RU2227746C1

RU2227746C1 - Method for obtaining bordetella pertussis anatoxin

Info

Publication number: RU2227746C1
Application number: RU2003104231/15A
Authority: RU
Inventors: Н.С. Захарова; И.Г. Бажанова; Т.Н. Ремова; М.В. Брицина; Е.И. Шмелева; Н.У. Мерцалова; М.Н. Озерецковска; М.Н. Озерецковская; Е.В. Ермолова; Е.М. Зайцев
Original assignee: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
Priority date: 2003-02-13
Filing date: 2003-02-13
Publication date: 2004-04-27

Abstract

FIELD: medicine, medicinal microbiology. SUBSTANCE: the present innovation deals with obtaining cell-free pertussis vaccine. In liquid nutritive medium one should cultivate pertussis bacteria, separate supernatant to remove toxic material, detoxication of supernatant should be carried out due to successive addition of saccharose up to 3-5% concentration and formalin up to 0.4% concentration followed by keeping the mixture at 36 C for 3 d. Partially neutralized toxic material is removed out of supernatant at the presence of 1%-sodium hexametaphosphate solution and 2n trichloroacetic acid at pH being 3.4-3.5. The residue obtained should be separated due to centrifuging at 12500 rot./min for 60 min to be solved in 0.07 M phosphate buffer at pH being 7.5. The preparation obtained should be supplemented with saccharose up to 10% concentration and formalin up to 0.15-0.2% concentration. It should be finally detoxicated at 36 C for 15 d. As a result, a highly active and low toxic Bordetella pertussis anatoxin is obtained to be applied for producing cell-free pertussis vaccine. EFFECT: higher efficiency. 1 cl, 2 ex

Description

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для производства бесклеточной коклюшной вакцины.The invention relates to medical microbiology and can be used for the production of acellular pertussis vaccine.

Известен способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделения из него токсина с последующей детоксикацией формалином и сорбцией анатоксина на гидроокиси алюминия, токсин из супернатанта выделяют осаждением 3-7%-ным раствором гексаметафосфата натрия в присутствии 0,002-0,006 М растворов соляной, серной и трихлоруксусной кислот при рН 3,4-3,6, а детоксикацию токсина проводят в 8-12%-ном растворе сахарозы (RU 1369042, А 61 К 39/10, 1986 г.).There is a method of producing Bordetella pertussis toxoid by cultivating pertussis bacteria in a liquid nutrient medium, separating the supernatant, isolating the toxin from it, followed by detoxification with formalin and sorption of the toxoid on aluminum hydroxide, toxin from the supernatant is isolated by precipitation with a 3-7% sodium hexametaphosphate solution in the presence of 0.002 -0.006 M solutions of hydrochloric, sulfuric and trichloroacetic acids at pH 3.4-3.6, and toxin detoxification is carried out in an 8-12% sucrose solution (RU 1369042, A 61 K 39/10, 1986).

Проблема получения высокоэффективных низкотоксичных вакцин для профилактики коклюшной инфекции остается актуальной, поскольку применяемая в практике корпускулярная вакцина обладает высокой реактогенностью, а бесклеточные коклюшные вакцины характеризуются выраженной протективной активностью и более низкой токсичностью.The problem of obtaining highly effective low-toxic vaccines for the prophylaxis of pertussis infection remains relevant, since the corpuscular vaccine used in practice is highly reactogenic, and acellular pertussis vaccines are characterized by pronounced protective activity and lower toxicity.

Повышение протективной активности бесклеточной коклюшной вакцины - одно из важных условий совершенствования этих препаратов.An increase in the protective activity of acellular pertussis vaccine is one of the important conditions for the improvement of these drugs.

Технический результат заявленного способа заключается в получении высокоактивного и низкотоксичного анатоксина Bordetella pertussis.The technical result of the claimed method is to obtain a highly active and low toxic toxoid Bordetella pertussis.

Для достижения указанного технического результата в способе получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделения из него токсического материала, детоксикации токсического материала формалином и сорбцией анатоксина на геле гидроокиси алюминия, согласно изобретению детоксикацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-5% и формалина до концентрации 0,4% с последующим выдерживанием смеси при 36°С в течение 3 суток, частично обезвреженный токсический материал выделяют из супернатанта в присутствии 1% раствора гексаметафосфата натрия и 2н. трихлоруксусной кислоты при рН 3,4-3,5, полученный осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 0,07 М фосфатном буфере рН 7,5, в полученный препарат добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,15-0,2% и окончательно его детоксицируют при 36°С в течение 15 суток.To achieve the specified technical result in the method for producing the Bordetella pertussis toxoid by cultivating pertussis bacteria in a liquid nutrient medium, separating the supernatant, releasing toxic material from it, detoxifying the toxic material with formalin and sorption of the toxoid on an aluminum hydroxide gel, according to the invention, the supernatant is detoxified by successive addition of sucrose to a concentration of 3-5% and formalin to a concentration of 0.4%, followed by maintaining the mixture at 36 ° C for 3 ducks, partially neutralized toxic material is isolated from the supernatant in the presence of 1% sodium hexametaphosphate and 2N. trichloroacetic acid at pH 3.4-3.5, the resulting precipitate was separated by centrifugation and dissolved in 0.07 M phosphate buffer pH 7.5, sucrose was added to the resulting preparation to a concentration of 10% and formalin to a concentration of 0.15-0.2 % and finally detoxify it at 36 ° C for 15 days.

Кроме того, центрифугирование осуществляют при 12500 об/мин в течение 60 минут.In addition, centrifugation is carried out at 12,500 rpm for 60 minutes.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах выполнения способа.The invention is illustrated in the following examples of the method.

Пример 1. Штамм 475а Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-й пассаж) инокулируют до концентрации 3,0-3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут.Example 1. The strain 475a Bordetella pertussis phase 1 from the environment of Borde-Zhangu (2nd passage) is inoculated to a concentration of 3.0-3.5 MOU in 1 ml in mattresses containing 150-200 ml of liquid nutrient medium and cultured at 35, 5 ° C for 5 days. The supernatant is separated from the microbial cells by centrifugation at 12,500 rpm for 60 minutes.

К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 3% и формалин до концентрации 0,4%. Смесь выдерживают в термостате при 36°С в течение 3 суток. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия и рН смеси доводят до 3,4 2н. трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,15%. Препарат окончательно детоксицируют при 36°С в течение 15 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл.Sucrose to a concentration of 3% and formalin to a concentration of 0.4% are successively added to 1 L of the supernatant. The mixture is kept in a thermostat at 36 ° C for 3 days. Then, 50 ml of a 20% solution of sodium hexametaphosphate are successively added to 1 liter of the mixture, and the pH of the mixture is adjusted to 3.4 2N. trichloroacetic acid (TCA). The precipitate was separated by centrifugation at 12,500 rpm for 60 minutes and dissolved in 20 ml of 0.07 M phosphate buffer pH 7.5. Sucrose to a concentration of 10% and formalin to a concentration of 0.15% are added to the resulting preparation. The drug is finally detoxified at 36 ° C for 15 days. The resulting toxoid is sorbed on an aluminum hydroxide gel at a concentration of 8 μg of protein nitrogen per 1 mg of gel in 1 ml.

Пример 2. Штамм 475а Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-й пассаж) инокулируют до концентрации 3,0-3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут.Example 2. The strain 475a Bordetella pertussis phase 1 from the environment of Borde-Zhangu (2nd passage) is inoculated to a concentration of 3.0-3.5 MOU in 1 ml in mattresses containing 150-200 ml of liquid nutrient medium and cultured at 35, 5 ° C for 5 days. The supernatant is separated from the microbial cells by centrifugation at 12,500 rpm for 60 minutes.

К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 5% и формалин до концентрации 0,4%. Смесь выдерживают в термостате при 36°С в течение 3 суток. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия и рН смеси доводят до 3,5 2н. ТХУ. Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5.Sucrose to a concentration of 5% and formalin to a concentration of 0.4% are successively added to 1 L of the supernatant. The mixture is kept in a thermostat at 36 ° C for 3 days. Then, 50 ml of a 20% solution of sodium hexametaphosphate are successively added to 1 liter of the mixture and the pH of the mixture is adjusted to 3.5 2N. THU. The precipitate was separated by centrifugation at 12,500 rpm for 60 minutes and dissolved in 20 ml of 0.07 M phosphate buffer pH 7.5.

К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,2%. Препарат окончательно детоксицируют при 36°С в течение 15 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл.Sucrose to a concentration of 10% and formalin to a concentration of 0.2% are added to the resulting preparation. The drug is finally detoxified at 36 ° C for 15 days. The resulting toxoid is sorbed on an aluminum hydroxide gel at a concentration of 8 μg of protein nitrogen per 1 mg of gel in 1 ml.

При сравнительном изучении протективной активности анатоксинов, полученных предлагаемым и известным способами, было показано, что препараты, полученные предлагаемым способом, были значительно активнее препаратов, полученных известным способом, и содержали 23,3±0,3 международных защитных единиц (МЗЕ) в 1 мл, в то время как препараты, полученные известным способом, содержали 16,0±1,62 МЗЕ/мл. Различия были статистически достоверны при р=0,01.In a comparative study of the protective activity of toxoids obtained by the proposed and known methods, it was shown that the preparations obtained by the proposed method were significantly more active than the preparations obtained by the known method and contained 23.3 ± 0.3 international protective units (MU) in 1 ml while the preparations obtained in a known manner contained 16.0 ± 1.62 MU / ml. The differences were statistically significant at p = 0.01.

По требованию Всемирной организации здравоохранения одна иммунизирующая доза для человека должна содержать 4 МЗЕ.At the request of the World Health Organization, one immunizing dose for a person should contain 4 MZE.

Для препаратов, полученных предлагаемым способом, она составляла 1,3 мкг белкового азота, а для препаратов, полученных известным способом, - 2 мкг белкового азота.For drugs obtained by the proposed method, it was 1.3 μg of protein nitrogen, and for drugs obtained in a known manner, 2 μg of protein nitrogen.

Изучение токсических свойств препаратов, полученных предлагаемым и известным способами, показало, что гистаминсенсибилизирующая активность ГСД50 (доза, сенсибилизирующая 50% мышей к гистамину) для заявленного способа составляла 17,5 мкг белкового азота, что в 13,46 раза превышало иммунизирующую дозу для человека. Для известно способа ГСД50 составляла 18,7 мкг белкового азота, что в 9,35 раза превышало иммунизирующую дозу для человека.A study of the toxic properties of the preparations obtained by the proposed and known methods showed that the histamine-sensitizing activity of GDD50 (dose sensitizing 50% of mice to histamine) for the claimed method was 17.5 μg of protein nitrogen, which was 13.46 times higher than the immunizing dose for humans. For the known method, GDM50 was 18.7 μg of protein nitrogen, which was 9.35 times higher than the immunizing dose for humans.

Полученные данные свидетельствовали о более низкой токсичности препаратов, полученных заявленным способом, в сравнении с препаратами, полученными известным способом.The data obtained indicated a lower toxicity of the drugs obtained by the claimed method, compared with drugs obtained in a known manner.

Преимущество изобретения заключается в том, что разработан способ получения высокоактивного и низкотоксичного анатоксина Bordetella pertussis, который может быть использован для получения бесклеточной коклюшной вакцины.An advantage of the invention lies in the fact that a method has been developed for the production of highly active and low-toxic toxoid Bordetella pertussis, which can be used to obtain acellular pertussis vaccine.

Claims

1. The method of producing Bordetella pertussis toxoid by cultivating pertussis bacteria in a liquid nutrient medium, separating the supernatant, releasing toxic material from it, detoxifying the toxic material with formalin and sorbing the toxoid on an aluminum hydroxide gel, characterized in that the supernatant is detoxified by successive addition of sucrose to a concentration 3-5% and formalin to a concentration of 0.4%, followed by maintaining the mixture in an thermostat at 36 ° C for 3 days, partially neutralized with toxic The material is isolated from the supernatant in the presence of a 1% solution of sodium hexametaphosphate and 2 N trichloroacetic acid at pH 3.4-3.5, the resulting precipitate is separated by centrifugation and dissolved in 0.07 M phosphate buffer, pH 7.5, in the resulting preparation sucrose is added to a concentration of 10% and formalin to a concentration of 0.15-0.2% and finally detoxified at 36 ° C for 15 days.

2. The method according to claim 1, characterized in that the centrifugation is carried out at 12500 rpm for 60 minutes