium chloride solution. The animals were observed for 7 days. The mass of mice was determined after 72 hours and 7 days after administration. The absolute increase in body weight of mice injected with attenuated bacteria was 100% and higher on the seventh day. The relative weight gain of mice compared to control mice that were injected with a 0.85% sodium chloride solution was more than 80%. After 72 hours, the mass of mice that were injected with attenuated bacteria was not lower than their mass before drug administration and amounted to 20% of the relative weight gain of the control mice.
Защитные свойства бактерий определяли по проценту выживаемости мышей при иммунизации их определенным количеством микробных клеток в соответствии с международными стандартами, принятыми в РФ [Инструкция по отбору, проверке и хранению штаммов B.pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин. 1987, Москва]. При интраназальной иммунизации мышам вводили от 4 до 500 млн живых микробных клеток в 25 мкл, однократно. Через 14 дней после иммунизации мышей заражали интрацеребрально высоковирулентным штаммом B.pertussis 18323. В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО 3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем 1000 млн микробных клеток. После внутрибрюшинного и интраназального введения животным живых бактерий B.pertussis 5 и KS, в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали от 80 до 100% их защиту от интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.The protective properties of bacteria were determined by the percentage of survival of mice when immunized with a certain number of microbial cells in accordance with international standards adopted in the Russian Federation [Instructions for the selection, verification and storage of B.pertussis strains for the manufacture of pertussis vaccine and pertussis component of associated vaccines. 1987, Moscow]. During intranasal immunization, mice were injected with 4 to 500 million live microbial cells in 25 μl, once. 14 days after immunization, the mice were infected with an intracerebrally highly virulent B.pertussis 18323 strain. An
Стабильность структуры генома и свойств рекомбинантных бактерий B.pertussis KS определяли после 15 пассажей на среде КУА, лиофильного высушивания в сахарозо-желатинозной среде и хранения при 4°С (срок наблюдения более 1 года), а также после высева бактерий из легочной ткани мышей, инфицированных живыми аттенуированными бактериями. Для изучения приживаемости штаммов и развития инфекционного процесса суспензии микробных клеток в концентрации 1×109 в казеиновом гидролизате рН 7.0 вводили в каждую ноздрю мыши в объеме 0.3 мл, параллельно в том же объеме вводили внутривенно. Через 72 ч проверяли ЛСА и проводили посевы из легких. В посевах из легких мышей на среде КУА с кровью через 3 и 6 дней после их заражения не регистрировали бактериальных колоний. В группе мышей, зараженных внутривенно вирулентным штаммом B.pertussis 173, наблюдали высокий лейкоцитоз (около 100000), тогда как у мышей, зараженных аттенуированными бактериями, значение ЛСА находилось в пределах 17.000-23.000 лейкоцитов/мл, что соответствует ЛСА при иммунизации мышей коммерческой ККВ. ЛСА исходных и мутантных бактерий B.pertussis при интраназальном введении микробных клеток не превышал 10-15000. К 8-му дню после интраназального введения микробной суспензии исходного штамма и мутантных бактерий B.pertussis KS и 5 число выросших колоний при посеве гомогената легких мышей достигало 150-200, в то время как после внутривенного введения мышам бактерий B.pertussis KS и 5 высевалось не более 40 колоний. При внутривенном заражении бактериями исходного штамма и посеве на среду КУА гомогената из легких мышей роста отдельных колоний не наблюдали. К 14-му дню после заражения количество колоний при посеве гомогената легких мышей, зараженных интраназально бактериями B.pertussis 173 и мутантами B.pertussis 5 и B.pertussis KS, достигало 3×103, 104 и 3×104, соответственно, и продолжало сохраняться в таком количестве до конца третьей недели после заражения. Различия между числом бактерий дикого штамма и двойного мутанта B.pertussis KS - статистически значимы (Р=0,95). К концу четвертой недели после интраназального и внутривенного заражения животных исходными и аттенурованными бактериями B.pertussis в высевах гомогената легких мышей не выявили бактериальных колоний на индикаторных чашках. Отдельные колонии аттенуированных бактерий B.pertussis KS, выросших на индикаторных чашках после посева гомогенатов легких мышей на четвертой неделе инфекции, перепечатывали на селективные чашки, содержащие антибиотики канамицин и хлорамфеникол и определяли стабильность маркеров в процессе размножения бактерий в организме животных. Все 100 проверенных колоний сохраняли оба маркера устойчивости к антибиотикам. Три отдельные колонии были размножены на среде КУА и использованы для проверки ЛСА и дермонекротической активности. Аналогичные исследования выполнены с бактериями B.pertussis KS после 15 пассажей на среде КУА и лиофильного высушивания штаммов в сахарозо-желатинозной среде и хранении при 4°С в течение не менее 12 месяцев. Показано, что бактерии, выделенные из легких спустя три недели после инфицирования мышей, бактерии после пассажей на искусственной питательной среде КУА и бактерии, прошедшие процедуру лиофилизации, не имеют дермонекротической активности и проявляют ЛСА в пределах, зарегистрированных у бактерий B.pertussis KS до пассажа в организме животных и лиофильного высушивания.The stability of the genome structure and the properties of recombinant bacteria B.pertussis KS was determined after 15 passages on KUA, freeze drying in sucrose-gelatinous medium and storage at 4 ° C (observation period of more than 1 year), as well as after seeding of bacteria from the lung tissue of mice, infected with live attenuated bacteria. To study the survival of strains and the development of the infectious process, a suspension of microbial cells at a concentration of 1 × 10 9 in a casein hydrolyzate was administered with a pH of 7.0 in each nostril of the mouse in a volume of 0.3 ml, and simultaneously in the same volume was administered intravenously. After 72 hours, LSA was checked and lung cultures were performed. Bacterial colonies were not recorded in cultures of lung mice on AMC with
Параллельно с высевом на селективную среду гомогената легких мышей, зараженных интраназально, препараты ДНК анализировали с помощью ПЦР на праймерах, специфичных для последовательностей генов ptx, kan, cad и инактивированной последовательности гена dnt. Результаты ПЦР не выявили ДНК бактерий дикого типа в легких мышей уже на пятой недели после заражения. Результаты ПЦР подтвердили, что все тестированные последовательности присутствовали в гомогенатах, выделенных от животных, инфицированных аттенуированными бактериями B.pertussis KS и B.pertussis 5 на протяжении 4-х недель, в течение которых удавалось выделять бактерии B.pertussis из легких инфицированных животных, и далее вплоть до десятой недели. Результаты ПЦР разведения ДНК возбудителя коклюша из препаратов, выделенных в конце 10-й недели, выявили значимые различия в количестве ДНК бактерий B.pertussis KS и B.pertussis 5. В легких мышей, зараженных бактериями двойного мутанта B.pertussis KS, обнаружено в 5-10 раз больше ДНК возбудителя коклюша, чем у мышей, зараженных одиночным мутантом В.pertussis 5. Полученные результаты указывают на лучшую переживаемость бактерий B.pertussis KS, чем бактерий В.pertussis 5 и, тем более, бактерий дикого типа. B.pertussis 173, в легких лабораторных животных, зараженных интраназально.In parallel with seeding on a selective medium of homogenate of lungs of mice infected intranasally, DNA preparations were analyzed by PCR using primers specific for the sequences of the ptx, kan, cad genes and the inactivated dnt gene sequence. PCR results did not reveal the DNA of wild-type bacteria in the lungs of mice already in the fifth week after infection. PCR results confirmed that all tested sequences were present in homogenates isolated from animals infected with attenuated bacteria B.pertussis KS and
Таким образом, аттенуированные бактерии B.pertussis согласно изобретению не имеют дермонекротической активности и проявляют низкую общую токсическую активность, соответствующую требованиям, предъявляемым к противококлюшным вакцинам, производимым в РФ. Более того, аттенуированные бактерии B.pertussis согласно изобретению продуцируют иммунологически активную, нетоксичную производную коклюшного токсина и сохраняют структуру мутантных генов ptx и dnt после, по крайней мере, 15 пассажей на искусственных питательных средах, хранения и при размножении в легких лабораторных животных. Интраназальная иммунизация лабораторных мышей живыми бактериями аттенуированного штамма B.pertussis KS обеспечивает защиту от внутримозгового заражения мышей высоковирулентным штаммом 18323 возбудителя коклюша, близкую по защитному эффекту после иммунизации отраслевым стандартным образцам коклюшной корпускулярной вакцины (ОСО-3).Thus, the attenuated B.pertussis bacteria according to the invention do not have dermonecrotic activity and exhibit low overall toxic activity that meets the requirements for pertussis vaccines produced in the Russian Federation. Moreover, the attenuated B.pertussis bacteria according to the invention produce an immunologically active, non-toxic derivative of pertussis toxin and retain the structure of the mutant ptx and dnt genes after at least 15 passages on artificial nutrient media, storage and reproduction in the lungs of laboratory animals. The intranasal immunization of laboratory mice with live bacteria of the attenuated B.pertussis KS strain provides protection against intracerebral infection of mice with a highly virulent pertussis strain 18323, similar in protective effect after immunization with industry standard samples of pertussis corpuscular vaccine (OSO-3).
Пример 5. Корпускулярная вакцина на основе аттенуированных бактерий B.pertussis KS, инактивированных гексаметилентетрамином (ГМТА)Example 5. Corpuscular vaccine based on attenuated bacteria B.pertussis KS inactivated by hexamethylenetetramine (HMTA)
Препараты готовили согласно описанному ранее методу (Авт. свид. №1497802). Бактерии В. pertussis выращивают на средах КУА или Коен-Уиллер при 35°С 36 часов, смывают 0,85% раствором хлорида натрия (рН 7,0-7,2) до концентрации 50-60 МОЕ/мл. В суспензию добавляют 10% раствор ГМТА. Выдерживают при 35°С 48-96 часов. Оценку токсичности и защитных свойств образца вакцины согласно изобретению определяли в соответствии с инструкцией по отбору, проверке и хранению штаммов коклюшных бактерий для производства коклюшных вакцин и коклюшного компонента АКДС-вакцин (М., 1987). Образцы вакцины на основе аттунуированных бактерий B.pertussis KS проверяли через 3 месяца после приготовления. Токсическую активность определяли в опытах на мышах, морских свинках и кроликах.The preparations were prepared according to the previously described method (Auth. Certificate. No. 1497802). B. pertussis bacteria are grown on AMC or Cohen-Wheeler media at 35 ° C for 36 hours, washed off with a 0.85% sodium chloride solution (pH 7.0-7.2) to a concentration of 50-60 MOU / ml. A 10% solution of HMTA is added to the suspension. It is maintained at 35 ° C for 48-96 hours. Assessment of the toxicity and protective properties of the vaccine sample according to the invention was determined in accordance with the instructions for the selection, verification and storage of pertussis bacteria strains for the production of pertussis vaccines and the pertussis component of DTP vaccines (M., 1987). Attuned B.pertussis KS vaccine samples were tested 3 months after preparation. Toxic activity was determined in experiments on mice, guinea pigs and rabbits.
* Относительный прирост массы мышей после внутрибрюшинного (i.p) введения 1×109 м.к. измерялся в % по отношению к массе тела контрольных животных, которым вводили 0,85 р-р хлорида натрия.OSO-3 - industry standard sample of corpuscular pertussis vaccine; Introduction of samples: ip - intraperitoneal; iv - intravenous
* Relative weight gain of mice after intraperitoneal (ip) administration of 1 × 10 9 mk measured in% relative to the body weight of the control animals, which were injected with 0.85 r-sodium chloride.
Данные, представленные в табл.4 и 5, демонстрируют, что корпускулярная вакцина, приготовленная инактивированием аттенуированных рекомбинантных бактерий B.pertussis KS, не имеет специфической активности коклюшного и дермонекротического токсинов (уровень ЛСА и ГСА ниже, чем у ОСО-3, не вызывает гибели мышей при внутрибрюшинном введении препаратов и некрозов в кожной пробе на морских свинках и кроликах). Результаты теста изменения массы мышей (табл.4) показали, что испытуемая корпускулярная вакцина проявляет низкую токсичность в сравнении с ОСО-3 (прирост массы тела мышей через 72 ч составил 20% и через 7 суток составил более 80%) (табл.6).The data presented in Tables 4 and 5 demonstrate that the corpuscular vaccine prepared by inactivating attenuated recombinant bacteria B.pertussis KS does not have specific activity of pertussis and dermonecrotic toxins (the level of LSA and HCA is lower than that of OSO-3, does not cause death mice with intraperitoneal administration of drugs and necrosis in a skin test in guinea pigs and rabbits). The results of the test for changes in the mass of mice (Table 4) showed that the test corpuscular vaccine exhibits low toxicity compared to OSO-3 (the gain in body weight of mice after 72 hours was 20% and after 7 days was more than 80%) (Table 6) .
В качестве положительного контроля использовали препарат ОСО-3, который вводили мышам внутрибрюшинно в количестве, соответствующем опытным образцам - 0,5; 0,1; 0,02×109 микробных клеток. После внутрибрюшинного введения животным инактивированных бактерий B.pertussis KS в зависимости от количества бактерий, использованных для вакцинации, наблюдали защиту мышей от 80 до 100% от последующего интрацеребрального заражения вирулентными бактериями B.pertusis 18323.As a positive control, the OSO-3 preparation was used, which was administered intraperitoneally to mice in an amount corresponding to the experimental samples — 0.5; 0.1; 0.02 × 10 9 microbial cells. After intraperitoneal administration of inactivated B.pertussis KS bacteria to animals, depending on the number of bacteria used for vaccination, mice were protected from 80 to 100% from subsequent intracerebral infection with virulent bacteria B.pertusis 18323.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010154228/10A RU2455024C1 (en) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010154228/10A RU2455024C1 (en) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2455024C1 true RU2455024C1 (en) | 2012-07-10 |
Family
ID=46848419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010154228/10A RU2455024C1 (en) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2455024C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2623314C2 (en) * | 2015-11-09 | 2017-06-23 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | Assessment method for protective potency of pertussis vaccines |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1369042A1 (en) * | 1986-02-26 | 1995-08-09 | Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова | Method for obtaining bordetella pertussis anatoxin |
| RU2227746C1 (en) * | 2003-02-13 | 2004-04-27 | Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН | Method for obtaining bordetella pertussis anatoxin |
| WO2006122586A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-11-23 | Intervet International B.V. | Pasteurella multocida vaccine |
| WO2007104451A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Institut Pasteur De Lille | Live attenuated bordetella strains as a single dose vaccine against whooping cough |
-
2010
- 2010-12-30 RU RU2010154228/10A patent/RU2455024C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1369042A1 (en) * | 1986-02-26 | 1995-08-09 | Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова | Method for obtaining bordetella pertussis anatoxin |
| RU2227746C1 (en) * | 2003-02-13 | 2004-04-27 | Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН | Method for obtaining bordetella pertussis anatoxin |
| WO2006122586A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-11-23 | Intervet International B.V. | Pasteurella multocida vaccine |
| WO2007104451A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Institut Pasteur De Lille | Live attenuated bordetella strains as a single dose vaccine against whooping cough |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2623314C2 (en) * | 2015-11-09 | 2017-06-23 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | Assessment method for protective potency of pertussis vaccines |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2640525B2 (en) | Non-toxic microorganisms and their use | |
| US6399074B1 (en) | Live attenuated salmonella vaccines to control avian pathogens | |
| ES2237094T3 (en) | LACTOBACILLUS THAT HOST GENES OF CELLULAR AGGREGATION AND MUCINE FIXATION, AS VACCINE CONTRIBUTION VEHICLES. | |
| JP3004049B2 (en) | Vaccine containing non-pathogenic phoP-type microorganisms | |
| EP2517723B1 (en) | Compositions and methods of enhancing immune responses | |
| EP2214840B1 (en) | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium | |
| KR102071743B1 (en) | A novel live attenuated shigella vaccine | |
| MXPA00011075A (en) | Attenuated mutants of salmonella. | |
| Fu et al. | Immunogenicity and protective efficacy of recombinant Haemophilus parasuis SH0165 putative outer membrane proteins | |
| AU763683B2 (en) | Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the aroC, ompF and ompC genes, useful as vaccines | |
| JP5745731B2 (en) | Salmonella vaccine | |
| US9757445B2 (en) | Attenuated Pasteurella multocida vaccines and methods of making and use thereof | |
| US10603370B2 (en) | Compositions and methods of preparing Leptospira | |
| CA2760098C (en) | Mutants of francisella tularensis and uses thereof | |
| Yang et al. | Evaluation of recombinant Salmonella vaccines to provide cross-serovar and cross-serogroup protection | |
| KR101066951B1 (en) | Recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods for use | |
| RU2455024C1 (en) | Attenuated bacteria bordetella pertussis, whooping cough agent vaccine | |
| WO2004073736A1 (en) | Attenuated strains of vibrio cholerae and lyophilised vaccines containing same | |
| US7524507B1 (en) | Recombinant microorganisms | |
| MXPA00009354A (en) | Bacteria attenuated by a non-reverting mutation in each of the aroc, ompf and ompc genes, useful as vaccines | |
| Shelton | Molecular analysis of virulence factors in Bordetella avium |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |