RU2603729C2

RU2603729C2 - Recombinant vaccine for prophylaxis of hepatitis b (versions)

Info

Publication number: RU2603729C2
Application number: RU2015115520/10A
Authority: RU
Inventors: Михаил Александрович Крымский; Иван Андреевич Борисов; Михаил Симеонович Яковлев; Владимир Алексеевич Мельников
Original assignee: Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех"
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2016-11-27
Also published as: RU2015115520A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, namely to genetic engineering. Recombinant vaccine for prevention viral hepatitis B is disclosed. Vaccine is created on basis of hepatitis B virus surface antigen with mutation G145R (ESC-Ag) produced by cultivation of recombinant yeast strain H. polymorpha KBT-11/pEMmulti-7 or H. polymorpha KBT-12/pEMmono-4, or H. polymorpha KBT-14/pEMmalt-8, or H. polymorpha KBT-14/pEMmono2. Vaccine can contain mixture of ESC-Ag, HBsAg serotype of "ayw" and/or "adw" in equal portions. Vaccine can contain only hepatitis B virus antigen with mutation G145R (ESC-Ag).

EFFECT: prepared vaccines are highly immunogenic, non-toxic, have no side effects.

4 cl, 7 dwg, 1 tbl, 8 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генной инженерии, и касается рекомбинантной вакцины для профилактики вирусного гепатита В, которая содержит в своем составе в качестве активного компонента рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), имеющий мутацию G145R, и может содержать рекомбинантный HBsAg дикого типа серотипа ayw и/или adw.The invention relates to the field of biotechnology, namely genetic engineering, and relates to a recombinant vaccine for the prevention of viral hepatitis B, which contains as its active component a recombinant surface antigen of hepatitis B virus (HBsAg) having a mutation G145R, and may contain recombinant wild HBsAg type serotype ayw and / or adw.

Гепатит В - одна из самых распространенных вирусных инфекций, которая ведет к тяжелым последствиям таким, как хронический гепатит, цирроз печени и гепатокарцинома. Успешное применение вакцин против гепатита В существенно улучшило эпидемиологическую обстановку по гепатиту В. В тоже время в последние годы было установлено, что имеет место распространение мутантных форм вируса гепатита В (ВГВ), которые не выявляются тестами иммунодетекции HBsAg и «ускользают» от защитного действия поствакцинального иммунитета. Такие мутантные формы ВГВ, отличительной чертой которых является экспрессия HBsAg с атипичными серологическими свойствами, были названы «ускользающими» («эскейп», «escape») мутантами.Hepatitis B is one of the most common viral infections, which leads to serious consequences such as chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocarcinoma. The successful use of hepatitis B vaccines has significantly improved the epidemiological situation for hepatitis B. At the same time, in recent years, it has been established that there is a spread of mutant forms of hepatitis B virus (HBV), which are not detected by HBsAg immunodetection tests and “escape” the protective effect of post-vaccination immunity. Such mutant forms of HBV, the hallmark of which is the expression of HBsAg with atypical serological properties, have been called “elusive” (“escape”) “mutants”.

Впервые существование таких мутантов ВГВ зарегистрировано в Италии. Позднее было показано (Carman W.F. et al., Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus, Lancet, 1990, v. 336, p. 325-329), что из 1590 лиц, вакцинированных против гепатита В, 32 (2%) оказались инфицированными ВГВ. У всех инфицированных определялось одновременное присутствие в крови и HBsAg, и антител к HBsAg. Вирус, выделенный из крови одного из инфицированных, оказался «ускользающим» мутантом ВГВ, отличающимся по последовательности нуклеотидов в геноме от дикого типа.For the first time, the existence of such HBV mutants was recorded in Italy. It was later shown (Carman WF et al., Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus, Lancet, 1990, v. 336, p. 325-329) that of 1590 individuals vaccinated against hepatitis B, 32 (2%) were infected with HBV. In all infected, the simultaneous presence in the blood of both HBsAg and antibodies to HBsAg was determined. The virus isolated from the blood of one of the infected turned out to be a “elusive” HBV mutant, which differs from the wild type in the nucleotide sequence in the genome.

Изменение нуклеотидной последовательности в S-регионе генома ВГВ и последующие аминокислотные замены приводят к конформационным изменениям вирусных белков оболочки. Эти изменения способны вызвать пространственные затруднения во взаимодействии антигенных эпитопов с нейтрализующими антителами, таким образом позволяя ускользать мутантным штаммам из-под вакцинного и иммунного надзора. Особенно важны для ускользания вируса от протективного действия вакцин мутации «а» детерминанты, которая локализована между 124-147 аминокислотными остатками в пределах главной гидрофильной петли (100-170 ао) (Weber В., Genetic variability of the S gene of hepatitis В virus: clinical and diagnostic impact, J.Clin. Virol., 2005, v. 32, p. 102-112).A change in the nucleotide sequence in the S region of the HBV genome and subsequent amino acid substitutions lead to conformational changes in the viral envelope proteins. These changes can cause spatial difficulties in the interaction of antigenic epitopes with neutralizing antibodies, thus allowing the mutant strains to escape from vaccine and immune surveillance. Especially important for the virus to escape from the protective effect of the vaccines are the mutations “a” of the determinant, which is located between 124-147 amino acid residues within the main hydrophilic loop (100-170 ao) (Weber B., Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact, J. Clin. Virol., 2005, v. 32, p. 102-112).

Наиболее важной среди серологически значимых аминокислотных замен является замена глицина в положении 145 на аргинин (G145R), вызванная точечной мутацией в позиции 587 нуклеотидной последовательности HBsAg дикого типа. Этот мутант стабилен на протяжении долгого времени и может сохранять способность к репликации несколько лет. Он обладает способностью к горизонтальной передаче другим людям. Факты внутрисемейной передачи были отмечены у 3-х из 10-ти носителей мутанта G145R, несмотря на присутствие в высоких концентрациях антител к HBsAg в крови всех заразившихся (Oon C.J. et al., Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis В virus surface antigen mutant G145R, J.Infect., 2000, v.41, p. 260-26400). Частота мутаций G145R может колебаться от 0,4 до 5%. При динамическом наблюдении и определении мутантных форм среди новорожденных исследователи Тайваня выявили увеличение числа детей, инфицированных мутантными штаммами ВГВ. Так, в 1984 г. оно составило 7,8%, в 1989 г. - 19,6%, в 1994 г. - 28,1% (Hsu Ну et al., Hepatology, 1999, v. 30(5), p. 1312-7).The most important among serologically significant amino acid substitutions is the replacement of glycine at position 145 with arginine (G145R), caused by a point mutation at position 587 of the wild-type HBsAg nucleotide sequence. This mutant is stable over time and can maintain replication ability for several years. He has the ability to horizontally transmit to other people. Intra-family transmission facts were noted in 3 out of 10 carriers of the G145R mutant, despite the presence of high concentrations of antibodies to HBsAg in the blood of all infected (Oon CJ et al., Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis B virus surface antigen mutant G145R, J.Infect., 2000, v. 41, p. 260-26400). The mutation frequency of G145R can range from 0.4 to 5%. During dynamic observation and determination of mutant forms among newborns, Taiwan researchers revealed an increase in the number of children infected with mutant HBV strains. So, in 1984 it amounted to 7.8%, in 1989 - 19.6%, in 1994 - 28.1% (Hsu Well et al., Hepatology, 1999, v. 30 (5), p. 1312-7).

На территории РФ, где широко распространены генотип D и серотип «ау», также выявлена циркуляция мутантных штаммов HBV, экспрессирующих HBsAg разных серотипов («ау» и «ad») с заменами G145R. Распространенность серологически значимой мутации G145R в московской области среди хронических носителей HBV составила 0,12%. (А.И. Баженов и др., Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2011, №5, с. 49-53). Учитывая высокий процент носительства HBV в человеческой популяции, выявленное количество мутантов HBV представляется значительным.In the territory of the Russian Federation, where genotype D and serotype “au” are widespread, the circulation of mutant HBV strains expressing HBsAg of different serotypes (“au” and “ad”) with G145R substitutions is also widespread. The prevalence of the serologically significant mutation G145R in the Moscow region among chronic HBV carriers was 0.12%. (A.I. Bazhenov et al., Epidemiology and Vaccine Prevention, 2011, No. 5, p. 49-53). Given the high percentage of HBV carriage in the human population, the detected number of HBV mutants appears to be significant.

Таким образом, «ускользающие» мутанты ВГВ G145R, представляя собой реплицирующие инфекционные вирусные мутанты, избегающие нейтрализующий иммунитет при вакцинации, основанной на нормальном HBsAg, могут быть причиной заболевания ВГ. Существование и распространение «ускользающих» мутантов создает серьезную проблему как для донорства, так и для эффективности современной стратегии вакцинации. В связи с этим существует необходимость в создании вакцины нового поколения против вируса гепатита В, которая обладает максимально широким, приближающимся к естественно индуцируемому спектром эпитопов, способных стимулировать развитие протективного ответа антителообразования как против отдельных субтипов ВГВ - ау и ad, так и против эпитопов мутанта G145R.Thus, the “elusive” HBV G145R mutants, which are replicating infectious viral mutants that avoid neutralizing immunity in vaccines based on normal HBsAg, can cause HBV disease. The existence and spread of “elusive” mutants poses a serious problem for both donation and the effectiveness of a modern vaccination strategy. In this regard, there is a need to create a new generation vaccine against hepatitis B virus, which has the widest, approaching a naturally induced spectrum of epitopes that can stimulate the development of a protective antibody response both against individual HBV subtypes - ay and ad, and against epitopes of the G145R mutant .

Затруднения, препятствующие созданию эффективных вакцин для профилактики гепатита В, вызываемого мутантным ВГВ G145R, связаны с разработкой оптимальных экспрессионных систем для продукции рекомбинантного HBsAg, содержащего мутацию G145R, и обладающего высокими иммуногенными свойствами.Difficulties preventing the development of effective vaccines for the prevention of hepatitis B caused by mutant HBV G145R are associated with the development of optimal expression systems for the production of recombinant HBsAg containing the G145R mutation and possessing high immunogenic properties.

Известно получение полипептида HBsAg, имеющего аминокислотную последовательность с заменой в позиции 145 глицина на аргинин рекомбинантным путем (US 7,038,035, 02.05.2006). Из крови пациента (ребенок из Китая) был изолирован мутантный вирус гепатита В, несущий мутацию в последовательности HBsAg, которая была обусловлена заменой в нуклеотидной последовательности в позиции 587-589. Геном выделенного мутантного вируса относился к «adw» субтипу. Чтобы получить мутантный белок HBsAg был сконструирован экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность с AGA в позиции 587-589, соответствующую последовательности изолированного штамма вируса. Сконструированный вектор интродуцировали в подходящие клетки-хозяева, в частности клетки млекопитающих. Полученный путем культивирования рекомбинантных клеток млекопитающих мутантный HBsAg имеет кажущуюся молекулярную массу 23 kDa в отличие от 25 kDa HBsAg дикого типа и обладает более высокой иммуногенностью. На основе мутантного HBsAg создана вакцина, содержащая эффективное количество антигена, которое определяется размером и формой полипептида, биоактивностью, способностью к биодеградации.It is known to obtain an HBsAg polypeptide having an amino acid sequence with substitution at position 145 of glycine for arginine by the recombinant route (US 7,038,035, 05/02/2006). A mutant hepatitis B virus was isolated from the blood of a patient (a child from China), carrying a mutation in the HBsAg sequence, which was caused by a substitution in the nucleotide sequence at positions 587-589. The genome of the isolated mutant virus belonged to the "adw" subtype. To obtain the mutant HBsAg protein, an expression vector was constructed containing the nucleotide sequence with AGA at position 587-589 corresponding to the sequence of an isolated virus strain. The constructed vector was introduced into suitable host cells, in particular mammalian cells. Mutant HBsAg obtained by culturing recombinant mammalian cells has an apparent molecular weight of 23 kDa as opposed to 25 kDa wild type HBsAg and has a higher immunogenicity. Based on the mutant HBsAg, a vaccine was created containing an effective amount of antigen, which is determined by the size and shape of the polypeptide, bioactivity, and biodegradability.

Thomas H.С. et al. в ряде патентов охарактеризовали вариант белка HBsAg с модифицированной детерминантой «а», в которой аминокислота глицин в позиции 145 заменена на аргинин (US 5,639,637, 1997), последовательность ДНК, кодирующую данный вариант белка (US 5,854,024, 1998), дрожжевой экспрессирующий вектор, включающий указанную последовательность (US 5,851,823, 1998), набор для диагностики антител против варианта HBsAg (US 5,989,865, 1999), антитело против варианта HBsAg (US 6,099,840, 2000).Thomas H.S. et al. in a number of patents, a variant of the HBsAg protein with a modified determinant “a” was characterized, in which the amino acid glycine at position 145 was replaced by arginine (US 5,639,637, 1997), the DNA sequence encoding this protein variant (US 5,854,024, 1998), a yeast expression vector including the specified sequence (US 5,851,823, 1998), a kit for the diagnosis of antibodies against the HBsAg variant (US 5,989,865, 1999), an antibody against the HBsAg variant (US 6,099,840, 2000).

Известна рекомбинантная вакцина (RU 2238105, 2004) для профилактики вирусного гепатита В, содержащая эффективное количество HBsAg серотипов «adw» и/или «ayw», полученных из штаммов дрожжей Pichia augusta VKPM Y-2412 и VKM Y-2924D, соответственно, адъювант и физиологически приемлемый разбавитель. При вакцинации HBsAg у здоровых людей индуцируется выработка специфических антител (анти-HBs), которые и обеспечивают иммунитет. Вакцину отличает высокая иммуногенность, нетоксичность, отсутствие побочных эффектов. Вакцина внедрена в практику здравоохранения и внесена в Государственный реестр лекарственных средств РФ. Недостатком вакцины, как и других вакцин, основанных на использовании рекомбинантного HBsAg, является их относительно узкая по сравнению с природными антигенами антигенная специфичность, поскольку у лиц, переболевших гепатитом В, в отличие от вакцинированных, индуцировались антитела, взаимодействующие с максимально серологически модифицированным мутантом G145R (одновременное инфицирование различными вирусами гепатита В). Таким образом, вакцина имеет более ограниченный спектр эпитопов, против которых индуцируются нейтрализующие антитела.Known recombinant vaccine (RU 2238105, 2004) for the prevention of viral hepatitis B containing an effective amount of HBsAg serotypes "adw" and / or "ayw" obtained from strains of the yeast Pichia augusta VKPM Y-2412 and VKM Y-2924D, respectively, adjuvant and physiologically acceptable diluent. When vaccinating HBsAg in healthy people, the production of specific antibodies (anti-HBs), which provide immunity, is induced. The vaccine is distinguished by high immunogenicity, non-toxicity, and the absence of side effects. The vaccine has been introduced into the practice of healthcare and is included in the State Register of Medicines of the Russian Federation. The disadvantage of the vaccine, as well as other vaccines based on the use of recombinant HBsAg, is their relatively narrow antigenic specificity compared to natural antigens, since in patients with hepatitis B, unlike those vaccinated, antibodies that interact with the most serologically modified G145R mutant ( simultaneous infection with various hepatitis B viruses). Thus, the vaccine has a more limited spectrum of epitopes against which neutralizing antibodies are induced.

Ближайшим аналогом является патент US 5,639,637, 1997, в котором описано получение варианта HBsAg, имеющего модифицированную детерминанту «а» с заменой глицина в положении 145 на аргинин, путем экспрессии кодирующего его гена в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Первоначально получали последовательность ДНК, кодирующую HBsAG серотипа «ау», которая содержала точечную мутацию, приводящую к замене кодона GGA, кодирующего глицин на кодон AGA, кодирующий аргинин, в позиции 145 полипептида HBsAg. Затем конструировали плазмиду pRIT13557, содержащую полученную последовательность, и этой плазмидой трансформировали дрожжевые клетки S. cerevisiae штамма DC5-cir⁰ (АТСС20820). После культивирования рекомбинантных дрожжевых клеток (Y1648) полученный вариант HBsAg выделяли, очищали и анализировали радиоиммунным и электронномикроскопическим методами. Было установлено присутствие сферических частиц, типичных для HBsAg, антигенность которых отличалась от таковой HBsAg дикого типа. Предложенная вакцина содержит вариант HBsAg (5-40 мкг/мл), гидроокись алюминия (адъювант), мертиолят натрия (консервант) в натрий-фосфатном буфере с рН 6,8, содержащим хлористый натрий. Вакцина может содержать HBsAg дикого типа.The closest analogue is US Pat. No. 5,639,637, 1997, which describes the preparation of an HBsAg variant having a modified determinant “a” replacing glycine at position 145 with arginine by expressing the gene encoding it in Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Initially, the DNA sequence encoding the HBsAG serotype “au” was obtained, which contained a point mutation, leading to the replacement of the GGA codon encoding glycine with the AGA codon encoding arginine at position 145 of the HBsAg polypeptide. The plasmid pRIT13557 containing the obtained sequence was then constructed, and the yeast cells of S. cerevisiae strain DC5-cir ⁰ (ATCC20820) were transformed with this plasmid. After cultivation of recombinant yeast cells (Y1648), the resulting HBsAg variant was isolated, purified and analyzed by radio-immune and electron-microscopic methods. The presence of spherical particles typical of HBsAg was found, the antigenicity of which differed from that of wild-type HBsAg. The proposed vaccine contains a variant of HBsAg (5-40 μg / ml), aluminum hydroxide (adjuvant), sodium thiolate (preservative) in sodium phosphate buffer with a pH of 6.8 containing sodium chloride. The vaccine may contain wild-type HBsAg.

К недостаткам использования системы экспрессии на основе Saccharomyces cerevisiae можно отнести нестабильность рекомбинантных клеток, связанную с относительно высокой частотой потерь автономной плазмиды при делении клеток, что требует постоянного контроля процесса культивирования и подтверждения стабильности используемой плазмиды. При культивировании штамма в неселективных для плазмиды условиях это приводит к накоплению клеток, не содержащих плазмиды и неспособных к синтезу целевого белка. Это существенно осложняет культивирование рекомбинантного штамма и увеличивает себестоимость целевого продукта. Для индукции экспрессии рекомбинантных белков используется достаточно дорогой реагент - галактоза, что увеличивает себестоимость целевого продукта. Данная вакцина в практическом здравоохранении не зарегистрирована, промыщленно не воспроизведена.The disadvantages of using an expression system based on Saccharomyces cerevisiae include the instability of recombinant cells associated with the relatively high frequency of autonomous plasmid losses during cell division, which requires constant monitoring of the cultivation process and confirmation of the stability of the used plasmid. When the strain is cultured under nonselective conditions for the plasmid, this leads to the accumulation of cells that do not contain plasmids and are unable to synthesize the target protein. This significantly complicates the cultivation of the recombinant strain and increases the cost of the target product. To induce the expression of recombinant proteins, a rather expensive reagent, galactose, is used, which increases the cost of the target product. This vaccine is not registered in practical health care, industrialized not reproduced.

Задачей изобретения является создание высокоиммуногенной вакцины против гепатита В, обладающей широким, приближающимся к естественному, спектром эпитопов, способной стимулировать развитие протективного ответа антителообразования как против отдельных субтипов ВГВ - «ау» и «ad», так против эпитопов мутанта G145R.The objective of the invention is the creation of a highly immunogenic vaccine against hepatitis B, with a broad, close to natural, spectrum of epitopes that can stimulate the development of a protective antibody response against both individual HBV subtypes - "ay" and "ad", and against epitopes of the mutant G145R.

Задача решена путем создания вакцины, содержащей комбинацию рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), и рекомбинантного HBsAg дикого типа серотипа «ayw» и/или «adw». В другом варианте вакцина в качестве активного компонента содержит только поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), имеющий мутацию G145R.The problem was solved by creating a vaccine containing a combination of a recombinant hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) having the G145R mutation (ESC-Ag) and a wild type recombinant ayw and / or adw serotype HBsAg. In another embodiment, the vaccine as the active component contains only the surface antigen of hepatitis B virus (HBsAg) having a mutation G145R.

Согласно изобретению, для получения рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), были созданы четыре различных рекомбинантных штамма дрожжей H. Polymorpha - KBT11/pEMmulti-7, КБТ12/pEMmono-4, КБТ14/pEMmalt-8, КБТ-14/рЕМmono2, каждый из которых представляет собой стабильный эффективный продуцент ESC-Ag, обладающего необходимыми биологическими свойствами (правильная конформация, иммуногенность, чистота) и низкой себесоимостью.According to the invention, four different recombinant H. Polymorpha yeast strains KBT11 / pEMmulti-7, KBT12 / pEMmono-4, KBT14 / pEMmalt-8, were created to produce a recombinant surface antigen of hepatitis B virus having the G145R mutation (ESC-Ag). KBT-14 / pEMmono2, each of which is a stable effective producer of ESC-Ag, which has the necessary biological properties (proper conformation, immunogenicity, purity) and low cost.

Для получения штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена метанолоксидазы {МОХ H. polymorpha) и селективным маркером (ген LEU2 S. cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма Н. polymorpha DL1-L (Sohn J.H. et. al., J Bacteriol. 1996 Aug; 178(15):4420-8. PMID:8755868). Для получения клонов, содержащих в геноме несколько копий плазмиды, применена процедура селекции множественной интеграции. По результатам проверки клонов, полученных в результате этой процедуры, на способность синтезировать белок ESC-Ag, был выделен трансформант с наибольшей продуктивностью. Т.к. искусственный ген интегрирован в геном дрожжей, т.е. находится в составе одной из хромосом, это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок. Полученный рекомбинантный штамм, содержащий несколько копий целевого гена под контролем промотора МОХ, позволяет добиваться более высоких уровней синтеза рекомбинантного белка ESC-Ag при более простых способах получения культур высокой плотности. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТН/pEMmulti-7. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.To obtain a producer strain of hepatitis B virus surface antigen having a G145R mutation (ESC-Ag), a plasmid containing a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of a promoter of the methanol oxidase gene {MOX H. polymorpha) and a selective marker (gene LEU2 S. cerevisiae) integrate into the genome of the recipient strain of H. polymorpha DL1-L (Sohn JH et. Al., J Bacteriol. 1996 Aug; 178 (15): 4420-8. PMID: 8755868). To obtain clones containing several copies of the plasmid in the genome, a multiple integration selection procedure was used. According to the results of testing the clones obtained as a result of this procedure for the ability to synthesize ESC-Ag protein, the transformant with the highest productivity was isolated. Because the artificial gene is integrated into the genome of yeast, i.e. It is part of one of the chromosomes, this ensures high mitotic stability of the strain, making it possible to optimize the conditions for its cultivation without taking into account the risk of accumulation of cells that have lost the ability to synthesize foreign protein. The resulting recombinant strain containing several copies of the target gene under the control of the MOX promoter allows to achieve higher levels of synthesis of the recombinant ESC-Ag protein with simpler methods for producing high density cultures. The strain was deposited on 05.20.2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBTN / pEMmulti-7. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Согласно изобретению, второй рекомбинантный штамм-продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), получали интеграцией в геном штамма DL1-L (H. polymorpha) одной копии синтетической последовательности ДНК, кодирующей ESC-Ag, под контролем промотора гена МОХ. Для этого в качестве реципиента был использован штамм DLT2, полученный в результате инактивации в штамме DL1-L генов МОХ и TRP3 интеграцией селективного маркера, гена LEU2 S. cerevisiae, аналогично тому, как это было сделано ранее (Bogdanova АЛ., Agaphonov M.О. et. al., Yeast, 1995 Apr 15; 11 (4):343-53, PMID:7785335). Это давало возможность с высокой эффективностью отбирать трансформанты, в которых интеграция синтетической последовательности происходила по механизму гомологичной рекомбинации с последовательностями локуса гена МОХ, в результате чего происходила замена кодирующей области этого гена на последовательность, кодирующую ESC-Ag. Уровень экспрессии ESC-Ag, который достигается у полученного таким образом штамма, подходит для увеличения доли антигена во фракции растворимых клеточных белков. Поскольку такой штамм содержит только одну копию рекомбинантного гена, интегрированную в строго определенный локус генома, реплика этого гена может быть получена при помощи полимеразной цепной реакции для контроля отсутствия в нем мутаций, которые могли образоваться в процессе его введения в геном дрожжей или при культивировании штамма-продуцента. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ12/pEMmono-4. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, a second recombinant hepatitis B virus surface antigen producer strain having the G145R mutation (ESC-Ag) was obtained by integrating into the genome of the DL1-L strain (H. polymorpha) one copy of the synthetic DNA sequence encoding ESC-Ag, under the control of the promoter MOX gene. For this, the DLT2 strain was used as a recipient, obtained by inactivation of the MOX and TRP3 genes in the DL1-L strain by integration of the selectable marker, the S. cerevisiae LEU2 gene, similarly to what was done earlier (Bogdanova AL., Agaphonov M.О. . et. al., Yeast, 1995 Apr 15; 11 (4): 343-53, PMID: 7785335). This made it possible to select transformants with high efficiency in which the synthetic sequence was integrated by the mechanism of homologous recombination with the MOX gene locus sequences, as a result of which the coding region of this gene was replaced by a sequence encoding ESC-Ag. The level of expression of ESC-Ag, which is achieved in the thus obtained strain, is suitable for increasing the proportion of antigen in the fraction of soluble cellular proteins. Since such a strain contains only one copy of the recombinant gene integrated into a strictly defined locus of the genome, a replica of this gene can be obtained using a polymerase chain reaction to control the absence of mutations in it that could have formed during its introduction into the yeast genome or during cultivation of the strain producer. The strain was deposited on 05/20/2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT12 / pEMmono-4. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Согласно изобретению, для получения еще одного рекомбинантного штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена мальтазы (MALI H. polymorpha) и селективным маркером (ген LEU2 S. cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма H. polymorpha DL1-L. Для получения клонов, содержащих в геноме несколько копий плазмиды, применена процедура селекции множественной интеграции. По результатам проверки полученных в результате этой процедуры клонов на способность синтезировать белок поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R, был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. Полученный рекомбинантный штамм, содержащий несколько копий целевого гена под контролем промотора MAL1, депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером KBT14/pEMmalt-8. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, to obtain another recombinant strain producing a surface hepatitis B virus antigen having a G145R mutation (ESC-Ag), a plasmid containing a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of the maltase gene promoter (H. polymorph MALI ) and a selective marker (S. cerevisiae LEU2 gene) are integrated into the genome of the recipient strain of H. polymorpha DL1-L. To obtain clones containing several copies of the plasmid in the genome, a multiple integration selection procedure was used. According to the results of testing the clones obtained as a result of this procedure for the ability to synthesize the hepatitis B virus surface antigen protein having the G145R mutation, a transformant that best meets the required properties was isolated. The resulting recombinant strain containing several copies of the target gene under the control of the MAL1 promoter was deposited on May 20, 2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT14 / pEMmalt-8. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Согласно изобретению, для получения 4-го рекомбинантного штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), в геном штамма DL1-L H. polymorpha последовательно интегрируют две экспрессионные кассеты, содержащие по одной копии нужного гена. Первая кассета содержит фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена МОХ (ген метанолоксидазы). Интеграция этой кассеты проходила по механизму гомологичной интеграции в локус гена МОХ. Вторая экспрессионная кассета содержит аналогичный ген ESC-Ag, но под контролем промотора гена DAK (ген кодирует дигидроксиацетон киназу) дрожжей Н. polymorpha. Интеграция этой кассеты проходила по механизму гомологичной интеграции в локус гена LEU2. В результате трансформации получают рекомбинантный штамм, содержащий одну копию целевого гена ESC-Ag под контролем промотора DAK и одну копию под контролем промотора МОХ. При этом искусственные гены интегрированы непосредственно в геном штамма-продуцента, т.е. находятся в составе хромосом дрожжей Н. polymorpha. Это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок. Кроме того, наличие в каждом из локусов интеграции только одной копии рекомбинантного гена с уникальной промоторной и терминаторной областью позволяет контролировать отсутствие мутаций этого гена в процессе его введения в геном и при культивировании штамма. Контроль за отсутствием мутаций осуществляют путем анализа нуклеотидной последовательности продуктов полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных специфическим последовательностям, фланкирующим кодирующую область рекомбинантного гена в каждом из локусов интеграции. Использование экспрессионных кассет с двумя разными промоторами {МОХ и DAK), максимальная активность которых достигается при разных условиях культивирования, обеспечивает большую равномерность синтеза продукта в процессе культивирования штамма. При этом не превышается уровень синтеза белка, который может привести к возможному нарушению эффективности укладки и, как следствие, снижению продуктивности штамма. В результате отбора клонов, способных синтезировать белок ESC-Ag, был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ-14/рЕМmono2. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, in order to obtain the 4th recombinant strain producing the hepatitis B virus surface antigen having the G145R mutation (ESC-Ag), two expression cassettes containing one copy of the desired gene are successively integrated into the genome of the H. polymorpha DL1-L strain. The first cassette contains a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of the promoter of the MOX gene (methanol oxidase gene). The integration of this cassette took place according to the mechanism of homologous integration into the locus of the MOX gene. The second expression cassette contains a similar ESC-Ag gene, but under the control of the DAK gene promoter (the gene encodes the dihydroxyacetone kinase) of H. polymorpha yeast. The integration of this cassette took place according to the mechanism of homologous integration into the LEU2 gene locus. The transformation produces a recombinant strain containing one copy of the target ESC-Ag gene under the control of the DAK promoter and one copy under the control of the MOX promoter. Moreover, the artificial genes are integrated directly into the genome of the producer strain, i.e. are part of the chromosomes of the yeast H. polymorpha. This ensures high mitotic stability of the strain, making it possible to optimize the conditions for its cultivation without taking into account the risk of accumulation of cells that have lost the ability to synthesize a foreign protein. In addition, the presence in each of the integration loci of only one copy of a recombinant gene with a unique promoter and terminator region allows us to control the absence of mutations of this gene during its introduction into the genome and during cultivation of the strain. The absence of mutations is monitored by analyzing the nucleotide sequence of the products of the polymerase chain reaction using primers complementary to specific sequences flanking the coding region of the recombinant gene at each of the integration loci. The use of expression cassettes with two different promoters (MOX and DAK), the maximum activity of which is achieved under different cultivation conditions, provides a more uniform synthesis of the product during the cultivation of the strain. At the same time, the level of protein synthesis is not exceeded, which can lead to a possible violation of the laying efficiency and, as a result, a decrease in the strain productivity. As a result of the selection of clones capable of synthesizing the ESC-Ag protein, a transformant that best meets the required properties was isolated. The strain was deposited 05/20/2014 in the collection of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT-14 / pEMmono2. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Полученные рекомбинантные штаммы-продуценты КБТ11/pEMmulti-7, КБТ12/pEMmono-4, KBT14/pEMmalt-8 и КБТ-14/рЕМmono2 могут быть использованы для получения с высоким выходом белка ESC-Ag в виде вирусоподобных частиц, обладающего антигенными свойствами, необходимыми для его использования в качестве основного компонента вакцины для защиты от мутантного варианта Escape вируса гепатита В человека. Образование вирусоподобных частиц подтверждали с использованием метода электронной микроскопии и гель-фильтрационной хроматографии.The resulting recombinant producer strains KBT11 / pEMmulti-7, KBT12 / pEMmono-4, KBT14 / pEMmalt-8 and KBT-14 / pEMmono2 can be used to obtain high-yield ESC-Ag protein in the form of virus-like particles with antigenic properties necessary for use as a major component of a vaccine for protection against a mutant variant of Escape human hepatitis B virus. The formation of virus-like particles was confirmed using electron microscopy and gel filtration chromatography.

После выделения и очистки рекомбинантные антигены использовали в составе вакцины для профилактики вирусного гепатита В. При этом получены вакцины в нескольких вариантах. В одном варианте рекомбинантная вакцина содержит поверхностный антиген вируса гепатита В, имеющий мутацию G145R (ESC-Ag), полученный путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей H. Polymorpha KBT-11/pEMmulti-7 или Н. Polymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или Н. Polymorpha КБТ-14/ pEMmalt-8, или Н. Polymorpha КБТ-14/рЕМmono2 в эффективном количестве, адьювант, физиологически приемлемый разбавитель и может содержать мертиолят в качестве консерванта.After isolation and purification, recombinant antigens were used in the composition of the vaccine for the prevention of hepatitis B. In this case, vaccines were obtained in several versions. In one embodiment, the recombinant vaccine comprises a hepatitis B virus surface antigen having a G145R mutation (ESC-Ag) obtained by culturing a recombinant strain of H. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or H. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, or N. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or N. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2 in an effective amount, adjuvant, a physiologically acceptable diluent and may contain merthiolate as a preservative.

В другом варианте рекомбинантная вакцина содержит также рекомбинантный HBsAg серотипа «ayw» и/или «adw». HBsAg серотипа ayw получали путем культивирования штамма дрожжей Pichia augusta VKM Y-2924D (RU2238105). HBsAg серотипа «adw» получали путем культивирования штамма дрожжей Pichia augusta VKPMY-2412 (RU2238105). Выделенные и очищенные рекомбинантные HBsAg не имеют мутаций, имеют чистоту не менее 95%, обладают антигенной активностью и иммунной специфичностью. В составе вакцины может быть использован коммерческий препарат HBsAg.In another embodiment, the recombinant vaccine also contains recombinant HBsAg serotype "ayw" and / or "adw". The ayw serotype HBsAg was obtained by culturing the Pichia augusta VKM Y-2924D yeast strain (RU2238105). HBsAg serotype "adw" was obtained by culturing a strain of the yeast Pichia augusta VKPMY-2412 (RU2238105). Isolated and purified recombinant HBsAg do not have mutations, have a purity of at least 95%, have antigenic activity and immune specificity. As part of the vaccine, a commercial HBsAg preparation may be used.

Под эффективным количеством понимается такое количество активного начала, которое достаточно для защиты от вируса гепатита В. Точное количество будет зависеть от конкретных обстоятельств и может быть оценено специалистом в данной области с использованием известных методик.An effective amount is understood to mean such an amount of active principle that is sufficient to protect against hepatitis B. The exact amount will depend on specific circumstances and can be estimated by a person skilled in the art using known techniques.

Технический результат предложенного изобретения заключается в создании вакцины, обладающей улучшенным серологическим соответствием природному мутанту за счет широкого, приближающегося к естественному, спектра эпитопов, и способной стимулировать развитие протективного ответа антителообразования как против отдельных субтипов ВГВ - «ау» и «ad», так против эпитопов мутанта G145R, снижении себестоимости.The technical result of the proposed invention is to create a vaccine that has improved serological compliance with the natural mutant due to a wide, close to natural, spectrum of epitopes, and is able to stimulate the development of a protective antibody response against both individual HBV subtypes - “ay” and “ad”, and against epitopes mutant G145R, cost reduction.

Вакцина согласно изобретению позволяет наиболее полно удовлетворять потребности практического здравоохранения, снижая затраты на реализацию программ вакцинопрофил актики.The vaccine according to the invention allows the most complete satisfaction of the needs of practical health care, reducing the cost of implementing vaccine prophylactic programs.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.The invention can be illustrated by the following examples.

В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Трансформацию клеток Escherichia coli и Hansenula polymorpha осуществляли согласно ранее описанным методам (Inoue H. et. al., Gene, 1990, 96:23-28. и Bogdanova A.I. et. al., Yeast, 1995, 11(4):343-53, соответственно). Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали полимеразу Pwo (Roche). Синтез олигонуклеотидов, получение фрагмента ДНК, содержащего последовательность, кодирующую ESC-Ag (SEQ ID NO: 1), а также определение последовательности нуклеотидов производились ЗАО "Евроген" г. Москва.In the given examples, all genetic engineering operations were performed according to standard procedures and instructions of companies producing enzymes and sets for manipulating DNA in vitro. The transformation of Escherichia coli and Hansenula polymorpha cells was carried out according to the previously described methods (Inoue H. et. Al., Gene, 1990, 96: 23-28. And Bogdanova AI et. Al., Yeast, 1995, 11 (4): 343- 53, respectively). For polymerase chain reaction (PCR), Pwo polymerase (Roche) was used. The synthesis of oligonucleotides, the preparation of a DNA fragment containing the sequence encoding ESC-Ag (SEQ ID NO: 1), as well as the determination of the nucleotide sequence, were carried out by ZAO Evrogen, Moscow.

Пример 1. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего несколько копий рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ.Example 1. Obtaining a strain of N. polymorpha containing several copies of the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter.

Получали плазмиду pIR4-7 (Фиг. 1; SEQ ID NO: 2), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag. Этот ген включал промоторную область гена МОХ Н. polymorpha (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4338-4862) и синтетическую последовательность (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4863-5554), содержащую открытую рамку считывания ESC-Ag (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4874-5551), последовательность которой совпадала с последовательностью открытой рамки считывания гена HBsAg "ayw2" дикого типа за исключением позиции 433, в которой вместо остатка гуанина находился остаток аденина (SEQ ID NO: 2, нуклеотидная позиция 5306). Помимо этого гена, плазмида pIR4-7 состояла из: (а) фрагмента плазмиды рАМ619 (Agaphonov and Alexandrov, FEMS Yeast Res., 2014, 14(7):1048-54), включающего бактериальный селективный маркер устойчивости к ампициллину и дрожжевой селективный маркер - модифицированный ген LEU2 S. cerevisiae (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 895-4337), (б) фрагмента плазмиды AMIpSL1 (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15(7):541-51), несущего терминатор транскрипции и автономно-реплицирующуюся последовательность Н. polymorpha, (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 7-894) и (в) линкерной последовательности (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 1-6).The plasmid pIR4-7 (Fig. 1; SEQ ID NO: 2) was obtained, which contained a recombinant gene encoding an ESC-Ag polypeptide. This gene included the promoter region of the M. polymorpha MOX gene (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4338-4862) and a synthetic sequence (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4863-5554) containing an open reading frame of ESC-Ag (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4874-5551), the sequence of which coincided with the open reading frame of the wild-type HBsAg "ayw2" gene with the exception of position 433, in which instead of the guanine residue was the adenine residue (SEQ ID NO: 2, nucleotide position 5306) . In addition to this gene, plasmid pIR4-7 consisted of: (a) a fragment of plasmid pAM619 (Agaphonov and Alexandrov, FEMS Yeast Res., 2014, 14 (7): 1048-54), including a bacterial selective marker of ampicillin resistance and a yeast selective marker - a modified LEU2 gene of S. cerevisiae (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 895-4337), (b) a fragment of plasmid AMIpSL1 (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15 (7): 541-51) carrying a transcription terminator and an autonomously replicating sequence of H. polymorpha, (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 7-894) and (c) a linker sequence (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 1-6).

Штамм DL1-L трансформировали плазмидой pIR4-7. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. Несколько выросших трансформантов посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших колоний отобрали самые крупные и снова посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока вырастающие при рассеве колонии не стали одинаковыми по скорости роста. По одному такому субклону нескольких независимых трансформантов отобрали для анализа продукции белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-11/pEMmulti-7.Strain DL1-L was transformed with plasmid pIR4-7. Transformants were selected on leucine-free medium. Several grown transformants were seeded onto a solid leucine-free medium with a draining stroke to obtain individual colonies. Among the grown colonies, the largest were selected and again sown on solid medium without leucine with a draining stroke. This procedure was repeated until the colonies growing during sieving were equal in growth rate. For one such subclone, several independent transformants were selected for analysis of ESC-Ag protein production. One of these transformants was designated KBT-11 / pEMmulti-7.

Пример 2. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего одну копию рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ.Example 2. Obtaining a strain of H. polymorpha containing one copy of a recombinant gene encoding an ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter.

Получали плазмиду рАМ618 (Фиг. 2А; SEQ ID NO: 3), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 4188-5715). После терминирующего кодона этого гена находился фрагмент локуса гена МОХ, включающий его терминаторную область и часть гена TRP3 (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 1-1358). Помимо этих последовательностей плазмида рАМ618 содержала векторную последовательность для ее поддержания в клетках Е. coli, состоящую из фрагмента Pcil-Stul плазмиды pUK21 (Vieira J. et. al., Gene. 1991, 100:189-94.) (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 3818-4187) и фрагмента Ecl136II-PciI плазмиды pBlueScriptKS+ (Stratagen, USA) (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 1359-3817).The plasmid pAM618 (Fig. 2A; SEQ ID NO: 3) was obtained, which contained the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide under the control of the MOX promoter (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 4188-5715). After the termination codon of this gene, there was a fragment of the MOX gene locus, including its termination region and part of the TRP3 gene (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 1-1358). In addition to these sequences, the pAM618 plasmid contained a vector sequence for its maintenance in E. coli cells, consisting of the Pcil-Stul fragment of the pUK21 plasmid (Vieira J. et. Al., Gene. 1991, 100: 189-94.) (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 3818-4187) and an Ecl136II-PciI fragment of plasmid pBlueScriptKS + (Stratagen, USA) (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 1359-3817).

Штамм DLT2 трансформировали смесью фрагментов плазмиды рАМ618, гидролизованной рестриктазами ЕсL136II и XhoI. Трансформантов отбирали на среде, содержащей лейцин и не содержащей триптофан. В локусе МОХ штамма DLT2 интегрирован селективный маркер, ген LEU2 S. cerevisiae, обеспечивающий штамму способность расти на среде без лейцина. При интеграции рекомбинантного гена в локус МОХ путем двойного кроссинговера, ген LEU2 должен замещаться (Фиг. 2Б). Поэтому полученные трансформанты проверяли на способность расти на среде, не содержащей лейцин. Неспособность трансформантов расти на среде без лейцина свидетельствовала об интеграции рекомбинантного гена в локус МОХ путем двойного кроссинговера. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-12/pEMmono-4.Strain DLT2 was transformed with a mixture of fragments of plasmid pAM618 hydrolyzed with restriction enzymes EsL136II and XhoI. Transformants were selected on medium containing leucine and not containing tryptophan. A selective marker, the S. cerevisiae LEU2 gene, is integrated into the MOX locus of strain DLT2, which provides the strain with the ability to grow on a medium without leucine. When integrating the recombinant gene into the MOX locus by double crossing over, the LEU2 gene must be replaced (Fig. 2B). Therefore, the obtained transformants were tested for their ability to grow on a medium not containing leucine. The inability of transformants to grow on a medium without leucine testified to the integration of the recombinant gene into the MOX locus by double crossing over. One of these transformants was designated KBT-12 / pEMmono-4.

Пример 3. Получение штамма H. polymorpha, содержащего несколько копий рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора MAL1.Example 3. Obtaining a strain of H. polymorpha containing several copies of the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the MAL1 promoter.

Получали плазмиду pMAL-ESC1 (Фиг. 3; SEQ ID NO: 4), которая отличалась от плазмиды pIR4-7 тем, что фрагмент, несущий промотор МОХ (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4390-4862) был заменен на фрагмент, несущий промотор гена MAL1 H. polymorpha DL1 (SEQ ID NO: 4, нуклеотидные позиции 1-1326).The plasmid pMAL-ESC1 (Fig. 3; SEQ ID NO: 4) was obtained, which differed from the plasmid pIR4-7 in that the fragment carrying the MOX promoter (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4390-4862) was replaced by a fragment Carrier promoter of the H. polymorpha DL1 MAL1 gene (SEQ ID NO: 4, nucleotide positions 1-1326).

Штамм DL1-L трансформировали плазмидой pMAL-ESC1. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. Несколько выросших трансформантов рассевали истощающим штрихом на твердую среду без лейцина, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших колоний отбирали самые крупные и снова сеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока вырастающие при рассеве колонии не стали одинаковыми по скорости роста. По одному такому субклону нескольких независимых трансформантов отбирали для анализа продукции белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен KBT-14/pEMmalt-8.Strain DL1-L was transformed with plasmid pMAL-ESC1. Transformants were selected on leucine-free medium. Several grown transformants were scattered with an exhausting touch on a solid medium without leucine to obtain separate colonies. Among the grown colonies, the largest were selected and again sown on solid medium without leucine with a draining stroke. This procedure was repeated until the colonies growing during sieving were equal in growth rate. One such subclone of several independent transformants was selected for analysis of ESC-Ag protein production. One of these transformants was designated KBT-14 / pEMmalt-8.

Пример 4. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего одну копию рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ и одну копию под контролем промотора DAK.Example 4. Obtaining a strain of H. polymorpha containing one copy of a recombinant gene encoding an ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter and one copy under the control of the DAK promoter.

Получали плазмиду pDAK-ESC1 (Фиг. 4; SEQ ID NO: 5), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag, под контролем промотора DAK Н. polymorpha DL-1 (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 4404-5727) и последовательность вектора AMIpLD1 (Agaphonov et al., Yeas,. 1999, 15(7):541-51) (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 43-4403) включая дрожжевой селективный маркер ген LEU2 Н. polymorpha с делецией в промоторной области, а также линкерную последовательность (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 1-42).The plasmid pDAK-ESC1 (Fig. 4; SEQ ID NO: 5) was obtained, which contained a recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide under the control of the DAK N. polymorpha DL-1 promoter (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 4404-5727 ) and the sequence of the vector AMIpLD1 (Agaphonov et al., Yeas, 1999, 15 (7): 541-51) (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 43-4403) including the yeast selective marker H. polymorpha deletion LEU2 gene with a deletion in the promoter region, as well as the linker sequence (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 1-42).

Штамм КБТ-12/pEMmono-4 (см. Пример 2) трансформировали плазмидой pDAK-ESC1, гидролизованной рестриктазой BstEII. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. У быстро растущих трансформантов проверяли продукцию белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-14/pEMmono-2.Strain KBT-12 / pEMmono-4 (see Example 2) was transformed with the plasmid pDAK-ESC1 hydrolyzed by BstEII restrictase. Transformants were selected on leucine-free medium. In fast-growing transformants, ESC-Ag protein production was tested. One of these transformants was designated KBT-14 / pEMmono-2.

Пример 5. Культивирование штаммов H. polymorpha КБТ 11/pEMmulti-7, КБТ 12/pEMmono-4 и КБТ-14/рЕМmono2.Example 5. Cultivation of strains of H. polymorpha KBT 11 / pEMmulti-7, KBT 12 / pEMmono-4 and KBT-14 / pEMmono2.

Ферментацию штаммов-продуцентов дрожжей H. polymorpha осуществляли в два этапа. На первом этапе культивирования в режиме фед-бэтч при температуре 30°С наращивали биомассу в культуральной среде, содержащей 4% дрожжевого экстракта, 2% бакто-пептона и 4% глицерина. Процесс вели до истощения источника углерода в питательной среде и прекращения роста биомассы. На втором этапе культивирование проводили с подпиткой культуры путем непрерывной подачи 30%-ного раствора дрожжевого экстракта. Одновременно с подпиткой добавляли индуктор до концентрации 0.5-0.8% и поддерживали на этом уровне в течение 48-72 часов. Продолжительность всего процесса составляла около 96 часов.The fermentation of strains producing yeast H. polymorpha was carried out in two stages. At the first stage of cultivation in the fed-batch mode at a temperature of 30 ° C, biomass was increased in a culture medium containing 4% yeast extract, 2% bacto-peptone and 4% glycerol. The process was conducted until the carbon source in the nutrient medium was depleted and the biomass stopped growing. In the second stage, the cultivation was carried out with feeding the culture by continuous supply of a 30% solution of yeast extract. Simultaneously with the replenishment, the inductor was added to a concentration of 0.5-0.8% and maintained at this level for 48-72 hours. The duration of the whole process was about 96 hours.

Пример 6. Культивирование штамма H. polymorpha KBT-14/pEMmalt-8, содержащего рекомбинантный ген ESC-Ag под контролем промотора MALI.Example 6. Cultivation of a strain of H. polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8 containing the recombinant ESC-Ag gene under the control of the MALI promoter.

Ферментацию штамма-продуцента KBT-14/pEMmalt-8 проводили в тех же условиях, что и штаммы с промоторами МОХ и DAK (Пример 5). За исключением того, что на втором этапе культивирования в качестве индуктора использовали 40% (вес/объем) раствор сахарозы, который добавляли порциями по 0.5% (вес сахарозы / объем культуральной жидкости) через каждые два часа в течение 48-72 часов.The fermentation of the producer strain KBT-14 / pEMmalt-8 was carried out under the same conditions as the strains with MOX and DAK promoters (Example 5). Except that in the second stage of cultivation, a 40% (weight / volume) sucrose solution was used as an inducer, which was added in 0.5% portions (sucrose weight / volume of culture liquid) every two hours for 48-72 hours.

Пример 7. Выделение и очистка рекомбинантного белка ESC-Ag из клеток H. polymorpha.Example 7. Isolation and purification of recombinant ESC-Ag protein from H. polymorpha cells.

После ферментации белок ESC-Ag (аминокислотная последовательность - SEQ ID NO: 6) выделяли согласно опубликованной методике (Lunsdorf H. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10:48) с небольшими изменениями. Клетки из культуральной жидкости осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 минут при 4°С. Осажденную биомассу ресуспендировали до исходного объема в карбонатно-солевом буферном растворе для экстракции (50mM NaHCO₃, 150 тМ NaCl, рН 8.0) и снова осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 минут при 4°С. Полученную таким образом отмытую биомассу ресуспендировали в буферном растворе для экстракции с добавлением 1.7mM EDTA и 2 mM PMSF до концентрации 400 г влажных клеток на литр суспензии. Далее клетки разрушали в проточном дезинтеграторе Dyno-Mill типа KDL при температуре 5-10°С, используя стеклянные шары диаметром 0.5-0.7 мм. Для удаления клеточного дебриса полученный гомогенизат центрифугировали при 4000g в течение 60 минут при 4°С.After fermentation, the ESC-Ag protein (amino acid sequence — SEQ ID NO: 6) was isolated according to a published technique (Lunsdorf H. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10:48) with slight changes. Cells from the culture fluid were besieged by centrifugation at 4000 g for 30 minutes at 4 ° C. The precipitated biomass was resuspended to its original volume in carbonate-salt extraction buffer (50 mM NaHCO ₃ , 150 tM NaCl, pH 8.0) and again precipitated by centrifugation at 4000 g for 30 minutes at 4 ° C. The washed biomass thus obtained was resuspended in extraction buffer with 1.7 mM EDTA and 2 mM PMSF added to a concentration of 400 g wet cells per liter of suspension. Next, the cells were destroyed in a Dyno-Mill flow disintegrator of the KDL type at a temperature of 5-10 ° C using glass balls with a diameter of 0.5-0.7 mm. To remove cell debris, the resulting homogenizate was centrifuged at 4000 g for 60 minutes at 4 ° C.

Полученный осветленный гомогенизат подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на системе Sartocon через мембрану с порогом отсечения 300 kDa (Sartorius, Германия), одновременно концентрировали и переводили в фосфатно-солевой буферный раствор (10mM NaH₂PO₄, 150mM NaCl, 1.7mM EDTA, pH 6.8). При этом отделяется большая часть примесных низкомолекулярных белков.The resulting clarified homogenizate was subjected to tangential flow ultrafiltration on a Sartocon system through a membrane with a cutoff threshold of 300 kDa (Sartorius, Germany), was simultaneously concentrated and transferred to phosphate-buffered saline (10mM NaH ₂ PO ₄ , 150mM NaCl, 1.7mM EDTA, pH 6.8 ) In this case, most of the impurity low molecular weight proteins are separated.

Дальнейшую очистку проводили методом адсорбционной хроматографии на колонке с макропористым стеклом (МПС) с использованием технологии Streamline (хроматография в восходящем потоке). Концентрированный раствор ESC-Ag, полученный после ультрафильтрации, наносили на колонку при скорости 1 мл/мин, промывали 3-4 объемами фосфатно-солевого буферного раствора (рН 6.8) и элюировали карбонатным буфером (50mM NaHCO₃, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 9.5).Further purification was carried out by adsorption chromatography on a column with macroporous glass (MPS) using Streamline technology (upstream chromatography). The concentrated ESC-Ag solution obtained after ultrafiltration was applied to the column at a speed of 1 ml / min, washed with 3-4 volumes of phosphate-buffered saline (pH 6.8) and eluted with carbonate buffer (50 mM NaHCO ₃ , 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA , pH 9.5).

Объединенные фракции, содержащие ESC антиген (определяли по иммуноблоту и SDS-PAGE), концентрировали ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембране 300 KDa и разделяли при помощи зонального ультрацентрифугирования (Beckman Coulter, USA) в градиенте плотности сахарозы (20-50% вес/вес). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, а затем очищали гельфильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (ToyoSoda Corp., Japan) в фосфатном буферном растворе (10mM NaH₂РО₄ 0.03% Tween-20, рН 7.2).The pooled fractions containing ESC antigen (determined by immunoblot and SDS-PAGE) were concentrated by tangential flow ultrafiltration on a 300 KDa membrane and separated by zonal ultracentrifugation (Beckman Coulter, USA) in a sucrose density gradient (20-50% weight / weight) . The fractions containing the target protein were combined and then purified by gel filtration on a Toyopearl HW-65 sorbent (ToyoSoda Corp., Japan) in phosphate buffered saline (10mM NaH ₂ PO ₄ 0.03% Tween-20, pH 7.2).

Чистоту полученного таким образом рекомбинантного белка ESC-Ag определяли методом SDS-PAGE электрофореза. Если чистота белка была недостаточна (менее 95%) производили дополнительную очистку при помощи анионообменной хроматографии на сорбенте Toyopearl DEAE-650M.The purity of the thus obtained recombinant ESC-Ag protein was determined by SDS-PAGE electrophoresis. If the protein purity was insufficient (less than 95%), additional purification was performed using anion exchange chromatography on a Toyopearl DEAE-650M sorbent.

В результате этих операций удается выделить около 30% антигена, присутствующего в осветленном клеточном лизате. Выход очищенного ESC-Ag составлял не менее 50 мг/л культуральной жидкости.As a result of these operations, it is possible to isolate about 30% of the antigen present in the clarified cell lysate. The yield of purified ESC-Ag was at least 50 mg / L of culture fluid.

Пример 8. Анализ рекомбинантного ESC-Ag.Example 8. Analysis of recombinant ESC-Ag.

1) Чистота рекомбинантного ESC-Ag определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) путем окрашивания с Coomassie Brilliant Blue R-250 и/или серебром. Анализ интенсивности полос отсканированных гелей проводится посредством компьютерной программы NIH Image (Фиг. 5).1) The purity of recombinant ESC-Ag is determined by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions (SDS-PAGE) by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250 and / or silver. The analysis of the intensity of the bands of scanned gels is carried out using the computer program NIH Image (Fig. 5).

2) Образование вирусоподобных частиц (ВПЧ) рекомбинантного белка ESC-Ag подтверждали методом гель-фильтрационной хроматографии на полимерной колонке TSK G5000PW диаметром 7.5 мм и длиной 60 см, соединенной с предколонкой PrePW диаметром 7.5 мм и длиной 7.5 см (Tosoh Bioscience, Japan). Разделение проводили в фосфатном буферном растворе (10mM КН₂РО₄, (рН 7.2), 0.03% Tween-20) при скорости потока 0.6 мл/мин. Мониторинг процесса осуществляли по поглощению на 280 нм. Размер пор сорбента 1000Å позволяет отделить правильно собранные ВПЧ от мономеров и агрегатов Esc-антигена. Время элюции очищенного препарата ESC-Ag соответствует времени элюции вирусоподобных частиц 23-26 мин (Фиг. 6).2) The formation of virus-like particles (HPV) of the recombinant ESC-Ag protein was confirmed by gel filtration chromatography on a TSK G5000PW polymer column with a diameter of 7.5 mm and a length of 60 cm connected to a PrePW column with a diameter of 7.5 mm and a length of 7.5 cm (Tosoh Bioscience, Japan). Separation was carried out in a phosphate buffer solution (10mM KH ₂ PO ₄ , (pH 7.2), 0.03% Tween-20) at a flow rate of 0.6 ml / min. The process was monitored by absorbance at 280 nm. The sorbent pore size of 1000Å allows you to separate correctly collected HPV from monomers and aggregates of Esc antigen. The elution time of the purified preparation of ESC-Ag corresponds to the elution time of virus-like particles 23-26 min (Fig. 6).

Электронно-микроскопический анализ полученного антигена показал наличие в образце частиц размером 15-25 нм. округлой и овальной формы. Ободок частиц имел низкую электронную плотность и относительно более темный центр при окраске 1% раствором молибдата аммония и уранилацетата (Фиг. 7). Эти данные подтверждают то, что полученный Esc-антиген собирается в вирусоподобные частицы.Electron microscopic analysis of the obtained antigen showed the presence of particles with a size of 15-25 nm. round and oval. The rim of the particles had a low electron density and a relatively darker center when stained with a 1% solution of ammonium molybdate and uranyl acetate (Fig. 7). These data confirm that the resulting Esc antigen is assembled into virus-like particles.

3) Иммуноспецифичность рекомбинантного ESC антигена определяют методом иммуноблотинга. Первичные антитела для этой цели получали иммунизацией кроликов рекомбинантным HBsAg (ЗАО НПК «Комбиотех»), восстановленным в присутствии 2% SDS и 5% β-меркаптоэтанола. Из полученных высокоиммунных сывороток специфические поликлональные антитела выделяли на афинной колонке с коньюгированным рекомбинантным HBsAg (Крымский М.А. et al., Биофармацевтический Журнал, 2010, 2(5):8-15) Этими антителами окрашивали иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам кроликов, коньюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген ESC-Ag представлен в виде полосы мономера белка размером 22-25 кДа и слабых полос димера и тримера (Фиг. 5).3) The immunospecificity of the recombinant ESC antigen is determined by immunoblotting. Primary antibodies for this purpose were obtained by immunizing rabbits with recombinant HBsAg (ZAO NPK Kombioteh), reconstituted in the presence of 2% SDS and 5% β-mercaptoethanol. From the obtained high-immune sera, specific polyclonal antibodies were isolated on an affinity column with conjugated recombinant HBsAg (Krymsky MA et al., Biopharmaceutical Journal, 2010, 2 (5): 8-15) Immunoblot was stained with these antibodies, followed by visualization with specific antibodies to rabbit immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase according to the method of improved ECL chemiluminescence (Amersham, UK). The recombinant ESC-Ag antigen is presented as a 22–25 kDa protein monomer band and weak dimer and trimer bands (Fig. 5).

4) Серологический портрет рекомбинантных Esc антигенов проводили по методике, разработанной в лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, с применением репрезентативной панели конъюгатов моноклональных антител к HBsAg. Поликлональные кроличьи (КАТ) и моноклональные мышиные (11F3, Н10, НВ4, 10D10, 5Н7, 4F5, Н2) антитела к HBsAg, а также их конъюгаты с пероксидазой хрена были получены в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Также использовали коммерческие моноклональные конъюгаты NF5, NE2 («Сорбент», Россия) и Х7 («Фармакс», Россия). Реактивность антигенных образцов с 11-ю пероксидазными конъюгатами антител исследовали методом ИФА. Оптимальные концентрации для каждого конъюгата подбирались в предварительных опытах с помощью внутреннего производственного стандарта, оттитрованного по отраслевому стандартному образцу. Относительную реактивность образцов оценивали по сравнению с соответствующей реактивностью внутреннего производственного стандарта (ВПС) HBsAg. За относительную реактивность каждого образца (обр) с исследованными конъюгатами принимали отношение Собр/Свпс×10³. Реактивность образца с данным конъюгатом считали дефектной, если отношение Собр/Свпс для этого конъюгата не превышало 100. Полученные результаты представлены в таблице 1.4) A serological portrait of recombinant Esc antigens was carried out according to the method developed in the laboratory of mediators and immunity effectors of the State Research Institute of Electric Medicine named after N.F. Gamalei RAMS, using a representative panel of conjugates of monoclonal antibodies to HBsAg. Polyclonal rabbit (CAT) and monoclonal mouse (11F3, H10, HB4, 10D10, 5H7, 4F5, H2) antibodies to HBsAg, as well as their conjugates with horseradish peroxidase, were obtained at the State Research Institute of Electric Medicine named after N.F. Gamalei RAMS. Commercial monoclonal conjugates NF5, NE2 (Sorbent, Russia) and X7 (Pharmax, Russia) were also used. The reactivity of antigenic samples with 11 peroxidase antibody conjugates was studied by ELISA. The optimal concentration for each conjugate was selected in preliminary experiments using an internal production standard, titrated according to the industry standard sample. The relative reactivity of the samples was evaluated compared to the corresponding reactivity of the HBsAg internal production standard (IPN). For the relative reactivity of each sample (arr) with the studied conjugates, the Sobr / Svps × 10 ³ ratio was taken. The reactivity of the sample with this conjugate was considered defective if the Sobr / HPS ratio for this conjugate did not exceed 100. The results obtained are presented in table 1.

Из таблицы видно, что рекомбинантные антигены HBsAg субтипов «ау» и «ad» - стандартные компоненты вакцины, производимой ЗАО НПК «Комбиотех», распознаются всей панелью конъюгатов. Это означает, что их серологические и конформационные характеристики полностью соответствуют HBsAg дикого типа. Серологическое портретирование антигенов с эскейп-мутацией G145R показало, что все три исследуемых рекомбинантных препарата, рассматриваемые в данном изобретении, (Таблица 1, строки 7, 8, 9) имеют многочисленные дефекты в реактивности с большинством конъюгатов (Табл 1, выделение серым фоном). Точно такую же картину дефектов (или серологический портрет) показывают нативные Esc-антигены, выделенные из человеческих сывороток, несущих природную мутацию G145R (Таблица 1, строки 5, 6), В то же время рекомбинантные образцы AHBV203 (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород) и HBs-878 («PROSPEC», Израиль), тоже содержащие мутацию G145R, не имели ни одного дефекта распознавания моноклональными конъюгатами, т.е. конформация этих рекомбинантных молекул полностью соответствовала HBsAg дикого типа, а не мутантного антигена, и они не могли быть использованы в качестве претендентов для создания искомого вакцинного препарата.The table shows that the recombinant HBsAg antigens of the subtypes "au" and "ad" - the standard components of the vaccine manufactured by NPK Kombiotekh, are recognized by the entire panel of conjugates. This means that their serological and conformational characteristics are fully consistent with wild-type HBsAg. Serological portrayal of antigens with the escape mutation G145R showed that all three of the studied recombinant drugs considered in this invention (Table 1, lines 7, 8, 9) have numerous defects in reactivity with most conjugates (Table 1, gray background). Exactly the same picture of defects (or a serological portrait) is shown by native Esc antigens isolated from human sera carrying the natural mutation G145R (Table 1, lines 5, 6). At the same time, recombinant samples AHBV203 (NPO Diagnostic Systems, Lower Novgorod) and HBs-878 (PROSPEC, Israel), also containing the G145R mutation, did not have a single recognition defect with monoclonal conjugates, i.e. the conformation of these recombinant molecules fully corresponded to wild-type HBsAg rather than a mutant antigen, and they could not be used as applicants to create the desired vaccine preparation.

Таким образом, серологическое портретирование показывает полное конформационное соответствие рекомбинантных Esc антигенов, полученных из штаммов, описанных в данном изобретении, с нативными мутантами G145R, в отличие от Esc-Ag других производителей.Thus, serological portraiture shows the complete conformational correspondence of recombinant Esc antigens obtained from the strains described in this invention with native G145R mutants, in contrast to Esc-Ag from other manufacturers.

Культурально-морфологические особенности штаммов: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой. Хранение штаммов - при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина.Cultural and morphological features of the strains: round-shaped cells, small in size, form large round colonies with a pronounced convex middle on an agarized YPD medium. The strains are stored at -70 ° C in the form of a suspension of cells in a sterile 30-50% glycerol solution.

Генетические особенности: Штаммы не являются зоопатогенными или фитопатогенными.Genetic features: Strains are not zoopathogenic or phytopathogenic.

Способ, условия и состав сред для размножения штаммов: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.Method, conditions and composition of media for the propagation of strains: incubation by pumping at 30 ° C in a nutrient medium composition: 2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose.

Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 30°С и рН 5.5-6.0 в питательной среде, содержащей до 4% глицерина.The conditions and composition of the medium for fermentation: pumping at 30 ° C and pH 5.5-6.0 in a nutrient medium containing up to 4% glycerol.

Выделенный и очищенный ESC-Ag используют для создания рекомбинантной вакцины для профилактики вирусного гепатита В.Isolated and purified ESC-Ag is used to create a recombinant vaccine for the prevention of hepatitis B.

Полученные вакцинные композиции представлены в следующих вариантах:The resulting vaccine compositions are presented in the following options:

1) Вакцина содержит поверхностный антиген вируса гепатита В, имеющий мутацию G145R (ESC-Ag), полученный путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей H. Polymorpha КБТ-11 /pEMmulti-7 или H. Ρolymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или H. Polymorpha KBT-14/pEMmalt-8, или H. Polymorpha КБТ-14/рЕМmono2, адъювант и физиологически приемлемый разбавитель;1) The vaccine contains a hepatitis B virus surface antigen having a G145R mutation (ESC-Ag) obtained by culturing a recombinant strain of H. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or H. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2, adjuvant and physiologically acceptable diluent;

2) Вакцина содержит в равных долях смесь поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), полученного путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей Н. Polymorpha КБТ-11/ pEMmulti-7 или Н. Polymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или Н. Polymorpha KBT-14/pEMmalt-8, или H. Polymorpha КБТ-14/рЕМmono2, и рекомбинантного HBsAg серотипа «ayw», адъювант и физиологически приемлемый разбавитель;2) The vaccine contains in equal proportions a mixture of hepatitis B virus surface antigen having the G145R mutation (ESC-Ag) obtained by culturing a recombinant strain of N. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or N. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4 yeast or N. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2, and the recombinant HBsAg serotype "ayw", adjuvant and physiologically acceptable diluent;

3) Вакцина содержит в равных долях смесь поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), полученного путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей H. Polymorpha КБТ-11/ pEMmulti-7 или Н. Polymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или H. Polymorpha КБТ-14/ pEMmalt-8, или Н. Polymorpha КБТ-14/рЕМmono2, и рекомбинантного HBsAg серотипа «adw», адъювант и физиологически приемлемый разбавитель;3) The vaccine contains in equal proportions a mixture of hepatitis B virus surface antigen having the G145R mutation (ESC-Ag) obtained by culturing a recombinant strain of H. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or N. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4 yeast or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or N. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2, and the recombinant HBsAg serotype "adw", adjuvant and physiologically acceptable diluent;

4) Вакцина содержит в равных долях смесь поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), полученного путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей H. Polymorpha КБТ-11/pEMmulti-7 или Н. Polymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или H. Polymorpha KBT-14/pEMmalt-8, или H. Polymorpha КБТ-14рЕМmono2, и рекомбинантного HBsAg серотипов «ayw» и «adw», адъювант и физиологически приемлемый разбавитель.4) The vaccine contains in equal proportions a mixture of hepatitis B virus surface antigen having the G145R mutation (ESC-Ag) obtained by culturing a recombinant strain of H. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or N. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4 yeast or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or H. Polymorpha KBT-14pEMmono2, and recombinant HBsAg serotypes "ayw" and "adw", adjuvant and physiologically acceptable diluent.

5) Вакцина вариантов 1, 2, 3, 4 дополнительно содержит консервант - мертиолят.5) The vaccine of options 1, 2, 3, 4 additionally contains a preservative - thiolate.

Конкретные примеры композиций вакцин для профилактики вирусного гепатита В:Specific examples of vaccine compositions for the prevention of viral hepatitis B:

1. Вакцина для профилактики вирусного гепатита В содержит:1. The vaccine for the prevention of viral hepatitis B contains:

20 мкг ESC-Ag, полученного путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей H. Polymorpha KBT-11/pEMmulti-7 или H. Polymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или H. Polymorpha KBT-14/pEMmalt-8, или H. Polymorpha КБТ-14/pEMmono2.20 μg ESC-Ag obtained by culturing a recombinant strain of the yeast H. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or H. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2.

0.5 мг геля гидроокиси алюминия,0.5 mg aluminum hydroxide gel,

до 1.0 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), представленного 50 mM Na-фосфатного буфера, рН 6.8 и 0.13 M NaCl.up to 1.0 ml of phosphate-buffered saline (PBS), represented by 50 mM Na-phosphate buffer, pH 6.8 and 0.13 M NaCl.

2. Вакцина для профилактики вирусного гепатита В содержит:2. The vaccine for the prevention of viral hepatitis B contains:

10 мкг ESC-Ag, полученного путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей H. Polymorpha KBT-11/pEMmulti-7 или H. Polymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или H. Polymorpha KBT-14/pEMmalt-8, или H. Polymorpha КБТ-14/pEMmono2.10 μg of ESC-Ag obtained by culturing a recombinant strain of the yeast H. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or H. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2.

10 мкг HBsAg серотипа ayw,10 mcg ayw serotype HBsAg,

3. Вакцина для профилактики вирусного гепатита В содержит:3. The vaccine for the prevention of viral hepatitis B contains:

10 мкг ESC-Ag, полученный путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей H. Polymorpha КБТ-11/ pEMmulti-7 или H. Polymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или H. Polymorpha KBT-14/pEMmalt-8, или H. Polymorpha КБТ-14/pEMmono2,10 μg ESC-Ag obtained by culturing a recombinant yeast strain of H. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or H. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2,

10 мкг HBsAg серотипа adw,10 mcg HBsAg serotype adw,

до 1.0 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), представленного 50 тМ Na-фосфатного буфера, рН 6.8 и 0.13 M NaCl.up to 1.0 ml of phosphate-salt buffer (FSB), represented by 50 tM Na-phosphate buffer, pH 6.8 and 0.13 M NaCl.

4. Вакцина для профилактики вирусного гепатита В содержит:4. The vaccine for the prevention of viral hepatitis B contains:

8 мкг ESC-Ag, полученного путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей H. Polymorpha KBT-11/pEMmulti-7 или H. Polymorpha КБТ-12/pEMmono-4, или H. Polymorpha КБТ-14/pEMmalt-8, или H. Polymorpha КБТ-14/рЕМmono2,8 μg of ESC-Ag obtained by culturing a recombinant yeast strain of H. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or H. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or H. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2,

8 мкг HBsAg серотипа ayw,8 mcg ayw serotype HBsAg,

8 мкг HBsAg серотипа adw,8 mcg HBsAg serotype adw,

60 мкг мертиолята,60 mcg of thiol,

0,5 мг геля гидроокиси алюминия,0.5 mg aluminum hydroxide gel,

до 1,0 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), представленного 50 mM Na-фосфатного буфера, рН 6.8 и 0.13 M NaCl.up to 1.0 ml of phosphate-buffered saline (PBS), represented by 50 mM Na-phosphate buffer, pH 6.8 and 0.13 M NaCl.

Согласно изобретению вакцины для профилактики вирусного гепатита В можно получать как с введением в их состав консерванта - мертиолята, так и без него. Отсутствие в вакцине консерванта не сказывается на ее качестве.According to the invention, vaccines for the prevention of viral hepatitis B can be obtained both with the introduction of a preservative - merthiolate, and without it. The absence of a preservative in the vaccine does not affect its quality.

Для детей готовят вакцины в прививочной дозе 0.5 мл.For children vaccines are prepared in a vaccination dose of 0.5 ml.

Иммуногенность рекомбинантных вакцин, определенная в тесте на мышах линии Balb/c с массой 12-14 г. в расчете на ED⁵⁰ (доза антигена, вызывающая сероконверсию у 50% мышей), составляет 0.05-0.10 мкг.The immunogenicity of recombinant vaccines, determined in a test on Balb / c mice weighing 12-14 g per ED ⁵⁰ (the dose of antigen that causes seroconversion in 50% of mice), is 0.05-0.10 μg.

Токсичность вакцины определяли путем введения белым мышам 0.5 мл (60 мкг) вакцины внутрибрюшинно и 0.5 мл (60 мкг) вакцины морским свинкам подкожно. Наблюдение в течение 7 суток показало, что вакцина не токсична.Vaccine toxicity was determined by injecting white mice with 0.5 ml (60 μg) of the vaccine intraperitoneally and 0.5 ml (60 μg) of the vaccine subcutaneously in guinea pigs. Observation over 7 days showed that the vaccine is not toxic.

Claims

1. Recombinant vaccine for the prevention of viral hepatitis B, containing an effective amount of a surface antigen of hepatitis B virus, an adjuvant and a physiologically acceptable diluent, characterized in that as a hepatitis B virus antigen, the recombinant vaccine contains in equal proportions a mixture of hepatitis B virus surface antigen having a G145R mutation (ESC-Ag) obtained by culturing a recombinant yeast strain of N. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or N. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, or N. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or N. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2, and HBsAg Ser ayw type and / or HBsAg serotype adw.

2. Recombinant vaccine for the prevention of viral hepatitis B according to claim 1, characterized in that it additionally contains merthiolate.

3. Recombinant vaccine for the prevention of viral hepatitis B, containing an effective amount of a surface antigen of hepatitis B virus, an adjuvant and a physiologically acceptable diluent, characterized in that, as an antigen of hepatitis B virus, a recombinant vaccine contains a surface hepatitis B virus antigen having a G145R mutation (ESC-Ag ) obtained by culturing a recombinant yeast strain of N. Polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7 or N. Polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, or N. Polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, or N. Polymorpha KBT-14 / pEMmono2.

4. Recombinant vaccine for the prevention of viral hepatitis B according to claim 3, characterized in that it additionally contains merthiolate.