RU2799018C2 - METHODS FOR ASSESSING THE PROTECTIVE ACTIVITY AND IMMUNOGENICITY OF PERTUSSIS VACCINES IN HUMANS, THE USE OF LIVE PERTUSSIS RECOMBINANT VACCINE GamFA - Google Patents
METHODS FOR ASSESSING THE PROTECTIVE ACTIVITY AND IMMUNOGENICITY OF PERTUSSIS VACCINES IN HUMANS, THE USE OF LIVE PERTUSSIS RECOMBINANT VACCINE GamFA Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799018C2 RU2799018C2 RU2021129929A RU2021129929A RU2799018C2 RU 2799018 C2 RU2799018 C2 RU 2799018C2 RU 2021129929 A RU2021129929 A RU 2021129929A RU 2021129929 A RU2021129929 A RU 2021129929A RU 2799018 C2 RU2799018 C2 RU 2799018C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pertussis
- bacteria
- volunteers
- vaccine
- attenuated
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается способов оценки защитной активности и иммуногенности коклюшных вакцин у человека.The invention relates to biotechnology and medicine and concerns methods for assessing the protective activity and immunogenicity of pertussis vaccines in humans.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Известны различные способы оценки защитной активности коклюшных вакцин.Various methods are known for assessing the protective activity of pertussis vaccines.
В публикации Develop. in Biol. Stand. (1996, v. 86. p. 271-281) предлагают оценивать защитную активность коклюшных вакцин по уровню антител к основным протективным антигенам - коклюшному токсину (КТ) и филаментозному гемагглютинину (ФГА) В. pertussis на 4-5 неделе после введения их экспериментальным животным.In a post by Develop. in Biol. Stand. (1996, v. 86. p. 271-281) propose to evaluate the protective activity of pertussis vaccines by the level of antibodies to the main protective antigens - pertussis toxin (CT) and filamentous hemagglutinin (FHA) of B. pertussis at 4-5 weeks after their administration to experimental animals.
Известен способ определения защитной активности коклюшных вакцин (патент РФ 2623314), основанный на определении ЛД50 при интраназальном заражения мышей вирулентными бактериями В. bronchiseptica, В. parapertussis и В. pertussis, обеспечивающий оценку защитной активности коклюшных вакцин в процессе их разработки. Способ предусматривает интраназальную иммунизацию мышей коклюшными вакцинами с последующим заражением вирулентными бактериями В. pertussis, В. bronchiseptica, В. parapertussis и отличается тем, что осуществляют интраназальное заражение вирулентными бактериями В. bronchiseptica, В. parapertussis и В. pertussis в летальных дозах и определяют выживаемость вакцинированных животных. Метод позволяет определить защитную активность вакцин на этапе доклинического исследования, но не обеспечивает адекватной оценки защитной активности у человека.A known method for determining the protective activity of pertussis vaccines (RF patent 2623314), based on the determination of LD 50 during intranasal infection of mice with virulent bacteria B. bronchiseptica, B. parapertussis and B. pertussis, providing an assessment of the protective activity of pertussis vaccines in the process of their development. The method involves intranasal immunization of mice with pertussis vaccines followed by infection with virulent bacteria B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis and differs in that intranasal infection with virulent bacteria B. bronchiseptica, B. parapertussis and B. pertussis is carried out in lethal doses and survival is determined vaccinated animals. The method makes it possible to determine the protective activity of vaccines at the stage of preclinical studies, but does not provide an adequate assessment of the protective activity in humans.
В патенте РФ 2231793 предложен способ оценки защитной активности коклюшных вакцин по количественному содержанию в них коклюшного токсина. Использование в качестве индикатора иммуногенных свойств коклюшных вакцин Использование в качестве индикатора иммуногенных свойств коклюшных вакцин количества содержащегося в них коклюшного токсина (КТ), обусловлено тем, что КТ является основным протективным антигеном, обеспечивающей активную защиту организма против коклюшной инфекции ("Коклюш" ААР 2000, Red Book; Report the Committee on Infetions Diseases, 25 th, Copyrigth; 2000 American Academy Pediatrics, p. 439; Wendy A. Keitell M.D. "Новые вакцины и новые вакцинные технологии" Infect. Dis. Clin of Noth America. 1999, v. 13, №1, p. 83-84). В предлагаемом способе оценки иммуногенности коклюшные вакцины, содержащие низкое количество КТ, например, 8, 40, 81 и 10, 20, 45 мкг/мл, защищали всего 20-40% животных, взятых в опыт, а коклюшные вакцины, содержащие 220 и 241 мкг/мл, защищали от 90% до 95% экспериментальных животных.RF patent 2231793 proposes a method for assessing the protective activity of pertussis vaccines by the quantitative content of pertussis toxin in them. Use as an indicator of the immunogenic properties of pertussis vaccines The use of the amount of pertussis toxin (PT) contained in them as an indicator of the immunogenic properties of pertussis vaccines is due to the fact that PT is the main protective antigen that provides active protection of the body against pertussis infection ("Whooping Cough" AAP 2000, Red Book; Report the Committee on Infetions Diseases, 25 th, Copyrigth; 2000 American Academy Pediatrics, p. 439; Wendy A. Keitell M. D. "New Vaccines and New Vaccine Technologies" Infect. Dis. Clin of Noth America. 1999, v. 13, No. 1, pp. 83-84). In the proposed method for assessing immunogenicity, pertussis vaccines containing a low amount of CT, for example, 8, 40, 81 and 10, 20, 45 μg/ml, protected only 20-40% of the animals taken in the experiment, and pertussis vaccines containing 220 and 241 µg/ml protected from 90% to 95% of experimental animals.
Известен способ оценки иммуногенности коклюшных вакцин по очищению верхних дыхательных путей лабораторных мышей от вирулентных бактерий В. pertussis на 7-10 день после аэрозольного заражения (Mills КН. et al., Inf. and Immun. 1998. vol. 66, №2. p. 594-602).A known method for assessing the immunogenicity of pertussis vaccines by clearing the upper respiratory tract of laboratory mice from virulent B. pertussis bacteria on days 7-10 after aerosol infection (Mills KH. et al., Inf. and Immun. 1998. vol. 66, No. 2. p 594-602).
Syukuda Y. с соавт. ("Тест аэрозольного инфицирования для оценки иммуногенности коклюшных вакцин". Tokai J. Exp. Clin. Med. 1988, vol. 13, Suppl. 2. p. 71-72) предложили оценивать защитную активность коклюшных вакцин по уровню специфических антител и количеству бактерий в легких после аэрозольного заражения вакцинированных мышей вирулентным бактериями B. pertussis.Syukuda Y. et al. ("Aerosol test for assessing the immunogenicity of pertussis vaccines" Tokai J. Exp. Clin. Med. 1988, vol. 13, Suppl. 2. p. 71-72) proposed to evaluate the protective activity of pertussis vaccines by the level of specific antibodies and the number of bacteria in lungs following aerosol challenge of vaccinated mice with virulent B. pertussis bacteria.
Модель интраназального заражения мышей была использована для оценки защитной активности цельноклеточных коклюшных вакцин Quinvaxem, Easyfive and Pentavac (Anne Marie Queenan et. al. The mouse intranasal challenge model for potency testing of whole-cell pertussis vaccines. Expert Review of Vaccines. 2014, Vol. 13, No. 10, p. 1265-1270). Эффективность вакцин определялась на основании определения КОЕ в легких через пять дней после интраназального заражения вакцинированных мышей вирулентным штаммом Bordetella pertussis.A mouse intranasal challenge model for potency testing of whole-cell pertussis vaccines. Expert Review of Vaccines. 2014, Vol. 13, No. 10, pp. 1265-1270). The effectiveness of the vaccines was determined based on the determination of CFU in the lungs five days after intranasal infection of vaccinated mice with a virulent strain of Bordetella pertussis.
В публикации WO 2007104451 описан метод оценки эффективности живой вакцины, содержащей аттенуированные бактерии Bordetella pertussis BPZE1, и бесклеточной коклюшной вакцины aPv с последующим интраназальным заражением вакцинированных мышей вирулентным штаммом В. pertussis. После чего через неделю удаляли легкие и определяли КОЕ. Вакцинация BPZE1 в отличии от aPV обеспечивает полную защиту от интраназальной инфекции вирулентным штаммом В. pertussis (наблюдается полный бактериальный клиренс в легких спустя неделю после инфекции и статистически значимое уменьшение бактериальной загрузки через 3 часа после инфекции. При вакцинации aPV отмечено присутствие бактерий В. pertussis в легких животных спустя неделю после инфекции.WO 2007104451 describes a method for evaluating the efficacy of a live vaccine containing attenuated Bordetella pertussis BPZE1 bacteria and a cell-free aPv pertussis vaccine, followed by intranasal challenge of vaccinated mice with a virulent strain of B. pertussis. After that, a week later, the lungs were removed and CFU were determined. Vaccination with BPZE1, unlike aPV, provides complete protection against intranasal infection with a virulent strain of B. pertussis (complete bacterial clearance in the lungs is observed a week after infection and a statistically significant decrease in bacterial load 3 hours after infection. Vaccination with aPV showed the presence of B. pertussis bacteria in lungs of animals one week after infection.
В настоящее время наиболее широко используемым для контроля качества коклюшных вакцин в производстве является метод, основанный на определении ЛД50 при внутримозговом введении иммунизированным мышам тест-штамма бактерий В. pertussis.Currently, the most widely used method for quality control of pertussis vaccines in production is based on the determination of LD 50 during intracerebral administration of a test strain of bacteria B. pertussis to immunized mice.
Метод оценки защитных свойств коклюшных вакцин, описанный в "Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий" (М., 1987, стр. 18-28 заключается в следующем: белых беспородных мышей массой 10-12 г внутрибрюшинно иммунизируют испытуемой коклюшной вакциной в дозе, составляющей прививочную дозу для человека. Через 2 недели проводят внутримозговое заражение экспериментальных животных нейротропным штаммом бактерий B. pertussis 18323, в дозах, вызывающих 100%. гибель интактных животных. Доза вирулентного штамма должна составлять не менее 100 ЛД50. Для вычисления ЛД50 параллельно с основным опытом заражают интактных мышей используемой вирулентной культурой четырьмя дозами с пятикратным шагом. После заражения наблюдение за экспериментальными животными проводят в течение 14-17 суток, ежедневно учитывая гибель и паралич мышей. По окончании опыта высчитывают процент выживших животных. Эффективными считаются вакцины, защищающие не менее 70% животных, взятых в опыт. Главным недостатком метода является иммунизация и заражение животных не естественным для коклюша путем. Внутримозговое заражение не может моделировать патогенез коклюша и, следовательно, корректно характеризовать защитную активность вакцины. Этому способу также свойственны такие недостатки, как длительность срока исследования, значительное количество экспериментальных животных и зависимость результата от качества и линии животных..The method for assessing the protective properties of pertussis vaccines, described in the "Instructions for the selection, testing and storage of industrial strains of pertussis bacteria" (M., 1987, pp. 18-28, is as follows: outbred mice weighing 10-12 g are intraperitoneally immunized with the tested pertussis vaccine at a dose equal to the vaccination dose for humans.After 2 weeks, intracerebral infection of experimental animals with a neurotropic strain of bacteria B. pertussis 18323 is carried out at doses that cause 100% death of intact animals.The dose of the virulent strain should be at least 100 LD50.To calculate LD50 in parallel with the main experience, infect intact mice with the virulent culture used in four doses with a five-fold step.After infection, the experimental animals are observed for 14-17 days, taking into account the death and paralysis of mice daily.At the end of the experiment, the percentage of surviving animals is calculated.Vaccines that protect not less than 70% of the animals taken in the experiment. The main disadvantage of the method is the immunization and infection of animals in a way that is not natural for whooping cough. Intracerebral infection cannot model the pathogenesis of whooping cough and therefore cannot correctly characterize the protective activity of the vaccine. This method also has such disadvantages as the length of the study period, a significant number of experimental animals and the dependence of the result on the quality and line of animals.
Мышиная модель является наиболее широко используемой методикой лабораторной оценки защитной активности коклюшных вакцин, но адекватность ее применения для оценки защитной активности у человека, в некоторой степени, продемонстрирована только для летальной модели с использованием штамм 18323. Перечисленные тесты используются только для первичной характеристики вакцин на этапе разработки и доклинической проверки и на этапе контроля качества препарата при его производстве.The mouse model is the most widely used method for laboratory evaluation of protective activity of pertussis vaccines, but the adequacy of its use for the evaluation of protective activity in humans, to some extent, has been demonstrated only for a lethal model using strain 18323. The tests listed are used only for the initial characterization of vaccines at the development stage. and preclinical testing and at the stage of quality control of the drug during its production.
Наряду с мышиной в качестве экспериментальной модели для проведения исследований индуцированого вакцинами имунитета используются приматы.Along with the mouse, primates are used as an experimental model for vaccine-induced immunity studies.
Сравнительные исследования цельноклеточных и бесклеточных вакцин (Comparison of Three Whole-Cell Pertussis Vaccines in the Baboon. Clinical AND VACCINE IMMUNOLOGY. 2016, v. 23, 1) проводили на модели бабуинов при последующем инфицировании вирулентными Bordetella pertussis. Не было обнаружено статистических различий в количестве бактерий, выделенных из носоглотки, между вакцинированными бесклеточными вакцинами и невакцинириванными животными. Цельноклеточные вакцины приводили к уменьшению количества бактерий в носоглотке при последующем инфицировании вирулентными Bordetella pertussisComparative studies of whole-cell and acellular vaccines (Comparison of Three Whole-Cell Pertussis Vaccines in the Baboon. Clinical AND VACCINE IMMUNOLOGY. 2016, v. 23, 1) were performed on a baboon model with subsequent infection with virulent Bordetella pertussis. No statistical differences were found in the number of bacteria isolated from the nasopharynx between vaccinated acellular vaccines and unvaccinated animals. Whole cell vaccines resulted in a decrease in the number of bacteria in the nasopharynx during subsequent infection with virulent Bordetella pertussis
В результате изучения динамики накопления и механизмов образования персистирующих форм бактерий В. pertussis у низших обезьян с помощью метода ПЦР в реальном времени установлено, что после однократного интраназального инфицирования обезьян бактерии В. pertussis переживали в верхних дыхательных путях более трех месяцев, при повторном инфицировании сроки сократились до 14-28 дней (Каратаев Г.И., Синяшина Л.Н, Медкова А.Ю., и др. Инсерционная инактивация оперона вирулентности в популяции персистирующих бактерий Bordetella pertussis. Генетика. 2016. Т. 52, №4, ст. 422-430)As a result of studying the dynamics of accumulation and the mechanisms of formation of persistent forms of B. pertussis bacteria in lower monkeys using the real-time PCR method, it was found that after a single intranasal infection of monkeys, B. pertussis bacteria survived in the upper respiratory tract for more than three months, with repeated infection, the time was reduced up to 14-28 days (Karataev G.I., Sinyashina L.N., Medkova A.Yu., et al. Insertional inactivation of the virulence operon in the population of persistent bacteria Bordetella pertussis. Genetika. 2016. V. 52, No. 4, art. 422-430)
Доклинические исследования безопасности, иммуногенности и защитной активности аттенуированных бактерий Bordetella pertussis на экспериментальной модели макаки резус показали, что интраназальная иммунизация обезьян макака резус аттенуированными и вирулентными бактериями В. pertussis приводит при повторной инфекции к подавлениию размножения бактерий, ускорению их элиминации из носоглотки животных и развитию гуморального иммунного ответа (Синяшина, Л.Н. Е.Г. Сёмин, А.Ю. Медкова, и др. Доклинические исследования защитной активности препарата кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины интраназального применения. ЖМЭИ 2019; (3):60-69. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-3-60-69).Preclinical studies of the safety, immunogenicity, and protective activity of attenuated Bordetella pertussis bacteria in an experimental model of the rhesus macaque showed that intranasal immunization of rhesus monkeys with attenuated and virulent B. pertussis bacteria, in case of repeated infection, leads to suppression of bacterial reproduction, acceleration of their elimination from the nasopharynx of animals, and development of humoral immune response (Sinyashina, L.N. E.G. Semin, A.Yu. Medkova, et al. Preclinical studies of the protective activity of the drug candidate recombinant live pertussis vaccine for intranasal use. ZhMEI 2019; (3): 60-69. https: //doi.org/10.36233/0372-9311-2019-3-60-69).
Однако, несмотря на то, что согласно общим представлениям, обезьяны являются более адекватной для человека экспериментальной моделью, полученные результаты не могут быть экстраполированы на человека без проведения специальных исследований. В любом случаи, тестирование защитной активности вакцин на экспериментальной модели обезьян, является лишь дополнительным тестом доклинического исследования вакцины, требующим обязательного клинического изучения защитной активности вакцины на добровольцах.However, despite the fact that, according to general ideas, monkeys are a more adequate experimental model for humans, the results obtained cannot be extrapolated to humans without special studies. In any case, testing the protective activity of vaccines in an experimental monkey model is only an additional test of the preclinical study of the vaccine, requiring a mandatory clinical study of the protective activity of the vaccine in volunteers.
Таким образом, простых и надежных способов оценки защитной активности коклюшных вакцин, выпускаемых в массовую вакцинопрофилактику, не существует даже на этапе лабораторного исследования вакцины.Thus, there are no simple and reliable methods for assessing the protective activity of pertussis vaccines produced for mass vaccination, even at the stage of laboratory research of the vaccine.
Методы, позволяющие определить защитную активность коклюшных вакцин у человека в ходе клинических испытаний в настоящее время не разработаны. На этапе клинических исследований оценивают, как правило только параметры иммуногенности вакцины, основанные на определении количества специфических противококлюшных антител в сыворотке крови добровольцев и реакции клеточного иммунитета. Окончательное решение о регистрации вакцины принимают на основании многоцентровых исследований, включающих большое число участников. Целью таких исследований является оценка иммуногенности и безопасности препарата. Оценку эффективности вакцины проводят на основании результатов широких эпидемиологических пострегистрационных исследований. Учитывая, что многоцентровое исследование, несмотря на большой объем включенных в него добровольцев и высокую стоимость, как правило, призвано подтвердить безопасность и иммуногенность препарата и не дает представления о реальной эффективности вакцины, возникает необходимость в разработке метода, способного, наряду с иммуногенностью, охарактеризовать и защитную активность вакцины для добровольцев. Оценка эффективности препарата на этапах клинического исследования, является актуальной задачей современной вакцинопрофилактики, позволяющей удешевить клинические исследования и получить объективную информацию о реальной защитной активности кандидатной коклюшной вакцины уже на этапе многоцентрового исследования.Methods to determine the protective activity of pertussis vaccines in humans during clinical trials have not yet been developed. At the stage of clinical trials, as a rule, only the immunogenicity parameters of the vaccine are evaluated, based on determining the amount of specific anti-pertussis antibodies in the blood serum of volunteers and the response of cellular immunity. The final decision on the approval of a vaccine is made on the basis of multicentre studies involving a large number of participants. The purpose of such studies is to assess the immunogenicity and safety of the drug. Evaluation of the effectiveness of the vaccine is carried out on the basis of the results of extensive epidemiological post-registration studies. Given that a multicenter study, despite the large number of volunteers included in it and the high cost, as a rule, is designed to confirm the safety and immunogenicity of the drug and does not give an idea of the real effectiveness of the vaccine, there is a need to develop a method that can, along with immunogenicity, characterize and protective activity of the vaccine for volunteers. Evaluation of the effectiveness of the drug at the stages of a clinical trial is an urgent task of modern vaccine prevention, which makes it possible to reduce the cost of clinical trials and obtain objective information about the real protective activity of a candidate pertussis vaccine already at the stage of a multicenter study.
Краткое описание изобретения.Brief description of the invention.
Впервые разработан способ оценки защитной активности коклюшных вакцин у человека, предусматривающий определение скорости выведения бактерий у субъекта, вакцинированного кандидатной вакциной, после интраназального ведения аттенуированных бактерий возбудителя коклюша.For the first time, a method has been developed for assessing the protective activity of pertussis vaccines in humans, which involves determining the rate of elimination of bacteria in a subject vaccinated with a candidate vaccine after intranasal administration of attenuated pertussis pathogen bacteria.
В качестве аттенуированных коклюшных бактерий, используемых для интраназального введения после вакцинации добровольцев кандидатной вакциной, использовали живую коклюшную рекомбинантную вакцину интраназального применения ГамЖВК, разработанную в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) (Сёмин Е.Г., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю., Каратаев Г.И. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий Bordetella pertussis генотипа ptxP3. ЖМЭИ. 2018; 4; 33-41).As attenuated pertussis bacteria used for intranasal administration after vaccination of volunteers with a candidate vaccine, we used a live recombinant pertussis vaccine for intranasal use GamZHVA developed at the Federal State Budgetary Institution “National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya” of the Ministry of Health of the Russian Federation (FGBU “N.F. Gamaleya Research Center for Epidemiology and Microbiology” of the Ministry of Health of Russia) (Semin E.G., Sinyashina L.N., Medkova A.Yu., Karataev G.I. Construction of recombinant attenuated bacteria Bordetella pertussis ptxP3 genotype ZhMEI 2018; 4; 33-41).
Указанная вакцина использовалась также в качестве модели кандидатной вакцины, прошедшей две фазы клинических исследований и получившая разрешение на проведение многоцентровых исследоваий (Медкова А.Ю., Лиджиева А.А., Сёмин Е.Г., Синяшина Л.Н., Сюндюкова Р.А., Дьяков И.Н., Колобухина Л.В., Кружкова И.С., Меркулова Л.Н., Русанова М.Г., Антипят Н.А., Сметанина С.В., Каратаев Г.И. Клинические исследования безопасности и переносимости живой вакцины интраназального применения для профилактики коклюша. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021; 10(1):114-119. https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-1-114-119This vaccine was also used as a candidate vaccine model that passed two phases of clinical trials and received permission to conduct multicenter studies (Medkova A.Yu., Lidzhieva A.A., Semin E.G., Sinyashina L.N., Syundyukova R. A., Dyakov I.N., Kolobukhina L.V., Kruzhkova I.S., Merkulova L.N., Rusanova M.G., Antipyat N.A., Smetanina S.V., Karataev G.I. Clinical Trials on the Safety and Tolerability of a Live Nasal Pertussis Vaccine for the Prevention of Whooping Cough Drug Development and Registration 2021;10(1):114-119 https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-1- 114-119
Статистически достоверное уменьшение времени выведения аттенуированных бактерий в носо/ротоглотке иммунизированнных (вакцинированных) добровольцев, в сравнении с контрольной не иммунизированной группой (плацебо) демонстрирует защитную эффективность кандидатной вакцины.A statistically significant reduction in the clearance time of attenuated bacteria in the nasopharynx/oropharynx of immunized (vaccinated) volunteers, compared to a control unimmunized group (placebo), demonstrates the protective efficacy of the candidate vaccine.
Другой аспект изобретения относится к способу оценки иммуногенности коклюшных вакцин у человека, предусматривающий определение роста специфических противококлюшных IgA и IgG антител в сыворотке крови добровольцев и назальных аспиратах после введения аттенуированных бактерий, следующего за вакцинацией кандидатной вакцинойAnother aspect of the invention relates to a method for assessing the immunogenicity of pertussis vaccines in humans, which involves determining the growth of specific pertussis IgA and IgG antibodies in the blood serum of volunteers and nasal aspirates after administration of attenuated bacteria following vaccination with a candidate vaccine
Вакцинация и введение после вакцинации аттенуированных бактерий индуцируют выраженный рост специфических противококлюшных IgA и IgG антител в сыворотке крови добровольцев и назальных аспиратах, увеличивающийся после введения аттенуированных бактерий. Подъем уровня антител после повторной вакцинации более выражен и регистрируется в более ранние сроки, чем после первой, подтверждает иммуногенность кандидатной вакцины.Vaccination and post-vaccination administration of attenuated bacteria induce a pronounced increase in specific anti-pertussis IgA and IgG antibodies in the blood serum of volunteers and nasal aspirates, which increases after the introduction of attenuated bacteria. The rise in antibody levels after re-vaccination is more pronounced and recorded earlier than after the first one, confirming the immunogenicity of the candidate vaccine.
Предлагаемый метод оценки защитной активности кандидатных коклюшных вакцин впервые позволяет, в отличие от существующих методов, оценить защитную активность коклюшных вакцин на этапе доклинического исследования и сделать более достоверными результаты оценки их эффективности при эпидемиологическом исследовании.The proposed method for evaluating the protective activity of candidate pertussis vaccines for the first time, unlike existing methods, makes it possible to evaluate the protective activity of pertussis vaccines at the stage of preclinical studies and to make the results of evaluating their effectiveness in an epidemiological study more reliable.
Разработанная впервые авторами модель оценки сроков выведения аттенуированных коклюшных бактерий после его вакцинации кандидатной вакциной, адекватно отражает защитную, противобактерийную активность кандидатной вакцины, измеренную в ходе клинических исследований на добровольцах и может рассматриваться как наиболее перспективная для определения защитной активности коклюшных вакцин на этапе регистрационных и пострегистрационных исследований.The model developed for the first time by the authors for evaluating the timing of elimination of attenuated pertussis bacteria after vaccination with a candidate vaccine adequately reflects the protective, antibacterial activity of the candidate vaccine measured in clinical trials on volunteers and can be considered as the most promising for determining the protective activity of pertussis vaccines at the stage of registration and post-registration studies. .
Разработанный способ определения иммуногенности кандидатной вакцины, основанный на ускорении выработки и увеличении уровня антител, индуцированных введением аттенуированных бактерий вакцинированным добровольцам, в сравнении с контрольной группой не вакцинированных, позволяет избежать использования вакцин сравнения, особенно в случае отсутствия адекватной для сравнения вакцины. Метод имитирует природную инфекцию добровольцев естественным для коклюша капельным способом и позволяет оценить ее иммуногенность и противобактерийную активность в условиях близких к реальной коклюшной инфекции.The developed method for determining the immunogenicity of a candidate vaccine, based on the acceleration of the production and increase in the level of antibodies induced by the introduction of attenuated bacteria to vaccinated volunteers, in comparison with the control group of unvaccinated volunteers, makes it possible to avoid the use of comparison vaccines, especially in the absence of an adequate vaccine for comparison. The method imitates the natural infection of volunteers by the drop method, which is natural for whooping cough, and makes it possible to evaluate its immunogenicity and antibacterial activity under conditions similar to a real whooping cough infection.
Краткое описание Фигур.Brief Description of the Figures.
Фиг. 1 представляет график, отображающий значения числа молекул ДНК В. pertussis (ГЭ) в динамике наблюдения. Представленные данные демонстрируют более раннее выведение аттенуированных бактерий из рото-\носоглотки после повторного введения препарата у большинства вакцинированных добровольцев.Fig. 1 is a graph showing the number of B. pertussis DNA molecules (GE) over time. The presented data demonstrate an earlier elimination of attenuated bacteria from the oropharynx after repeated administration of the drug in the majority of vaccinated volunteers.
Фиг. 2. Абсолютные значения IgG в крови иммунизированных добровольцев на разные сроки после вакцинацииFig. Fig. 2. Absolute values of IgG in the blood of immunized volunteers for different periods after vaccination
Фиг. 3. Абсолютные значения IgG в крови добровольцев, получивших плацебо в разные сроки после введенияFig. 3. Absolute values of IgG in the blood of volunteers who received placebo at different times after administration
Фиг. 4. Абсолютные значения IgA в крови иммунизированных добровольцев на разные сроки после вакцинацииFig. 4. Absolute values of IgA in the blood of immunized volunteers for different periods after vaccination
Фиг. 5. Абсолютные значения IgA в крови добровольцев, получивших плацебо в разные сроки после введения.Fig. 5. Absolute values of IgA in the blood of volunteers who received placebo at different times after administration.
Фиг. 6. Абсолютные значения IgA в аспиратах иммунизированных добровольцев на разные сроки после вакцинацииFig. Fig. 6. Absolute values of IgA in aspirates of immunized volunteers for different periods after vaccination
Фи. 7. Абсолютные значения IgA в аспиратах добровольцев, получивших плацебо в разные сроки после введенияFi. 7. Absolute values of IgA in aspirates of volunteers who received placebo at different times after administration
Фиг. 8. Титр (число разведения сывороток) в реакции агглютинации у иммунизированных добровольцев.Fig. 8. Titer (number of serum dilution) in the agglutination reaction in immunized volunteers.
Фиг. 9. Титр (число разведения сывороток) в реакции агглютинации в группе плацебо.Fig. 9. Titer (number of serum dilution) in the agglutination reaction in the placebo group.
Фиг. 10. Процент добровольцев, достигших «+++» в реакции агглютинации сывороткой в разведении более 1:80 на различные сроки после введений вакциныFig. 10. Percentage of volunteers who achieved "+++" in the serum agglutination reaction at a dilution of more than 1:80 at various times after the introduction of the vaccine
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Впервые предложен способ оценки защитной активности коклюшных вакцин у человека, предусматривающий определение скорости выведения бактерий у субъекта, вакцинированного кандидатной вакциной, после интраназальной инокуляции аттенуированных коклюшных бактерий.For the first time, a method is proposed for assessing the protective activity of pertussis vaccines in humans, which involves determining the rate of excretion of bacteria in a subject vaccinated with a candidate vaccine after intranasal inoculation of attenuated pertussis bacteria.
Разработанный способ впервые позволяет оценить эффективность кандидатной вакцины на стадии, предшествующей эпидемиологическому исследованию и сделать более достоверными результаты последнего.The developed method allows for the first time to evaluate the effectiveness of a candidate vaccine at the stage preceding the epidemiological study and to make the results of the latter more reliable.
Заявленный способ определения защитной активности относится к оценке бактериальной нагрузки в рото/носоглотке добровольцев в динамике после интраназального введения кандидатной вакцины и последующего введения аттенуированных бактерий здоровым добровольцам.The claimed method for determining protective activity relates to the assessment of the bacterial load in the oropharynx/nasopharynx of volunteers in dynamics after intranasal administration of a candidate vaccine and subsequent administration of attenuated bacteria to healthy volunteers.
В другом аспекте изобретения относится к способу оценки иммуногенности коклюшных вакцин у человека, предусматривающему определение роста специфических противококлюшных IgA и IgG антител в сыворотке крови добровольцев и назальных аспиратах после введения аттенуированных бактерий, следующего за вакцинацией кандидатной вакциной.In another aspect of the invention relates to a method for assessing the immunogenicity of pertussis vaccines in humans, which involves determining the growth of specific pertussis IgA and IgG antibodies in the serum of volunteers and nasal aspirates after administration of attenuated bacteria following vaccination with a candidate vaccine.
Оценка параметров гуморального иммунного ответа после однократного и двукратного интраназального введения препаратов здоровым добровольцам в сравнении с плацебо путем определения уровня IgG и IgA в сыворотке крови и назофарингеальных\ носоглоточных аспиратах добровольцев позволяет определить иммуногенность кадидатной вакцины, и также подтверждает эффективность заявленного способа определения защитной активности по оценке бактериальной нагрузки в рото/носоглотке добровольцев в динамике после интраназального введения кандидатной вакцины и последующего введения аттенуированных бактерий здоровым добровольцам.Evaluation of the parameters of the humoral immune response after a single and double intranasal administration of drugs to healthy volunteers in comparison with placebo by determining the level of IgG and IgA in the blood serum and nasopharyngeal / nasopharyngeal aspirates of volunteers allows you to determine the immunogenicity of the candidate vaccine, and also confirms the effectiveness of the claimed method for determining the protective activity by evaluating bacterial load in the oropharynx/nasopharynx of volunteers over time after intranasal administration of the candidate vaccine and subsequent administration of attenuated bacteria to healthy volunteers.
Определение титров агглютинации суспензии бактерий B. pertussis сывороткой крови добровольцев после однократного и двукратного интраназального введения препарата здоровым добровольцам в сравнении с плацебо также подтверждает пригодность заявленного способа для определения эффективности кандидатной вакцины. Оценка эффективности противококлюшных вакцин изучена на модели ГамЖВК при использовании ее в качестве как кандидатной вакцины, так и тест-препарата. Бактериальную нагрузку тестировали в динамике с помощью ПЦР РВ. Продемонстрирована защита вакцинированных добровольцев от контакта с инфекцией, проявляющаяся в более ранней элиминации бактерий из рото-\носоглотки добровольцев после введения аттенуированных бактерий возбудителя коклюша. Этот результат, с одной стороны подтверждает защитную активность ГамЖВК, с другой - эффективность использования, входящих в ее состав аттенуированных бактерий B. pertussis, в качестве тест-бактерий для определения защитной активности кандидатных вакцин.Determination of the agglutination titers of a suspension of B. pertussis bacteria in the blood serum of volunteers after a single and double intranasal administration of the drug to healthy volunteers in comparison with placebo also confirms the suitability of the claimed method for determining the effectiveness of a candidate vaccine. Evaluation of the effectiveness of anti-pertussis vaccines was studied on the GaMFV model using it as both a candidate vaccine and a test drug. The bacterial load was tested in dynamics using real-time PCR. The protection of vaccinated volunteers from contact with infection has been demonstrated, manifested in earlier elimination of bacteria from the oropharynx/nasopharynx of volunteers after the introduction of attenuated pertussis pathogen bacteria. This result, on the one hand, confirms the protective activity of GamFA, and, on the other hand, the effectiveness of using the attenuated bacteria B. pertussis included in its composition as test bacteria for determining the protective activity of candidate vaccines.
Статистически достоверное снижение бактериальной нагрузки в аспиратах после интраназального введения тест-бактерий иммунизированным добровольцам в сравнении с не иммунизированными продемонстритовано в Пример 1.A statistically significant reduction in the bacterial load in aspirates after intranasal administration of test bacteria to immunized volunteers compared to non-immunized volunteers is demonstrated in Example 1.
ДНК аттенуированных бактерий B. pertussis зарегистрирована через 1 час и через 24 часа после первой и повторной инокуляции в образцах от всех добровольцев, получивших вакцину.DNA of attenuated B. pertussis bacteria was registered 1 hour and 24 hours after the first and second inoculation in samples from all volunteers who received the vaccine.
Динамика изменения абсолютного числа ГЭ в рото/носоглотке добровольцев продемонстрирована в табл. 1а и 1б и Фиг. 1. В табл. 2 представлены данные достоверности различий числа ГЭ между группами вакцинированных и плацебо.The dynamics of changes in the absolute number of HE in the oropharynx/nasopharynx of volunteers is shown in Table. 1a and 1b and Fig. 1. In the table. Figure 2 presents data on the significance of differences in the number of GEs between the vaccinated and placebo groups.
Представленные в таблице 1а и 1б и Фиг. 1 данные показывают, что при интраназальном введении после повторной инокуляции бактерий уже на 7-е сутки исчезают различия по количеству ГЭ между вакцинированными добровольцами и группой плацебо, тогда как после первой вакцинации содержание ГЭ B. pertussis достоверно выше у вакцинированных в сравнении с плацебо вплоть до 14 суток. Этот результат свидетельствует об ускоренной элиминации бактерий B. pertussis при введении препарата вакцинированным добровольцам.Presented in table 1a and 1b and Fig. 1, the data show that after intranasal administration after repeated inoculation of bacteria, differences in the amount of GE between vaccinated volunteers and the placebo group disappear already on the 7th day, while after the first vaccination, the content of B. pertussis GE is significantly higher in vaccinated compared to placebo up to 14 days. This result indicates an accelerated elimination of B. pertussis bacteria when administered to vaccinated volunteers.
Способ оценки иммуногенности коклюшных вакцин у человека предусматривает определение иммуноглобулинов IgA и IgG у субъектов, вакцинированных кандидатной вакциной, после интраназального ведения аттенуированных бактерий возбудителя коклюша. Интраназальная вакцинация индуцирует дозозависимое формирование специфических иммуноглобулинов IgG и IgA в крови добровольцев, характеризующее развитие гуморального поствакцинального ответа (пример 2). Повторное введение бактерий индуцирует бустерный рост специфических сывороточных иммуноглобулинов. Схожий рост специфических IgA наблюдается в назофарингеальных и ротоглоточных аспиратах.A method for assessing the immunogenicity of pertussis vaccines in humans involves the determination of IgA and IgG immunoglobulins in subjects vaccinated with a candidate vaccine after intranasal administration of attenuated whooping cough bacteria. Intranasal vaccination induces a dose-dependent formation of specific immunoglobulins IgG and IgA in the blood of volunteers, which characterizes the development of a humoral post-vaccination response (example 2). Re-introduction of bacteria induces a booster growth of specific serum immunoglobulins. A similar increase in specific IgA is observed in nasopharyngeal and oropharyngeal aspirates.
Значения IgG у добровольцев, получивших плацебо или аттенуированные бактерии, представлены на Фиг. 2. Данные достоверности различий прироста абсолютных значений IgG у добровольцев, получивших плацебо или аттенуированные бактерии, представлены в табл. 3.IgG values in volunteers who received placebo or attenuated bacteria are shown in FIG. 2. Data on the significance of differences in the increase in absolute IgG values in volunteers who received placebo or attenuated bacteria are presented in Table. 3.
На Фиг. 2 виден выраженный рост уровня IgG в крови добровольцев после вакцинации. Значения IgG в сыворотке крови добровольцев, получивших плацебо, остаются неизменными на протяжении всего срока наблюдения (Фиг. 3). Таблица 2 иллюстрирует, что уже на 7 сутки после вакцинации у добровольцев регистрируется достоверный рост в сравнении с плацебо значений IgG. Рост IgG продолжается после повторного введения препарата.On FIG. 2 shows a pronounced increase in the level of IgG in the blood of volunteers after vaccination. The values of IgG in the blood serum of volunteers who received placebo remain unchanged throughout the observation period (Fig. 3). Table 2 illustrates that already on the 7th day after vaccination, volunteers recorded a significant increase in IgG values compared to placebo. The growth of IgG continues after repeated administration of the drug.
Приведенные результаты свидетельствуют о выраженной иммуногенности тестируемого препарата, а их сравнение с результатами тестирования ДНК возбудителя в носоглотке подтверждает защитный эффект исследуемой вакцины.These results indicate a pronounced immunogenicity of the tested drug, and their comparison with the results of testing the pathogen DNA in the nasopharynx confirms the protective effect of the studied vaccine.
Результаты исследования уровня IgA в сыворотке крови, приведенные на Фиг. 4, 5 и в таблице 3, демонстрируют, что достоверный рост сывороточных IgA регистрируется на 14 сутки после вакцинации и продолжается после последующего введения аттенуированных бактерий. После повторного введения бактерий, как и в случае с IgG, наблюдается бустерный эффект, проявляющийся в росте сывороточных IgA уже на 7 сутки после повторного введения препарата и более чем 10 кратном увеличении значения IgA в сравнении с довакцинным уровнем.The results of the study of the level of IgA in blood serum, shown in Fig. 4, 5 and Table 3 demonstrate that a significant increase in serum IgA is recorded on the 14th day after vaccination and continues after the subsequent introduction of attenuated bacteria. After repeated administration of bacteria, as in the case of IgG, a booster effect is observed, which manifests itself in the growth of serum IgA already on the 7th day after repeated administration of the drug and a more than 10-fold increase in the IgA value compared to the pre-vaccination level.
Анализ гуморального ответа добровольцев подтвержает, что вакцинация и последующее введение аттенуированных бактерий индуцируют выраженный рост специфических противококлюшных IgA и IgG антител в сыворотке крови добровольцев, увеличивающийся после повторной вакцинации. Подъем уровня антител после повторного введения бактерий добровольцам регистрируется в более ранние сроки, что подтверждает наличие, так называемого бустерного эффекта, свидетельствующего об иммуногенности кандидатной вакцины и дополнительно подтверждает защитный эффект тестируемой кандидатной вакцины.Analysis of the humoral response of volunteers confirms that vaccination and the subsequent introduction of attenuated bacteria induce a pronounced increase in specific anti-pertussis IgA and IgG antibodies in the blood serum of volunteers, which increases after repeated vaccination. The rise in antibody levels after repeated administration of bacteria to volunteers is recorded at an earlier time, which confirms the presence of the so-called booster effect, indicating the immunogenicity of the candidate vaccine and additionally confirms the protective effect of the tested candidate vaccine.
Также, IgA определяли отдельно в супернатантах, полученных после смыва назофарингеальных и ротоглоточных зондов (аспиратах). Для анализа использовали среднее, либо максимальное из двух измеренных значений IgA.Also, IgA was determined separately in supernatants obtained after washing nasopharyngeal and oropharyngeal probes (aspirates). The average or maximum of the two measured IgA values was used for analysis.
Из Фигур 6 и 7 видно, что максимальный уровень секреторных антител IgA достигается на 28 сутки после вакцинации и последующего введения бактерий. Достоверный в сравнении с плацебо прирост значений секреторных IgA наблюдается на 14 день после первого и второго введения аттенуированных бактерий (таблица 4).From Figures 6 and 7 it can be seen that the maximum level of secretory IgA antibodies is reached on the 28th day after vaccination and subsequent introduction of bacteria. A significant increase in secretory IgA values in comparison with placebo is observed on the 14th day after the first and second injection of attenuated bacteria (table 4).
Таким образом, авторами установлено, что оценка иммуногенности кандидатных вакцин может быть определена путем тестирования роста специфических секреторных иммуноглобулинов в носо-/ротоглотке здоровых вакцинированных добровольцев, после интраназального введения аттенуированных бактерий, сопровождающгося дальнейшим ростом количества секреторных IgA.Thus, the authors found that the assessment of the immunogenicity of candidate vaccines can be determined by testing the growth of specific secretory immunoglobulins in the nasopharynx/oropharynx of healthy vaccinated volunteers, after intranasal administration of attenuated bacteria, accompanied by a further increase in the number of secretory IgA.
Определение титра агглютинации сыворотки крови вакцинированных добровольцев и плацебо культурой вирулентных бактерий B. pertussis описано в примере 3.Determination of the agglutination titer of blood serum of vaccinated volunteers and placebo by a culture of virulent bacteria B. pertussis is described in example 3.
Результаты изменения титра агглютинации в динамике для указанных групп добровольцев и их сравнительный анализ представлены на Фигурах 8-10The results of changes in the titer of agglutination in dynamics for these groups of volunteers and their comparative analysis are presented in Figures 8-10
Анализ титров агглютинации сыворотки добровольцев использовался для дополнительной характеристики гуморального ответа на вакцинацию кандидатной вакциной.Analysis of volunteer sera agglutination titers was used to further characterize the humoral response to vaccination with the candidate vaccine.
Представленные на Фиг. 8, 9 и в табл. 5 результаты демонстрируют нарастание титров агглютинации в РА после вакцинации и последующего введения аттенуированных бактерий и подтверждают иммуногенность кандидатной вакцины. Из Фиг. 10 следует, что нарастание титров агглютинации выше после последующего ведения аттениурованных бактерий и концу срока наблюдения достигается не менее чем у 94% добровольцев.Shown in FIG. 8, 9 and in table. 5, the results demonstrate an increase in RA agglutination titers after vaccination and subsequent administration of attenuated bacteria and confirm the immunogenicity of the candidate vaccine. From FIG. 10 it follows that the increase in agglutination titers is higher after subsequent administration of attenuated bacteria and by the end of the observation period is achieved in at least 94% of volunteers.
Анализ параметров гуморального иммунного ответа, таких как специфических антител IgG и IgA в сыворотке крови, секреторных специфических противококлюшных антител IgA в рото-/носоглоточных аспиратах, показал статистически достоверный рост количества противококлюшных иммуноглобулинов у добровольцев после вакцинации и подтвердил защитный потенциал и иммунгенность вакцины.Analysis of the parameters of the humoral immune response, such as specific antibodies IgG and IgA in blood serum, secretory specific anti-pertussis antibodies IgA in oropharyngeal/nasopharyngeal aspirates, showed a statistically significant increase in the amount of anti-pertussis immunoglobulins in volunteers after vaccination and confirmed the protective potential and immunogenicity of the vaccine.
Таким образом, интраназальное введение добровольцу живых аттенуированных бактерий B. pertussis, предпочтительно в составе препарата ГамЖВК, обеспечивает оценку защитной эффективности кандидатной вакцины, основанную на более ранней элиминации бактерий из рото-\носоглотки иммунизированных добровольцев в сравнении с контрольными. Более ранняя элиминации бактерий из рото-\носоглотки добровольцев после введения аттенуированных бактерий возбудителя коклюша иммунизированным добровольцам, коррелирует с ускоренной выработкой специфических иммуноглобулинов IgG и IgA в сыворотке крови и IgA в назофарингеальных/ротоглоточных аспиратах, и дополнительно свидетельствует об уммуногенности и защитном потенциале кандидатной вакцины.Thus, intranasal administration of live attenuated B. pertussis bacteria to a volunteer, preferably as part of a GamFA preparation, provides an assessment of the protective efficacy of a candidate vaccine based on earlier elimination of bacteria from the oropharynx/nasopharynx of immunized volunteers compared to controls. Earlier elimination of bacteria from the oropharynx/nasopharynx of volunteers after administration of attenuated whooping cough bacteria to immunized volunteers correlates with accelerated production of specific IgG and IgA immunoglobulins in blood serum and IgA in nasopharyngeal/oropharyngeal aspirates, and additionally indicates the ummunogenicity and protective potential of the candidate vaccine.
Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is further illustrated by the following examples.
Примеры.Examples.
Лекарственная форма: ГамЖВК - лиофилизат для приготовления суспензии в растворе натрия хлорида 0,9% для интраназального введения.Dosage form: GamZHVK - lyophilizate for suspension in sodium chloride solution 0.9% for intranasal administration.
Способ применения и дозы:Dosage and administration:
В исследовании участвовали 49 добровольцев, включая 10 человек получивших плацебо. Добровольцам вводили исследуемый препарат/плацебо интраназально, капельным методом дважды с интервалом 2 месяца, оба раза в дозе (4-5)×109 КОЕ.The study involved 49 volunteers, including 10 people who received a placebo. Volunteers were administered the study drug/placebo intranasally, drip method twice with an interval of 2 months, both times at a dose of (4-5)×10 9 CFU.
Спустя 60±2 дня после первой инокуляции препарата/плацебо добровольцам повторно вводили ту же дозу препарата/плацебо60±2 days after the first drug/placebo inoculation, volunteers were re-infused with the same dose of drug/placebo
Исследования проводили на здоровых добровольцах, в крови которых не было выявлено IgM (IgM<14 U/мл), а значения IgG≤45 U/мл.The studies were carried out on healthy volunteers, in whose blood no IgM was detected (IgM<14 U/ml), and IgG values ≤45 U/ml.
Интраназальная двукратная вакцинация добровольцев препаратом ГамЖВК в дозе 4-5×109 КОЕ показала хорошую переносимость и благоприятный профиль безопасности (Синяшина Л.Н., Сёмин Е.Г., Медкова А.Ю. и др. Доклиническое исследование токсичности и безопасности кандидатной живой коклюшной вакцины интраназального применения. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2018; 17(6))Intranasal double vaccination of volunteers with GamZHVA at a dose of 4-5×10 9 CFU showed good tolerance and a favorable safety profile (Sinyashina L.N., Semin E.G., Medkova A.Yu. et al. Preclinical study of toxicity and safety of the candidate live pertussis vaccine for intranasal use. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2018; 17(6))
Плацебо - стерильный лиофилизат стабилизатора для последующего растворения в 0,9% натрия хлорида для инъекций. 10% раствор сахарозы и 1% раствор желатины для стабилизации аттенуированных бактерий B. pertussis 4MKS в процессе высушивания и хранения. После высушивания суспензии бактерий и стабилизатора - таблеткообразная масса белого или светло-желтого цвета во флаконе для приготовления суспензии в 0,9% растворе натрия хлорида. Во флаконе содержится 0,1 г сахарозы и 0,01 г желатины.Placebo - sterile stabilizer lyophilisate for subsequent dissolution in 0.9% sodium chloride for injection. 10% sucrose solution and 1% gelatin solution to stabilize attenuated B. pertussis 4MKS bacteria during drying and storage. After drying the suspension of bacteria and the stabilizer - a tablet-like mass of white or light yellow color in a vial for the preparation of a suspension in a 0.9% sodium chloride solution. The vial contains 0.1 g of sucrose and 0.01 g of gelatin.
Статистическую обработку данных по эффективности иммунного ответа на введение ГамЖВК проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Нормальность распределения оценивали с помощью KS теста. Для статистической обработки и оценки достоверности различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. При оценке гуморального ответа определяли достоверность различий измеряемых параметров в контрольных точках с их значениями в нулевой точке (до вакцинации) среди добровольцев, получивших плацебо вакцину разными методами, после первой и второй вакцинации. Для оценки достоверности различий между сравниваемыми группами для каждой контрольной точки проводили групповой анализ с использованием множественного t-тестаStatistical processing of data on the effectiveness of the immune response to the introduction of GamFA was performed using the GraphPad Prism software. Distribution normality was assessed using the KS test. For statistical processing and assessment of the significance of differences between groups, the nonparametric Mann-Whitney test was used. When evaluating the humoral response, the significance of differences in the measured parameters at the control points with their values at the zero point (before vaccination) among volunteers who received the placebo vaccine by different methods after the first and second vaccinations was determined. To assess the significance of differences between the compared groups for each control point, a group analysis was performed using a multiple t-test
Пример 1. Определение скорости элиминации аттенуированных бактерий в носоглотке добровольцев после одно- и двукратного интраназального применения препарата ГамЖВК.Example 1. Determination of the rate of elimination of attenuated bacteria in the nasopharynx of volunteers after single and double intranasal administration of the GamFA preparation.
Назофарингеальные/ротоглоточные мазки исследовались для определения бактерий методом посева и ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) (Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н., и др. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis. Детские инфекции. 2010; №4:19-22.). Аспират из ротоглотки забирали ротоглоточным тампоном на деревянной палочке, а аспират из носоглотки гибким носоглоточным зондом.Nasopharyngeal/oropharyngeal swabs were studied for the detection of bacteria by culture and real-time PCR (RT PCR) (Medkova A.Yu., Alyapkina Yu.S., Sinyashina L.N., et al. The prevalence of erased forms of pertussis and analysis of the phase states of bacteria Bordetella pertussis, Children's Infections, 2010; No. 4:19-22). Oropharyngeal aspirate was taken with an oropharyngeal swab on a wooden stick, and nasopharyngeal aspirate was taken with a flexible nasopharyngeal probe.
Материал с зондов смывали в 0,5 мл физиологического раствора, смывы тщательно суспендировали с помощью пипетки и вортекса, центрифугировали 10 минут на микроцентрифуге типа Эпендоф при 7000 об/мин. Осадок использовали для выделения ДНК и ПЦР анализа, а супернатанты для определения содержания секреторных IgA.The material from the probes was washed off in 0.5 ml of physiological saline, the washings were carefully suspended using a pipette and vortex, and centrifuged for 10 minutes in an Ependoff type microcentrifuge at 7000 rpm. The precipitate was used for DNA isolation and PCR analysis, and the supernatants were used to determine the content of secretory IgA.
Клинический материал забирают натощак, до применения полоскания или других видов исследования при хорошем освещении. Взятие материала проводится заднеглоточным тампоном со слизистой задней стенки ротоглотки и назофарингеальным зондом со слизистой носоглотки. Все процедуры выполняли в соответствии с СП3.1.2.3162-14 и рекомендацией ВОЗ [36].Clinical material is taken on an empty stomach, before the use of rinsing or other types of research in good light. The material is taken with a posterior pharyngeal swab from the mucosa of the posterior wall of the oropharynx and a nasopharyngeal probe from the nasopharyngeal mucosa. All procedures were performed in accordance with SP3.1.2.3162-14 and the WHO recommendation [36].
Выявление бактерий B. pertussis методом высева на питательную среду.Detection of B. pertussis bacteria by seeding on a nutrient medium.
Материал заднеглоточного мазка, сразу после взятия от добровольца, переносили на среду КУА с кровью методом штрихования. Бактерий B. pertussis культивировали на твердой питательной среде КУА или КУА с добавлением 15% дефибринированной крови барана в течение 3-5 суток (МУК 4.2.2317-08). Для посева использовали готовую среду КУА производства ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Дефибринированная кровь барана получена из ООО «ЭКОлаб М».The material of the posterior pharyngeal smear, immediately after taking it from a volunteer, was transferred to the AMC medium with blood by the streak method. B. pertussis bacteria were cultivated on a solid nutrient medium AMC or AMC with the addition of 15% defibrinated sheep blood for 3-5 days (MUK 4.2.2317-08). For inoculation, we used the ready-made AMC medium produced by the Federal State Budgetary Institution “National Research Center for Microbiology named after N.N. N.F. Gamaleya" of the Ministry of Health of Russia. Defibrinated sheep blood was obtained from ECOlab M LLC.
Выросшие колонии тестировали с помощью ПЦР, визуально на наличие зон гемолиза и соответствие морфологии колоний бактерий B. pertussis.The grown colonies were tested by PCR, visually for the presence of hemolysis zones and the conformity of the morphology of B. pertussis bacterial colonies.
Количественное определение ДНК B. pertussis в аспиратах методом ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ).Quantitative determination of B. pertussis DNA in aspirates by real-time PCR (RT-PCR).
Для молекулярно биологического анализа использовали ДНК, выделенную из бактерий и смывов заднеглоточных мазков или назофарингеальных зондов (аспиратов). Осадки препаратов после центрифугирования обрабатывали раствором гуанидинтиоцианата с последующей сорбцией ДНК на магнитном сорбенте фирмы «Promega» США [Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н., и др. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis. Детские инфекции. 2010; №4:19-22.]. Для определения количества геном-эквивалентов ДНК B. pertussis в аспиратах использована разработанная и валидированная авторами тест-система ПЦР РВ [Нестерова Ю.В., Медкова А.Ю., Бабаченко И. Проблема персистенции Bordetella pertussis в условиях массовой вакцинопрофилактики. Материалы всероссийского ежегодного конгресса «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика». Журнал инфектологии. 2017; Т9, №4:85].For molecular biological analysis, we used DNA isolated from bacteria and washings of posterior pharyngeal swabs or nasopharyngeal probes (aspirates). Precipitates of preparations after centrifugation were treated with a solution of guanidine thiocyanate, followed by DNA sorption on a magnetic sorbent from Promega, USA [Medkova A.Yu., Alyapkina Yu.S., Sinyashina L.N., et al. Bordetella pertussis. Children's infections. 2010; No. 4:19-22.]. To determine the number of genome equivalents of B. pertussis DNA in aspirates, we used the RT PCR test system developed and validated by the authors [Nesterova Yu.V., Medkova A.Yu., Babachenko I. The problem of persistence of Bordetella pertussis under conditions of mass vaccination. Materials of the All-Russian annual congress "Infectious diseases in children: diagnosis, treatment and prevention". Journal of Infectology. 2017; T9, No. 4:85].
ДНК аттенуированных бактерий B. pertussis зарегистрирована через 1 час и через 24 часа после первой и повторной инокуляции в образцах от всех добровольцев, получивших аттенуированные бактерии. Во всех случаях, бактерии обнаруживали и при посевах материала аспиратов.DNA of attenuated B. pertussis bacteria was recorded 1 hour and 24 hours after the first and second inoculation in samples from all volunteers who received attenuated bacteria. In all cases, bacteria were also detected during inoculation of aspirate material.
Для дальнейшего анализа в качестве числа ГЭ использовали среднее из значений, определенных в аспирате из носа- и ротоглотки.For further analysis, the average of the values determined in the aspirate from the nose and oropharynx was used as the number of GE.
Результаты исследования представлены на Фиг. 1 и в табл. 1а, б. Фиг. 1 представляет динамику изменения абсолютного числа ГЭ после однократного и двукратного интраназального введения препарата. Результаты статистической обработки данных представлены в табл. 2. В таблице 1 представлены уровни достоверности отличия значений числа ГЭ, обнаруженных у иммунизированных добровольцев и добровольцев, получивших плацебо. Из данных, представленных на Фиг. 1 и в таблицах 1а и 1б следует, что после повторной вакцинации уже на 7-е сутки достоверные различия по количеству ГЭ между вакцинированными добровольцами и группой плацебо отсутствуют, тогда как после первой вакцинации содержание ГЭ B. pertussis достоверно выше, чем в плацебо вплоть до 14 суток. Таким образом, достоверным в сравнении с плацебо, можно считать элиминацию аттенуированных бактерий на 2-7 сутки после повторной вакцинации в сравнении с 14-28 суками после первой вакцинации. Микробиологическим методом бактериальные колонии зарегистрированы только спустя 1 час, 7 и 14 дней после первого введения ГамЖВК и через 1 час после повторного введения.The results of the study are presented in Fig. 1 and in table. 1a, b. Fig. 1 shows the dynamics of changes in the absolute number of GE after single and double intranasal administration of the drug. The results of statistical data processing are presented in Table. 2. Table 1 presents the significance levels of the difference in the number of GEs found in immunized volunteers and volunteers who received placebo. From the data shown in Fig. 1 and in tables 1a and 1b it follows that after re-vaccination already on the 7th day there are no significant differences in the amount of GE between vaccinated volunteers and the placebo group, whereas after the first vaccination the content of B. pertussis GE is significantly higher than in placebo up to 14 days. Thus, the elimination of attenuated bacteria on days 2-7 after revaccination can be considered significant in comparison with placebo, compared with 14-28 females after the first vaccination. By the microbiological method, bacterial colonies were registered only 1 hour, 7 and 14 days after the first injection of GamZHVA and 1 hour after the second injection.
Эти результаты доказывают более раннее выведение аттенуированных бактерий после повторного интраназального введения.These results support earlier clearance of attenuated bacteria after repeated intranasal administration.
Пример 2. Параметры гуморального иммунного ответа после однократного и двукратного интраназального введения препарата здоровым в сравнении с плацебо.Example 2. Parameters of the humoral immune response after a single and double intranasal administration of the drug to healthy people in comparison with placebo.
Оценку иммуногенности проводили в результате измерения количества IgG и IgA в сыворотке крови, IgA в назофарингеальных/ротоглоточных аспиратах и титра агглютинации бактерий возбудителя коклюша сыворотки крови иммунизированных и контрольных добровольцев (РА).Immunogenicity was assessed by measuring the amount of IgG and IgA in blood serum, IgA in nasopharyngeal/oropharyngeal aspirates and the agglutination titer of pertussis pathogen bacteria in the blood serum of immunized and control volunteers (RA).
Количество специфических антител к возбудителю коклюша определяли с помощью ИФА в соответствии с инструкцией производителя тест-систем RIDASCREEN® Bordetella IgG (r-biopharm, Lot: 11037), RIDASCREEN® Bordetella IgM (r-biopharm, Lot: 12426),The amount of specific antibodies to the whooping cough pathogen was determined using ELISA in accordance with the manufacturer's instructions for test systems RIDASCREEN® Bordetella IgG (r-biopharm, Lot: 11037), RIDASCREEN® Bordetella IgM (r-biopharm, Lot: 12426),
IgA- и IgG-антитела к антигенам В. pertussis определяли в сыворотке крови добровольцев методом ELISA с использованием коммерческих наборов RIDASCREEN® Bordetella IgM (r-biopharm, Lot: 12426), RIDASCREEN® Bordetella IgA (r-biopharm, Lot: 13316), RIDASCREEN® Bordetella IgG (r-biopharm, Lot: 11037) соответственно. Анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя.IgA and IgG antibodies to B. pertussis antigens were determined in the blood serum of volunteers by ELISA using commercial kits RIDASCREEN® Bordetella IgM (r-biopharm, Lot: 12426), RIDASCREEN® Bordetella IgA (r-biopharm, Lot: 13316), RIDASCREEN® Bordetella IgG (r-biopharm, Lot: 11037) respectively. The assay was performed according to the manufacturer's instructions.
Определение уровня специфических антител IgG и IgA (в сыворотке крови и рото/назафарингеальных секретах) проводили до приема препарата, на 8, 15, 29, 60 дни исследования после первого и повторного введения препарата.Determination of the level of specific IgG and IgA antibodies (in blood serum and roto/nasopharyngeal secretions) was carried out before taking the drug, on
В те же сроки определяли антитела IgA в смывах ротоглоточных и назофарингеальных мазков с использованием коммерческой тест-системы RIDASCREEN® Bordetella IgA, предназначенной для определения IgA в сыворотке крови. Определение проводили в соответствии с инструкциями производителя с одним изменением. Смывы для проведения реакции и определения оптической плотности (ОП) разводили в 2 раза.At the same time, IgA antibodies were determined in swabs from oropharyngeal and nasopharyngeal swabs using a commercial RIDASCREEN® Bordetella IgA test system designed to determine IgA in blood serum. The determination was carried out according to the manufacturer's instructions with one change. Washouts for carrying out the reaction and determining the optical density (OD) were diluted 2 times.
На Фиг. 2, 3 виден выраженный рост уровня IgG в крови добровольцев после вакцинации. Более чем двукратное увеличение IgG регистрируется на 14 сутки. К 28 дню, IgG возрастает примерно в 3 раза. Рост уровня IgG продолжается во все последующие сроки и достигает максимума на 74 сутки (на 14 сутки после повторного введения препарата).On FIG. 2, 3 shows a pronounced increase in the level of IgG in the blood of volunteers after vaccination. More than a twofold increase in IgG is recorded on the 14th day. By
После повторной введения препарата достоверный рост IgG регистрируется уже на 7 и увеличивается до значений выше 4-х крат к 14 суткам, тогда как после первого введения препарата достоверный рост регистрируется только на 14 сутки. Приведенные результаты свидетельствуют о выраженном бустерном эффекте повторной вакцинации и коррелируют с выявленной более ранней элиминацией бактерий после их повторного введения. Значения IgG в сыворотке крови добровольцев, получивших плацебо, остаются неизменными на протяжении всего срока наблюдения. Данные таблицы 3 подтверждают вывод графического анализа результатов и демонстрируют, что достоверный рост значений IgG в сыворотке крови после интраназального введения препарата в сравнении с плацебо регистрируется уже на 7 сутки после вакцинации.After repeated administration of the drug, a significant increase in IgG is recorded already by 7 and increases to values above 4 times by 14 days, whereas after the first injection of the drug, a significant increase is recorded only on
Представленные результаты показывают достоверный рост уровня IgG после первой и повторной вакцинации. Максимальный эффект достигается после повторного введения аттенуированных бактерий.The presented results show a significant increase in IgG levels after the first and second vaccinations. The maximum effect is achieved after re-introduction of attenuated bacteria.
Уровень IgA оценивали с использованием тех же подходов, что и уровень IgG. Результаты исследования приведены на Фиг. 4, 5 и в таблице 4. Из полученных данных видно, что на 14-е сутки после вакцинации отмечается достоверное увеличение уровня специфических антител в сыворотке добровольцев. После ревакцинации, как и в случае с IgG наблюдается бустерный эффект, проявляющийся в росте IgA уже на 7 сутки после повторного введения препарата и более чем 10 кратном увеличении значения IgA в сравнении с довакцинным уровнем.The IgA level was assessed using the same approaches as the IgG level. The results of the study are shown in Fig. 4, 5 and in table 4. From the data obtained, it can be seen that on the 14th day after vaccination, there is a significant increase in the level of specific antibodies in the serum of volunteers. After revaccination, as in the case of IgG, a booster effect is observed, which manifests itself in the growth of IgA already on the 7th day after repeated administration of the drug and a more than 10-fold increase in the IgA value compared to the pre-vaccination level.
Таким образом, авторами отмечено увеличение IgA гуморального иммунного ответа после первого интраназального введения препарата здоровым добровольцам и его усиление при повторном введении препарата (бустерный эффект).Thus, the authors noted an increase in the IgA humoral immune response after the first intranasal administration of the drug to healthy volunteers and its increase with repeated administration of the drug (booster effect).
Для определения IgA в аспиратах использовали сухие назофарингеальные и ротоглоточные зонд, как описано в разделе "Материалы и методы". Материал с зондов смывали в 0,5 мл физиологического раствора, смывы тщательно суспендировали с помощью пипетки и вортекса, центрифугировали 10 минут на микроцентрифуге типа Эпендоф при 7000 об/мин. Осадок использовали для выделения ДНК и ПЦР анализа, а супернатанты для определения содержания секреторных IgA.Dry nasopharyngeal and oropharyngeal probes were used to determine IgA in aspirates, as described in the Materials and Methods section. The material from the probes was washed off in 0.5 ml of physiological saline, the washings were carefully suspended using a pipette and vortex, and centrifuged for 10 minutes in an Ependoff type microcentrifuge at 7000 rpm. The precipitate was used for DNA isolation and PCR analysis, and the supernatants were used to determine the content of secretory IgA.
Для определения секреторных IgA использовали ту же тест систему, что и для определения IgA в сыворотке крови - RIDASCREEN® Bordetella IgA (r-biopharm, Lot: 14210). Определение проводили в соответствии с инструкциями производителя с одним изменением. Опытным путем было подобрано разведение смывов 1/2 раза, тогда как для сывороток рекомендуется 1/100. Поскольку указанные наборы не имеют калибровочных образцов, для количественной оценки содержания IgA в смывах полученный результат делили на 50 (что соответствует 50-картно меньшему разведению образца в сравнении с классической постановкой). Отсутствие калибровки, стандартных образцов и положительных контролей, с нашей точки зрения, позволяет использовать коммерческие наборы только для регистрации изменения количества секреторных IgA в динамике, а не их абсолютных значений.To determine secretory IgA, the same test system was used as for the determination of IgA in blood serum - RIDASCREEN® Bordetella IgA (r-biopharm, Lot: 14210). The determination was carried out according to the manufacturer's instructions with one change. Empirically, a 1/2-fold dilution of washes was selected, while 1/100 is recommended for sera. Since these kits do not have calibration samples, to quantify the content of IgA in washings, the result obtained was divided by 50 (which corresponds to a 50-cart lower dilution of the sample compared to the classical setting). The absence of calibration, standard samples, and positive controls, in our opinion, allows using commercial kits only to record changes in the amount of secretory IgA over time, and not their absolute values.
На первом этапе IgA определяли отдельно в супернатантах, полученных после смыва назофарингеальных и ротоглоточных зондов. Для анализа использовали среднее, либо максимальное из двух измеренных значений IgA. Значительной разницы в результатах при использовании того или иного выбора выявлено не было, однако достоверность отличий медиан IgA некоторых группах сравнения оказалась выше при использовании максимального из двух измеренных значения IgA. Выбор максимальных значений представляется логичным, так как нас интересует возможность максимального сбора секрета от каждого добровольца, независимо от того как он собран. По этой причине представленный ниже анализ включает максимальный результаты измерения, полученный в одном из двух собранных аспиратов.At the first stage, IgA was determined separately in supernatants obtained after washing the nasopharyngeal and oropharyngeal probes. The average or maximum of the two measured IgA values was used for analysis. There was no significant difference in the results when using one or another choice, however, the significance of differences in median IgA in some comparison groups was higher when using the maximum of the two measured IgA values. The choice of maximum values seems logical, since we are interested in the possibility of maximum collection of the secret from each volunteer, regardless of how it was collected. For this reason, the analysis below includes the maximum measurement obtained from one of the two collected aspirates.
На Фиг. 6, 7 представлены результаты анализа секреторных антител IgA в смывах. Достоверность различия медиан IgA представлены в таблице 5.On FIG. 6, 7 show the results of the analysis of secretory IgA antibodies in washings. The significance of differences in median IgA are presented in Table 5.
Из приведенных Фигур видно, что максимальный уровень секреторных антител IgA достигается при интраназальном введении препарата ГамЖВК на 28 сутки после первой и повторной вакцинации. Достоверные отличия в приросте содержания секреторных антител у вакцинированных в сравнении с плацебо наблюдаются, начиная с 7 дня после первого и повторного введения аттенуированных бактерий.It can be seen from the Figures that the maximum level of secretory IgA antibodies is achieved with the intranasal administration of the GamZHVA preparation on the 28th day after the first and repeated vaccinations. Significant differences in the increase in the content of secretory antibodies in vaccinated compared with placebo are observed starting from
Таким образом, авторами установлено, что интраназальное введение кандидатной вакцины добровольцам приводит к росту специфических секреторных иммуноглобулинов в носо-/ротоглотке здоровых добровольцев. Последующее введение аттенуированных тест-бактерий сопровождается дальнейшим ростом количества секреторных IgA. Наблюдающийся бустерный эффект свидетельствует об иммуногенности тестируемой кандидатной вакциныThus, the authors found that intranasal administration of the candidate vaccine to volunteers leads to the growth of specific secretory immunoglobulins in the nasopharynx/oropharynx of healthy volunteers. The subsequent introduction of attenuated test bacteria is accompanied by a further increase in the amount of secretory IgA. The observed booster effect indicates the immunogenicity of the tested candidate vaccine.
Пример 3. Изучение динамики изменения титра аглютинации сывороток крови добровольцев со временем после первой и второй вакцинации.Example 3. The study of the dynamics of changes in the titer of agglutination of the blood serum of volunteers over time after the first and second vaccination.
Определение титров агглютинации сыворотки крови добровольцев суспензии бактерий возбудителя коклюша (РА): до приема препарата, на 8, 15, 29, 60 дни исследования после первого и повторного введения препаратаDetermination of agglutination titers of blood serum of volunteers of a suspension of whooping cough (RA) bacteria: before taking the drug, on
Получение сыворотки кровиObtaining blood serum
Кровь у добровольцев забирали в вакуумные пробирки Vacuette с активатором свертывания крови (красная крышка). Пробирки центрифугировали 20 мин при 300g для уплотнения сгустка. Затем сыворотку крови отбирали по аликвотам в отдельные пробирки Eppendorf объемов 1,5 мл. Для определения антител в одну из пробирок добавляли 0,1% NaN3 для предотвращения бактериального пророста. Остальные аликвоты были заморожены. Для анализа в ELISA использовали незамороженные аликвоты сыворотки крови.Blood was taken from volunteers in Vacuette tubes with a blood clotting activator (red cap). The tubes were centrifuged for 20 min at 300g to compact the clot. Then the blood serum was aliquoted into separate 1.5 ml Eppendorf tubes. To detect antibodies, 0.1% NaN 3 was added to one of the tubes to prevent bacterial growth. The remaining aliquots were frozen. Non-frozen serum aliquots were used for ELISA analysis.
Агглютинацию бактерий В. pertussis сывороткой крови определяли с помощью тест-системы «Диагностикум коклюшный жидкий» производства БИОМЕД им. Мечникова (Россия).Agglutination of bacteria B. pertussis with blood serum was determined using the test system "Diagnosticum pertussis liquid" manufactured by BIOMED named after. Mechnikov (Russia).
Сыворотку разводили в 20, 40, 80, 160 раз, соответственно с кратностью равной 1 (:20), 2 (:40), 3 (:80) и 4 (:160). Положительным значением считалась агглютинация бактериальной суспензии, достигающая +++ в соответствии с рекомендациями производителяThe serum was diluted 20, 40, 80, 160 times, respectively, with a multiplicity of 1 (:20), 2 (:40), 3 (:80) and 4 (:160). Agglutination of the bacterial suspension, reaching +++ in accordance with the manufacturer's recommendations, was considered a positive value.
Динамика изменения титров агглютинации после первой и повторной вакцинаций представлена на Фиг. 8-10. Таблица 6 демонстрирует, что достоверные различия с плацебо в титре сыворотки в реакции агглютинации регистрируются, начиная с 7-х суток.The dynamics of changes in agglutination titers after the first and repeated vaccinations is shown in Fig. 8-10. Table 6 shows that significant differences from placebo in serum titer in the agglutination reaction are recorded starting from the 7th day.
Достоверные различия с плацебо в титре сыворотки в реакции агглютинации регистрируются, начиная с 7-х суток.Significant differences from placebo in serum titer in the agglutination reaction are recorded starting from the 7th day.
Рост числа добровольцев, сыворотка крови которых в каждой контрольной точке способна к агглютинации в разведениях больших, чем 1:80, представлена на Фиг. 10.The increase in the number of volunteers whose blood serum at each control point is capable of agglutination at dilutions greater than 1:80 is shown in Fig. 10.
Представленные результаты демонстрируют иммуногенность кандидатной вакцины при интраназальном введении добровольцам, проявляющуюся в индуцированном росте титров агглютинации сывороткой, титры агглютинации более 1:80 достигаются после повторного введения аттенуированных бактерий. При интраназальном способе вакцинации максимальное число добровольцев имеющих агглютинацию на +++ достигается к концу срока наблюдения у 94%.The presented results demonstrate the immunogenicity of the candidate vaccine when administered intranasally to volunteers, which manifests itself in an induced increase in serum agglutination titers, agglutination titers of more than 1:80 are achieved after repeated administration of attenuated bacteria. With the intranasal method of vaccination, the maximum number of volunteers with +++ agglutination is reached by the end of the observation period in 94%.
Таким образом, согласно изобретению, при анализе параметров гуморального иммунного ответа: специфических антител IgG и IgA в сыворотке крови, титров агглютинации бактерий возбудителя коклюша сывороткой крови иммунизированных добровольцев, секреторных специфических противококлюшных антител IgA в рото-/носоглоточных аспиратах, выявлена статистически достоверная динамика роста количества противококлюшных имуноглобулинов и титра агглютинации. Во всех случаях зарегистрирован достоверный бустерный эффект, выражавшийся в ускорении роста и увеличении абсолютного количества антител после повторного введения аттенуированных бактерий вакцинированным кандидатной вакциной добровольцам, что позволяет оценивать иммуногенность тестируемых кандидатных вакцин наряду с их защитной активностью.Thus, according to the invention, when analyzing the parameters of the humoral immune response: specific antibodies IgG and IgA in the blood serum, agglutination titers of pertussis pathogen bacteria in the blood serum of immunized volunteers, secretory specific antipertussis antibodies IgA in the oropharyngeal/nasopharyngeal aspirates, a statistically significant increase in the number of antipertussis immunoglobulins and agglutination titer. In all cases, a significant booster effect was registered, which was expressed in the acceleration of growth and an increase in the absolute number of antibodies after repeated administration of attenuated bacteria to volunteers vaccinated with a candidate vaccine, which makes it possible to evaluate the immunogenicity of the tested candidate vaccines along with their protective activity.
Выявленное статистически достоверное снижение времени элиминации бактерий из назофарингеальных/ротоглоточных аспиратов, после интраназального введения тестовых аттенуированных бактерий вакцинированным добровольцам, в сравнении с указанными сроками после первой вакцинации, демонстрирует защитные свойства вакцины относительно последующего контакта с инфекцией, проявляющисяе в более ранней элиминации бактерий из рото-\носоглотки добровольцев. Регистрации бустерного роста количества специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови и IgA в назальных аспиратах добровольцев демонстрирует иммуногенные свойства кандидатной вакцины.The revealed statistically significant decrease in the time of elimination of bacteria from nasopharyngeal/oropharyngeal aspirates, after intranasal administration of test attenuated bacteria to vaccinated volunteers, in comparison with the indicated periods after the first vaccination, demonstrates the protective properties of the vaccine regarding subsequent contact with infection, manifested in earlier elimination of bacteria from the oropharynx \Nasopharynx of volunteers. Registration of a booster increase in the amount of specific immunoglobulins in the blood serum and IgA in the nasal aspirates of volunteers demonstrates the immunogenic properties of the candidate vaccine.
Предлагаемые в изобретении способы оценки защитной активности и иммуногенности новых противококлюшных вакцин, основанный на интраназальном введении аттенуированных бактерий вакцинированным добровольцам и регистрации времени их выведения и наличия бустерного эффекта синтеза иммуноглобулинов, являются наиболее адекватными и максимально приближенным к эпидемиологическому методу. Использование заявленных способов позволяет сократить время и стоимость регистрации новых противококлюшных вакцин,The methods proposed in the invention for assessing the protective activity and immunogenicity of new pertussis vaccines, based on the intranasal administration of attenuated bacteria to vaccinated volunteers and recording the time of their excretion and the presence of a booster effect of immunoglobulin synthesis, are the most adequate and as close as possible to the epidemiological method. The use of the claimed methods allows to reduce the time and cost of registering new pertussis vaccines,
Claims (5)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021129929A RU2021129929A (en) | 2023-04-12 |
| RU2799018C2 true RU2799018C2 (en) | 2023-06-30 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007104451A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Institut Pasteur De Lille | Live attenuated bordetella strains as a single dose vaccine against whooping cough |
| RU2623314C2 (en) * | 2015-11-09 | 2017-06-23 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | Assessment method for protective potency of pertussis vaccines |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007104451A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Institut Pasteur De Lille | Live attenuated bordetella strains as a single dose vaccine against whooping cough |
| RU2623314C2 (en) * | 2015-11-09 | 2017-06-23 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | Assessment method for protective potency of pertussis vaccines |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| АЛЕКСЕЕВА И.А., ПЕРЕЛЫГИНА О.В. "Сравнительный анализ использования цельноклеточных и бесклеточных коклюшных вакцин для профилактики коклюшной инфекции"; Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017, т.17, N 4, с. 207-215. * |
| МЕДКОВА А.Ю. и др. "Клинические исследования безопасности и переносимости живой вакцины интраназального применения для профилактики коклюша"; Разработка и регистрация лекарственных средств, 2021, т.10, N 1, с.114-119. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Terreri et al. | Persistent B cell memory after SARS-CoV-2 vaccination is functional during breakthrough infections | |
| Simonsen et al. | Immunity against tetanus and effect of revaccination 25-30 years after primary vaccination | |
| Karasic et al. | Modification of otitis media in chinchillas rechallenged with nontypable Haemophilus influenzae and serological response to outer membrane antigens | |
| Germann et al. | An outbreak of mumps in a population partially vaccinated with the Rubini strain | |
| Schöndorf et al. | Tick-borne encephalitis (TBE) vaccination: applying the most suitable vaccination schedule | |
| CN109182167B (en) | Production process of high titer tuberculin skin test diagnostic reagent (PPD) | |
| Cox et al. | Further evaluation of higher potency vaccines for early protection of cattle against FMDV direct contact challenge | |
| Durack et al. | Effect of immunization on susceptibility to experimental Streptococcus mutans and Streptococcus sanguis endocarditis | |
| Quenee et al. | Plague in Guinea pigs and its prevention by subunit vaccines | |
| Chu et al. | T-cell proliferation assay for the detection of SARS-CoV-2-specific T-cells | |
| Jones et al. | Protection of lambs against experimental pneumonic pasteurellosis by transfer of immune serum | |
| RU2799018C2 (en) | METHODS FOR ASSESSING THE PROTECTIVE ACTIVITY AND IMMUNOGENICITY OF PERTUSSIS VACCINES IN HUMANS, THE USE OF LIVE PERTUSSIS RECOMBINANT VACCINE GamFA | |
| Sampaio et al. | Measles, rubella, mumps and Toxoplasma gondii antibodies in saliva of vaccinated students of schools and universities in São Paulo City, Brazil | |
| Wenzel et al. | Field trial of an inactivated Mycoplasma pneumoniae vaccine. I. Vaccine efficacy | |
| US10022458B2 (en) | Animal model protocol, diagnostic, therapeutic and vaccine against digital dermatitis | |
| Wang et al. | Evaluation of a Brucella melitensis mutant deficient in O-polysaccharide export system ATP-binding protein as a rough vaccine candidate | |
| Zhao et al. | Detection and isolation of Yersinia pestis without fraction 1 antigen by monoclonal antibody in foods and water | |
| Fernandes et al. | Robust specific RBD responses and neutralizing antibodies after ChAdOx1 nCoV-19 and CoronaVac vaccination in SARS-CoV-2–seropositive individuals | |
| Araj | Brucella | |
| Rastawicki et al. | The level of protective post-vaccination antibodies in NIPH-NIH employees after administration of Pfizer vaccine against COVID-19 | |
| CA2233570A1 (en) | Detection, prevention and treatment of papillomatous digital dermatitis | |
| Paul et al. | Rotavirus-specific salivary and fecal IgA in Indian children and adults | |
| Mascart et al. | to pertussis and pertussis vaccines | |
| RU2640192C1 (en) | Elisa test system for segological diagnostics of cattle nodulous dermatitis - dermatitis nodularis bovum | |
| KR20160099223A (en) | Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine and preparation method |