RU2586513C1

RU2586513C1 - RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF MUTANT HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN (VERSIONS)

Info

Publication number: RU2586513C1
Application number: RU2015115515/10A
Authority: RU
Inventors: Михаил Александрович Крымский; Иван Андреевич Борисов; Михаил Симеонович Яковлев; Михаил Олегович Агафонов; Михаил Давидович Тер-Аванесян; Анатолий Петрович Суслов; Татьяна Анатольевна Семененко
Original assignee: Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех"
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2016-06-10

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, particularly to genetic engineering. Disclosed is Hansenula polymorpha yeast strain producer of recombinant hepatitis B virus surface antigen serotype "ayw", having mutation G145R (ESC-Ag) (versions). Strain comprises one or several copies of DNA sequence coding mutant antigen ESC-Ag, by promoter gene MOX or strain contains multiple copies of coding sequence by promoter gene MAL1, or strain contains one copy of coding sequence by promoter gene MOX and one copy of coding sequence under control of DAK gene promoter. Strain provides high yield of recombinant protein ESC-Ag with antigenic and immunogenic properties of natural antigen.

EFFECT: invention can be used in microbiological synthesis of recombinant protein ESC-Ag.

4 cl, 7 dwg, 1 tbl, 8 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии, и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В (Hepatitis В virus Surface Antigen, HBsAg), имеющего мутацию G145R.The invention relates to the field of biotechnology and genetic engineering, and can be used to create a yeast producer microbial surface antigen of hepatitis B virus (H epatitis B virus S urface A ntigen, HBsAg) , having a mutation G145R.

В последние годы было установлено, что имеет место распространение мутантных форм вируса гепатита В (ВГВ), которые не выявляются тестами иммунодетекции HBsAg и «ускользают» от защитного действия поствакцинального иммунитета. Такие мутантные формы ВГВ, отличительной чертой которых является экспрессия HBsAg с атипичными серологическими свойствами, были названы «ускользающими» («эскейп», «escape») мутантами.In recent years, it has been established that there is a proliferation of mutant forms of hepatitis B virus (HBV), which are not detected by HBsAg immunodetection tests and “escape” the protective effect of post-vaccination immunity. Such mutant forms of HBV, the hallmark of which is the expression of HBsAg with atypical serological properties, have been called “elusive” (“escape”) “mutants”.

Впервые существование таких мутантов ВГВ зарегистрировано в Италии. Позднее было показано (Carman W.F. et al., Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus, Lancet, 1990, v. 336, p. 325-329), что из 1590 лиц, вакцинированных против гепатита В, 32 (2%) оказались инфицированными ВГВ. У всех инфицированных определялось одновременное присутствие в крови и HBsAg, и антител к HBsAg. Вирус, выделенный из крови одного из инфицированных, оказался так называемым «ускользающим» мутантом ВГВ, отличающимся от вируса дикого типа по последовательности нуклеотидов в регионе S генома.For the first time, the existence of such HBV mutants was recorded in Italy. It was later shown (Carman WF et al., Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus, Lancet, 1990, v. 336, p. 325-329) that of 1590 individuals vaccinated against hepatitis B, 32 (2%) were infected with HBV. In all infected, the simultaneous presence in the blood of both HBsAg and antibodies to HBsAg was determined. The virus isolated from the blood of one of the infected turned out to be the so-called “elusive” HBV mutant, which differs from the wild-type virus in the sequence of nucleotides in region S of the genome.

Изменение нуклеотидной последовательности в регионе S генома ВГВ и последующие аминокислотные замены приводят к конформационным изменениям вирусных белков оболочки. Эти изменения способны вызвать пространственные затруднения во взаимодействии антигенных эпитопов с антителами, выработанными на антиген дикого типа, таким образом, позволяя мутантному вирусу преодолевать иммунную защиту и ускользать из-под вакцинного надзора. Особенно важны для ускользания вируса от протективного действия вакцин мутации детерминанты «а», которая локализована между 124-147 аминокислотными остатками (а.о.) в пределах главной гидрофильной петли (100-170 а.о.) (Weber В. Genetic variability of the S gene of hepatitis В virus: clinical and diagnostic impact, J.Clin. Virol., 2005, v. 32, p. 102-112).A change in the nucleotide sequence in region S of the HBV genome and subsequent amino acid substitutions lead to conformational changes in the viral envelope proteins. These changes can cause spatial difficulties in the interaction of antigenic epitopes with antibodies generated for the wild-type antigen, thus allowing the mutant virus to overcome immune defense and escape from vaccine surveillance. The mutations of the determinant “a”, which is localized between 124-147 amino acid residues (a.o.) within the main hydrophilic loop (100-170 a.o.) (Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact, J. Clin. Virol., 2005, v. 32, p. 102-112).

Наиболее важной среди серологически значимых аминокислотных замен является замена глицина в положении 145 на аргинин (G145R), вызванная точечной мутацией в позиции 587 нуклеотидной последовательности кодирующей области гена HBsAg дикого типа. Этот мутант стабилен на протяжении долгого времени и может сохранять способность к репликации несколько лет. Он обладает способностью к горизонтальной передаче другим людям. Факты внутрисемейной передачи были отмечены у 3-х из 10-ти носителей мутанта G145R, несмотря на присутствие в высоких концентрациях антител к HBsAg в крови всех заразившихся (Oon C.J. et al., Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis В virus surface antigen mutant G145R, J. Infect., 2000, v. 41, p. 260-26400). Возникновение этой мутации связывают с прессом вследствие вакцинации или специфической иммунотерапии. Частота мутаций G145R может колебаться от 0,4 до 5%. При динамическом наблюдении и определении мутантных форм среди новорожденных исследователи Тайваня выявили увеличение числа детей, инфицированных мутантными штаммами ВГВ. Так, в 1984 г. оно составило 7,8%, в 1989 г. - 19,6%, в 1994 г. - 28,1% (Hsu Ну et al., Hepatology, 1999, v. 30(5), p. 1312-7).The most important among serologically significant amino acid substitutions is the replacement of glycine at position 145 with arginine (G145R), caused by a point mutation at position 587 of the nucleotide sequence of the coding region of the wild-type HBsAg gene. This mutant is stable over time and can maintain replication ability for several years. He has the ability to horizontally transmit to other people. Intra-family transmission facts were noted in 3 out of 10 carriers of the G145R mutant, despite the presence of high concentrations of antibodies to HBsAg in the blood of all infected (Oon CJ et al., Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis B virus surface antigen mutant G145R, J. Infect., 2000, v. 41, p. 260-26400). The occurrence of this mutation is associated with the press due to vaccination or specific immunotherapy. The mutation frequency of G145R can range from 0.4 to 5%. During dynamic observation and determination of mutant forms among newborns, Taiwan researchers revealed an increase in the number of children infected with mutant HBV strains. So, in 1984 it amounted to 7.8%, in 1989 - 19.6%, in 1994 - 28.1% (Hsu Well et al., Hepatology, 1999, v. 30 (5), p. 1312-7).

На территории РФ, где широко распространены генотип D и серотип «ау», также выявлена циркуляция мутантных штаммов ВГВ, экспрессирующих HBsAg разных серотипов («ау» и «ad») с заменами G145R. Распространенность серологически значимой мутации G145R в московской области среди хронических носителей ВГВ составила 0,12% (А.И. Баженов и др. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2011, №5, с. 49-53). Учитывая высокий процент носительства ВГВ в человеческой популяции, выявленное количество мутантов ВГВ представляется значительным.In the territory of the Russian Federation, where genotype D and serotype “ay” are widespread, circulation of mutant HBV strains expressing HBsAg of different serotypes (“ay” and “ad”) with G145R substitutions is also found. The prevalence of the serologically significant mutation G145R in the Moscow region among chronic carriers of HBV was 0.12% (A.I. Bazhenov et al. Epidemiology and Vaccine Prevention, 2011, No. 5, pp. 49-53). Given the high percentage of HBV carriage in the human population, the detected number of HBV mutants appears to be significant.

Таким образом, «ускользающие» мутанты ВГВ G145R, представляя собой реплицирующие инфекционные вирусные мутанты, избегающие нейтрализующий иммунитет при вакцинации, основанной на нормальном HBsAg, могут быть причиной заболевания вирусным гепатитом. Существование и распространение «ускользающих» мутантов создает серьезную проблему как для донорства, так и для эффективности современной стратегии вакцинации. В связи с этим существует необходимость в создании вакцин нового поколения, полезных для профилактики гепатита В, вызываемого мутантами ВГВ.Thus, the “elusive” HBV G145R mutants, which are replicating infectious viral mutants that avoid neutralizing immunity in vaccines based on normal HBsAg, can cause viral hepatitis. The existence and spread of “elusive” mutants poses a serious problem for both donation and the effectiveness of a modern vaccination strategy. In this regard, there is a need to create a new generation of vaccines useful for the prevention of hepatitis B caused by HBV mutants.

Затруднения, препятствующие созданию эффективных вакцин для профилактики гепатита В, вызываемого мутантным ВГВ G145R, связаны с разработкой оптимальных экспрессионных систем для продукции рекомбинантного HBsAg, содержащего мутацию G145R, и обладающего высокими иммуногенными свойствами.Difficulties preventing the development of effective vaccines for the prevention of hepatitis B caused by mutant HBV G145R are associated with the development of optimal expression systems for the production of recombinant HBsAg containing the G145R mutation and possessing high immunogenic properties.

Известно получение полипептида HBsAg, имеющего аминокислотную последовательность с заменой в позиции 145 глицина на аргинин рекомбинантным путем (US 7038035, 02.05.2006). Из крови пациента (ребенок из Китая) был изолирован мутантный вирус гепатита В, несущий мутацию в последовательности HBsAg, которая была обусловлена заменой в нуклеотидной последовательности в позиции 587-589. Геном выделенного мутантного вируса относился к «adw» субтипу. Чтобы получить мутантный белок HBsAg был сконструирован экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность с AGA в позиции 587-589, соответствующую последовательности изолированного штамма вируса. Сконструированный вектор интродуцировали в подходящие клетки-хозяева, в частности клетки млекопитающих. Полученный путем культивирования рекомбинантных клеток млекопитающих мутантный HBsAg имеет кажущуюся молекулярную массу 23 kDa в отличие от 25 kDa HBsAg дикого типа и обладает более высокой иммуногенностью.It is known to obtain an HBsAg polypeptide having an amino acid sequence with substitution at position 145 of glycine for arginine by the recombinant route (US 7038035, 02/02/2006). A mutant hepatitis B virus was isolated from the blood of a patient (a child from China), carrying a mutation in the HBsAg sequence, which was caused by a substitution in the nucleotide sequence at positions 587-589. The genome of the isolated mutant virus belonged to the "adw" subtype. To obtain the mutant HBsAg protein, an expression vector was constructed containing the nucleotide sequence with AGA at position 587-589 corresponding to the sequence of an isolated virus strain. The constructed vector was introduced into suitable host cells, in particular mammalian cells. Mutant HBsAg obtained by culturing recombinant mammalian cells has an apparent molecular weight of 23 kDa as opposed to 25 kDa wild type HBsAg and has a higher immunogenicity.

Thomas Н.С. et al. в ряде патентов охарактеризовали вариант белка HBsAg с модифицированной детерминантой «а», в которой аминокислота глицин в позиции 145 заменена на аргинин (US 5639637, 1997), последовательность ДНК, кодирующую данный вариант белка (US 5854024, 1998), дрожжевой экспрессирующий вектор, включающий указанную последовательность (US 5,851823, 1998), набор для диагностики антител против варианта HBsAg (US 5989865, 1999), антитело против варианта HBsAg (US 6099840, 2000).Thomas N.S. et al. in a number of patents, a variant of the HBsAg protein with a modified determinant “a” was characterized, in which the amino acid glycine at position 145 was replaced by arginine (US 5639637, 1997), the DNA sequence encoding this protein variant (US 5854024, 1998), a yeast expression vector including the specified sequence (US 5.851823, 1998), a kit for the diagnosis of antibodies against the HBsAg variant (US 5989865, 1999), an antibody against the HBsAg variant (US 6099840, 2000).

Ближайшим аналогом является патент US 5639637, 1997, в котором описано получение варианта HBsAg, имеющего модифицированную детерминанту «а» с заменой глицина в положении 145 на аргинин, путем экспрессии кодирующего его гена в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Первоначально получали последовательность ДНК, кодирующую HBsAg серотипа «ау», которая содержала точечную мутацию, приводящую к замене кодона GGA, кодирующего глицин на кодон AGA, кодирующий аргинин, в позиции 145 полипептида HBsAg. Затем конструировали плазмиду pRIT13557, содержащую полученную последовательность, и этой плазмидой трансформировали дрожжевые клетки S. cerevisiae штамма DC5-cir⁰ (АТСС20820). После культивирования рекомбинантных дрожжевых клеток (Y1648) полученный вариант HBsAg выделяли, очищали и анализировали радиоиммунным и электронно-микроскопическим методами. Установлено, что антигенность полученного варианта отличается от таковой HBsAg дикого типа.The closest analogue is US Pat. No. 5,639,637,1997, which describes the preparation of an HBsAg variant having a modified determinant “a” replacing glycine at position 145 with arginine by expressing the gene encoding it in Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Initially, the DNA sequence encoding the HBsAg serotype “au” was obtained, which contained a point mutation, resulting in the replacement of the GGA codon encoding glycine with the AGA codon encoding arginine at position 145 of the HBsAg polypeptide. The plasmid pRIT13557 containing the obtained sequence was then constructed, and the yeast cells of S. cerevisiae strain DC5-cir ⁰ (ATCC20820) were transformed with this plasmid. After cultivation of recombinant yeast cells (Y1648), the resulting HBsAg variant was isolated, purified and analyzed by radio-immune and electron-microscopic methods. It was established that the antigenicity of the obtained variant differs from that of wild-type HBsAg.

Недостатки систем экспрессии HBsAg на основе S. cerevisiae связаны с проблемами достижения высокого выхода и низкой себестоимости целевого белка. Для увеличения уровня экспрессии, как правило, используют автономно реплицирующиеся мультикопийные векторы, требующие специальных селективных сред для предотвращения накопления бесплазмидных клеток в процессе культивирования штамма-продуцента. Это осложняет получение достаточного количества биомассы на единицу объема культуры. Другой проблемой использования автономно реплицирующегося экспрессионного вектора является существенная вариабельность его копийности в отдельных клетках культуры. В результате, в клетках с низкой копийностью вектора уровень экпрессии гена оказывается недостаточно высоким, а слишком высокая копийность может приводить к неспособности белка принять правильную конформацию из-за его гипер-продукции, и только часть клеток культуры содержит оптимальное количество копий экспрессионного вектора, способное обеспечить максимальный выход целевого белка. В качестве индуцируемого промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка, как правило, используют промотор гена GAL1, требующий для индукции использование больших количеств хорошо очищенной галактозы, являющейся достаточно дорогим веществом.The disadvantages of S. cerevisiae-based HBsAg expression systems are associated with problems in achieving high yield and low cost of the target protein. Autonomously replicating multicopy vectors, which require special selective media to prevent the accumulation of non-plasmid cells during the cultivation of the producer strain, are usually used to increase the level of expression. This makes it difficult to obtain a sufficient amount of biomass per unit volume of culture. Another problem of using an autonomously replicating expression vector is the significant variability of its copy number in individual cells of the culture. As a result, in cells with a low copy number of the vector, the level of gene expression is not high enough, and too high copy number can lead to the inability of the protein to accept the correct conformation due to its hyper-production, and only part of the culture cells contains the optimal number of copies of the expression vector, which can provide maximum yield of the target protein. As an inducible promoter providing a high level of expression of the recombinant protein, the GAL1 gene promoter is usually used, which requires the use of large amounts of well-purified galactose, which is a rather expensive substance, for induction.

Задачей изобретения является создание эффективного микробиологического дрожжевого штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), антигенные свойства которого позволяли бы использовать его в качестве вакцины для защиты от мутантной формы "Escape" вируса гепатита В. Под эффективностью понимается возможность получения целевого продукта, обладающего необходимыми биологическими свойствами (правильная конформация, иммуногенность, чистота) и низкой себестоимостью.The objective of the invention is to provide an effective microbiological yeast strain producing a surface antigen of hepatitis B virus, having the G145R mutation (ESC-Ag), the antigenic properties of which would allow using it as a vaccine to protect against the mutant form of the Escape virus of hepatitis B. By efficiency is meant the ability to obtain the target product with the necessary biological properties (proper conformation, immunogenicity, purity) and low cost.

Задача решена тем, что, согласно изобретению, в первом варианте для получения рекомбинантного штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена метанолоксидазы (МОХ Н. polymorpha) и селективным маркером (ген LEU2 S. cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма Н. polymorpha DL1-L (Sohn J.H. et al., J Bacteriol. 1996, 178:4420-4428). Для получения клонов, содержащих в геноме несколько копий плазмиды, применена процедура селекции множественной интеграции. По результатам проверки клонов, полученных в результате этой процедуры, на способность синтезировать белок ESC-Ag, был выделен трансформант с наибольшей продуктивностью. Т.к. искусственный ген интегрирован в геном дрожжей, т.е. находится в составе одной из хромосом, это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок. Полученный рекомбинантный штамм, содержащий несколько копий целевого гена под контролем промотора МОХ, позволяет добиваться более высоких уровней синтеза рекомбинантного белка ESC-Ag при более простых способах получения культур высокой плотности. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ11/pEMmulti-7. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.The problem is solved in that, according to the invention, in the first embodiment, to obtain a recombinant producer strain of hepatitis B virus surface antigen having a G145R mutation (ESC-Ag), a plasmid containing a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of a promoter gene methanol oxidase (MOX N. polymorpha) and a selective marker (gene LEU2 S. cerevisiae) are integrated into the genome of the recipient strain of H. polymorpha DL1-L (Sohn JH et al., J Bacteriol. 1996, 178: 4420-4428). To obtain clones containing several copies of the plasmid in the genome, a multiple integration selection procedure was used. According to the results of testing the clones obtained as a result of this procedure for the ability to synthesize ESC-Ag protein, the transformant with the highest productivity was isolated. Because the artificial gene is integrated into the genome of yeast, i.e. It is part of one of the chromosomes, this ensures high mitotic stability of the strain, making it possible to optimize the conditions for its cultivation without taking into account the risk of accumulation of cells that have lost the ability to synthesize foreign protein. The resulting recombinant strain containing several copies of the target gene under the control of the MOX promoter allows to achieve higher levels of synthesis of the recombinant ESC-Ag protein with simpler methods for producing high density cultures. The strain was deposited May 20, 2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT11 / pEMmulti-7. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Согласно изобретению, во втором варианте рекомбинантный штамм-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), получали интеграцией в геном штамма DL1-L (Н. polymorpha) одной копии синтетической последовательности ДНК, кодирующей ESC-Ag, под контролем промотора гена МОХ. Для этого в качестве реципиента был использован штамм DLT2, полученный в результате инактивации в штамме DL1-L генов МОХ и TRP3 интеграцией селективного маркера, гена LEU2 S. cerevisiae, аналогично тому, как это было сделано ранее (Bogdanova A.I., Agaphonov М.О. et al., Yeast, 1995, Apr. 15; 11 (4): 343-53). Это давало возможность с высокой эффективностью отбирать трансформанты, в которых интеграция синтетической последовательности происходила по механизму гомологичной рекомбинации с последовательностями локуса гена МОХ, в результате чего происходила замена кодирующей области этого гена на последовательность, кодирующую ESC-Ag. Уровень экспрессии ESC-Ag, который достигается у полученного таким образом штамма, подходит для увеличения доли антигена во фракции растворимых клеточных белков. Поскольку такой штамм содержит только одну копию рекомбинантного гена, интегрированную в строго определенный локус генома, реплика этого гена может быть получена при помощи полимеразной цепной реакции для контроля отсутствия в нем мутаций, которые могли образоваться в процессе его введения в геном дрожжей или при культивировании штамма-продуцента. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ12/pEMmono-4. Штамм является новым, и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, in a second embodiment, a recombinant strain producing the hepatitis B virus surface antigen having the G145R mutation (ESC-Ag) was obtained by integrating into the genome of strain DL1-L (H. polymorpha) one copy of the synthetic DNA sequence encoding ESC-Ag under control of the promoter of the MOX gene. For this, the DLT2 strain was used as a recipient, obtained by inactivation of the MOX and TRP3 genes in the DL1-L strain by integration of the selectable marker, the S. cerevisiae LEU2 gene, similarly to what was done earlier (Bogdanova AI, Agaphonov M.O. et al., Yeast, 1995, Apr. 15; 11 (4): 343-53). This made it possible to select transformants with high efficiency in which the synthetic sequence was integrated by the mechanism of homologous recombination with the MOX gene locus sequences, as a result of which the coding region of this gene was replaced by a sequence encoding ESC-Ag. The level of expression of ESC-Ag, which is achieved in the thus obtained strain, is suitable for increasing the proportion of antigen in the fraction of soluble cellular proteins. Since such a strain contains only one copy of the recombinant gene integrated into a strictly defined locus of the genome, a replica of this gene can be obtained using a polymerase chain reaction to control the absence of mutations in it that could have formed during its introduction into the yeast genome or during cultivation of the strain producer. The strain was deposited on 05/20/2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT12 / pEMmono-4. The strain is new, and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Согласно изобретению, в третьем варианте для получения рекомбинантного штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена мальтазы (MALI Н. polymorpha) и селективным маркером (ген LEU2 S. cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма Н. polymorpha DL1-L. Для получения клонов, содержащих в геноме несколько копий плазмиды, применена процедура селекции множественной интеграции. По результатам проверки полученных в результате этой процедуры клонов на способность синтезировать белок поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R, был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. Полученный рекомбинантный штамм, содержащий несколько копий целевого гена под контролем промотора MALI, депонирован 20.05.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером KBT14/pEMmalt-8. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, in a third embodiment, to obtain a recombinant producer strain of hepatitis B virus surface antigen having a G145R mutation (ESC-Ag), a plasmid containing a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of the maltase gene promoter (MALI N. polymorpha) and a selective marker (LEU2 gene of S. cerevisiae) are integrated into the genome of the recipient strain of H. polymorpha DL1-L. To obtain clones containing several copies of the plasmid in the genome, a multiple integration selection procedure was used. According to the results of testing the clones obtained as a result of this procedure for the ability to synthesize the hepatitis B virus surface antigen protein having the G145R mutation, a transformant that best meets the required properties was isolated. The resulting recombinant strain containing several copies of the target gene under the control of the MALI promoter was deposited on May 20, 2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT14 / pEMmalt-8. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Согласно изобретению, в 4-м варианте для получения рекомбинантного штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В, имеющего мутацию G145R (ESC-Ag), в геном штамма DL1-L Н. polymorpha последовательно интегрируют две экспрессионные кассеты, содержащие по одной копии нужного гена. Первая кассета содержит фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим ESC-Ag, под контролем промотора гена МОХ (ген метанолоксидазы). Интеграция этой кассеты проходила по механизму гомологичной интеграции в локус гена МОХ. Вторая экспрессионная кассета содержит аналогичный ген ESC-Ag, но под контролем промотора гена DAK (ген кодирует дигидроксиацетон киназу) дрожжей Н. polymorpha. Интеграция этой кассеты проходила по механизму гомологичной интеграции в локус гена LEU2. В результате трансформации получают рекомбинантный штамм, содержащий одну копию целевого гена ESC-Ag под контролем промотора DAK и одну копию под контролем промотора МОХ. При этом искусственные гены интегрированы непосредственно в геном штамма-продуцента, т.е. находятся в составе хромосом дрожжей Н. polymorpha. Это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок. Кроме того, наличие в каждом из локусов интеграции только одной копии рекомбинантного гена с уникальной промоторной и терминаторной областью позволяет контролировать отсутствие мутаций этого гена в процессе его введения в геном и при культивировании штамма. Контроль за отсутствием мутаций осуществляют путем анализа нуклеотидной последовательности продуктов полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных специфическим последовательностям, фланкирующим кодирующую область рекомбинантного гена в каждом из локусов интеграции. Использование экспрессионных кассет с двумя разными промоторами (МОХ и DAK), максимальная активность которых достигается при разных условиях культивирования, обеспечивает большую равномерность синтеза продукта в процессе культивирования штамма. При этом не превышается уровень синтеза белка, который может привести к возможному нарушению эффективности укладки и, как следствие, снижению продуктивности штамма. В результате отбора клонов, способных синтезировать белок ESC-Ag, был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. Штамм депонирован 20.05.2014 в коллекции ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ-14/pEMmono2. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, in the 4th embodiment, in order to obtain a recombinant producer strain of hepatitis B virus surface antigen having the G145R mutation (ESC-Ag), two expression cassettes, one copy of the desired gene, are sequentially integrated into the genome of the DL1-L strain H. polymorpha . The first cassette contains a DNA fragment with a recombinant gene encoding ESC-Ag, under the control of the promoter of the MOX gene (methanol oxidase gene). The integration of this cassette took place according to the mechanism of homologous integration into the locus of the MOX gene. The second expression cassette contains a similar ESC-Ag gene, but under the control of the DAK gene promoter (the gene encodes the dihydroxyacetone kinase) of H. polymorpha yeast. The integration of this cassette took place according to the mechanism of homologous integration into the LEU2 gene locus. The transformation produces a recombinant strain containing one copy of the target ESC-Ag gene under the control of the DAK promoter and one copy under the control of the MOX promoter. Moreover, the artificial genes are integrated directly into the genome of the producer strain, i.e. are part of the chromosomes of the yeast H. polymorpha. This ensures high mitotic stability of the strain, making it possible to optimize the conditions for its cultivation without taking into account the risk of accumulation of cells that have lost the ability to synthesize a foreign protein. In addition, the presence in each of the integration loci of only one copy of a recombinant gene with a unique promoter and terminator region allows us to control the absence of mutations of this gene during its introduction into the genome and during cultivation of the strain. The absence of mutations is monitored by analyzing the nucleotide sequence of the products of the polymerase chain reaction using primers complementary to specific sequences flanking the coding region of the recombinant gene at each of the integration loci. The use of expression cassettes with two different promoters (MOX and DAK), the maximum activity of which is achieved under different cultivation conditions, provides a more uniform synthesis of the product during the cultivation of the strain. At the same time, the level of protein synthesis is not exceeded, which can lead to a possible violation of the laying efficiency and, as a result, a decrease in the strain productivity. As a result of the selection of clones capable of synthesizing the ESC-Ag protein, a transformant that best meets the required properties was isolated. The strain was deposited 05/20/2014 in the collection of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT-14 / pEMmono2. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Полученные рекомбинантные штаммы-продуценты КБТ-11/pEMmulti-7, КБТ-12/pEMmono-4, KBT-14/pEMmalt-8 и КБТ-14/pEMmono2 могут быть использованы для получения с высоким выходом белка ESC-Ag в виде вирусоподобных частиц, обладающего антигенными свойствами, необходимыми для его использования в качестве основного компонента вакцины для защиты от мутантного варианта Escape вируса гепатита В человека. Образование вирусоподобных частиц подтверждали с использованием метода электронной микроскопии и гель-фильтрационной хроматографии.The resulting recombinant producer strains KBT-11 / pEMmulti-7, KBT-12 / pEMmono-4, KBT-14 / pEMmalt-8 and KBT-14 / pEMmono2 can be used to obtain high-yield ESC-Ag protein in the form of virus-like particles possessing the antigenic properties necessary for its use as the main component of the vaccine for protection against the mutant variant of Escape human hepatitis B virus. The formation of virus-like particles was confirmed using electron microscopy and gel filtration chromatography.

Технический результат предложенного изобретения заключается в повышении иммуногенности и серологического соответствия природному мутанту полученного рекомбинантного белка Esc-Ag.The technical result of the proposed invention is to increase the immunogenicity and serological compliance of the natural mutant of the obtained recombinant protein Esc-Ag.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.The invention can be illustrated by the following examples.

В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Трансформацию клеток Escherichia coli и Hansenula polymorpha осуществляли согласно ранее описанным методам (Inoue Н. et al., Gene, 1990, 96:23-28 и Bogdanova A.I. et al., Yeast, 1995, 11(4):343-53 соответственно). Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали полимеразу Pwo (Roche). Синтез олигонуклеотидов, получение фрагмента ДНК, содержащего последовательность, кодирующую ESC-Ag (SEQ ID NO: 1), а также определение последовательности нуклеотидов производились ЗАО "Евроген" г. Москва.In the given examples, all genetic engineering operations were performed according to standard procedures and instructions of companies producing enzymes and sets for manipulating DNA in vitro. The transformation of Escherichia coli and Hansenula polymorpha cells was carried out according to the previously described methods (Inoue H. et al., Gene, 1990, 96: 23-28 and Bogdanova AI et al., Yeast, 1995, 11 (4): 343-53, respectively) . For polymerase chain reaction (PCR), Pwo polymerase (Roche) was used. The synthesis of oligonucleotides, the preparation of a DNA fragment containing the sequence encoding ESC-Ag (SEQ ID NO: 1), as well as the determination of the nucleotide sequence, were carried out by ZAO Evrogen, Moscow.

Пример 1. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего несколько копий рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ.Example 1. Obtaining a strain of N. polymorpha containing several copies of the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter.

Получали плазмиду pIR4-7 (Рисунок 1; SEQ ID NO: 2), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag. Этот ген включал промоторную область гена МОХ Н. polymorpha (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4338-4862) и синтетическую последовательность (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4863-5554), содержащую открытую рамку считывания ESC-Ag (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4874-5551), последовательность которой совпадала с последовательностью открытой рамки считывания гена HBsAg "ayw2" дикого типа за исключением позиции 433, в которой вместо остатка гуанина находился остаток аденина (SEQ ID NO: 2, нуклеотидная позиция 5306). Помимо этого гена, плазмида pIR4-7 состояла из: (а) фрагмента плазмиды рАМ619 (Agaphonov and Alexandrov, FEMS Yeast Res., 2014, 14(7): 1048-54), включающего бактериальный селективный маркер устойчивости к ампициллину и дрожжевой селективный маркер - модифицированный ген LEU2 S. cerevisiae (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 895-4337), (б) фрагмента плазмиды AMIpSLl (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15 (7): 541-51), несущего терминатор транскрипции и автономно-реплицирующуюся последовательность Н. polymorpha, (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 7-894) и (в) линкерной последовательности (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 1-6).The plasmid pIR4-7 (Figure 1; SEQ ID NO: 2) was obtained, which contained the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide. This gene included the promoter region of the M. polymorpha MOX gene (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4338-4862) and a synthetic sequence (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4863-5554) containing an open reading frame of ESC-Ag (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4874-5551), the sequence of which coincided with the open reading frame of the wild-type HBsAg "ayw2" gene with the exception of position 433, in which instead of the guanine residue was the adenine residue (SEQ ID NO: 2, nucleotide position 5306) . In addition to this gene, plasmid pIR4-7 consisted of: (a) a fragment of plasmid pAM619 (Agaphonov and Alexandrov, FEMS Yeast Res., 2014, 14 (7): 1048-54), including a bacterial selective marker of ampicillin resistance and a yeast selective marker - a modified LEU2 gene of S. cerevisiae (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 895-4337), (b) a fragment of plasmid AMIpSLl (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15 (7): 541-51) carrying a transcription terminator and an autonomously replicating sequence of H. polymorpha, (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 7-894) and (c) a linker sequence (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 1-6).

Штамм DL1-L трансформировали плазмидой pIR4-7. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. Несколько выросших трансформантов посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших колоний отобрали самые крупные и снова посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока вырастающие при рассеве колонии не стали одинаковыми по скорости роста. По одному такому субклону нескольких независимых трансформантов отобрали для анализа продукции белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-11/pEMmulti-7.Strain DL1-L was transformed with plasmid pIR4-7. Transformants were selected on leucine-free medium. Several grown transformants were seeded onto a solid leucine-free medium with a draining stroke to obtain individual colonies. Among the grown colonies, the largest were selected and again sown on solid medium without leucine with a draining stroke. This procedure was repeated until the colonies growing during sieving were equal in growth rate. For one such subclone, several independent transformants were selected for analysis of ESC-Ag protein production. One of these transformants was designated KBT-11 / pEMmulti-7.

Пример 2. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего одну копию рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ.Example 2. Obtaining a strain of H. polymorpha containing one copy of a recombinant gene encoding an ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter.

Получали плазмиду рАМ618 (Рисунок 2А; SEQ ID NO: 3), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 4188-5715). После терминирующего кодона этого гена находился фрагмент локуса гена МОХ, включающий его терминаторную область и часть гена TRP3 (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 1-1358). Помимо этих последовательностей плазмида рАМ618 содержала векторную последовательность для ее поддержания в клетках Е. coli, состоящую из фрагмента PciI-StuI плазмиды pUK21 (Vieira J. Et al., Gene. 1991, 100:189-94) (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 3818-4187) и фрагмента Ecl136II-PciI плазмиды pBlueScriptKS+ (Stratagen, USA) (SEQ ID NO: 3, нуклеотидные позиции 1359-3817).The plasmid pAM618 (Figure 2A; SEQ ID NO: 3) was obtained, which contained the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide under the control of the MOX promoter (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 4188-5715). After the termination codon of this gene, there was a fragment of the MOX gene locus, including its termination region and part of the TRP3 gene (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 1-1358). In addition to these sequences, the pAM618 plasmid contained a vector sequence for its maintenance in E. coli cells, consisting of a PciI-StuI fragment of the pUK21 plasmid (Vieira J. Et al., Gene. 1991, 100: 189-94) (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 3818-4187) and an Ecl136II-PciI fragment of the plasmid pBlueScriptKS + (Stratagen, USA) (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 1359-3817).

Штамм DLT2 трансформировали смесью фрагментов плазмиды рАМ618, гидролизованной рестриктазами Ec1136II и XhoI. Трансформантов отбирали на среде, содержащей лейцин и не содержащей триптофан. В локусе МОХ штамма DLT2 интегрирован селективный маркер, ген LEU2 S. cerevisiae, обеспечивающий штамму способность расти на среде без лейцина. При интеграции рекомбинантного гена в локус МОХ путем двойного кроссинговера, ген LEU2 должен замещаться (Рисунок 2Б). Поэтому полученные трансформанты проверяли на способность расти на среде, не содержащей лейцин. Неспособность трансформантов расти на среде без лейцина свидетельствовала об интеграции рекомбинантного гена в локус МОХ путем двойного кроссинговера. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-12/pEMmono-4.The DLT2 strain was transformed with a mixture of fragments of plasmid pAM618 hydrolyzed with restriction enzymes Ec1136II and XhoI. Transformants were selected on medium containing leucine and not containing tryptophan. A selective marker, the S. cerevisiae LEU2 gene, is integrated into the MOX locus of strain DLT2, which provides the strain with the ability to grow on a medium without leucine. When a recombinant gene is integrated into the MOX locus by double crossing over, the LEU2 gene must be replaced (Figure 2B). Therefore, the obtained transformants were tested for their ability to grow on a medium not containing leucine. The inability of transformants to grow on a medium without leucine testified to the integration of the recombinant gene into the MOX locus by double crossing over. One of these transformants was designated KBT-12 / pEMmono-4.

Пример 3. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего несколько копий рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора MAL1.Example 3. Obtaining a strain of N. polymorpha containing several copies of the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the MAL1 promoter.

Получали плазмиду pMAL-ESCl (Рисунок 3; SEQ ID NO: 4), которая отличалась от плазмиды pIR4-7 тем, что фрагмент, несущий промотор МОХ (SEQ ID NO: 2, нуклеотидные позиции 4390-4862) был заменен на фрагмент, несущий промотор гена MAL1 Н. polymorpha DL1 (SEQ ID NO: 4, нуклеотидные позиции 1-1326).The plasmid pMAL-ESCl (Figure 3; SEQ ID NO: 4) was obtained, which differed from the plasmid pIR4-7 in that the fragment bearing the MOX promoter (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4390-4862) was replaced by a fragment carrying MAL1 gene promoter H. polymorpha DL1 (SEQ ID NO: 4, nucleotide positions 1-1326).

Штамм DL1-L трансформировали плазмидой pMAL-ESC1. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. Несколько выросших трансформантов рассевали истощающим штрихом на твердую среду без лейцина, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших колоний отбирали самые крупные и снова сеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока вырастающие при рассеве колонии не стали одинаковыми по скорости роста. По одному такому субклону нескольких независимых трансформантов отбирали для анализа продукции белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-14/pEMmalt-8.Strain DL1-L was transformed with plasmid pMAL-ESC1. Transformants were selected on leucine-free medium. Several grown transformants were scattered with an exhausting touch on a solid medium without leucine to obtain separate colonies. Among the grown colonies, the largest were selected and again sown on solid medium without leucine with a draining stroke. This procedure was repeated until the colonies growing during sieving were equal in growth rate. One such subclone of several independent transformants was selected for analysis of ESC-Ag protein production. One of these transformants was designated KBT-14 / pEMmalt-8.

Пример 4. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего одну копию рекомбинантного гена, кодирующего полипептид ESC-Ag, под контролем промотора МОХ и одну копию под контролем промотора DAK.Example 4. Obtaining a strain of H. polymorpha containing one copy of a recombinant gene encoding an ESC-Ag polypeptide, under the control of the MOX promoter and one copy under the control of the DAK promoter.

Получали плазмиду pDAK-ESC1 (Рисунок 4; SEQ ID NO: 5), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид ESC-Ag, под контролем промотора DAK Н. polymorpha DL-1 (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 4404-5727) и последовательность вектора AMIpLD1 (Agaphonov et al., Yeas,. 1999, 15 (7): 541-51) (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 43-4403), включая дрожжевой селективный маркер ген LEU2 Н. polymorpha с делецией в промоторной области, а также линкерную последовательность (SEQ ID NO: 5, нуклеотидные позиции 1-42).The plasmid pDAK-ESC1 (Figure 4; SEQ ID NO: 5) was obtained, which contained the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide under the control of the DAK promoter polymorpha DL-1 (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 4404-5727) and the sequence of the vector AMIpLD1 (Agaphonov et al., Yeas, 1999, 15 (7): 541-51) (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 43-4403), including the yeast selective marker H. polymorpha deletion LEU2 gene with a deletion in the promoter region, as well as the linker sequence (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 1-42).

Штамм КБТ-12/pEMmono-4 (см. Пример 2) трансформировали плазмидой pDAK-ESC1, гидролизованной рестриктазой BstEII. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. У быстро растущих трансформантов проверяли продукцию белка ESC-Ag. Один из таких трансформантов был обозначен КБТ-14/pEMmono-2.Strain KBT-12 / pEMmono-4 (see Example 2) was transformed with the plasmid pDAK-ESC1 hydrolyzed by BstEII restrictase. Transformants were selected on leucine-free medium. In fast-growing transformants, ESC-Ag protein production was tested. One of these transformants was designated KBT-14 / pEMmono-2.

Пример 5. Культивирование штаммов Н. polymorpha КБТ 11/pEMmulti-7, КБТ 12/pEMmono-4 и КБТ-14/pEMmono2.Example 5. Cultivation of strains of H. polymorpha KBT 11 / pEMmulti-7, KBT 12 / pEMmono-4 and KBT-14 / pEMmono2.

Ферментацию штаммов-продуцентов дрожжей Н. polymorpha осуществляли в два этапа. На первом этапе культивирования в режиме фед-бэтч при температуре 30°С наращивали биомассу в культуральной среде, содержащей 4% дрожжевого экстракта, 2% бакто-пептона и 4% глицерина. Процесс вели до истощения источника углерода в питательной среде и прекращения роста биомассы. На втором этапе культивирование проводили с подпиткой культуры путем непрерывной подачи 30%-ного раствора дрожжевого экстракта. Одновременно с подпиткой добавляли индуктор до концентрации 0.5-0.8% и поддерживали на этом уровне в течение 48-72 ч. Продолжительность всего процесса составляла около 96 ч.The fermentation of strains producing yeast H. polymorpha was carried out in two stages. At the first stage of cultivation in the fed-batch mode at a temperature of 30 ° C, biomass was increased in a culture medium containing 4% yeast extract, 2% bacto-peptone and 4% glycerol. The process was conducted until the carbon source in the nutrient medium was depleted and the biomass stopped growing. In the second stage, the cultivation was carried out with feeding the culture by continuous supply of a 30% solution of yeast extract. Simultaneously with the replenishment, the inductor was added to a concentration of 0.5-0.8% and maintained at this level for 48-72 hours. The duration of the whole process was about 96 hours.

Пример 6. Культивирование штамма Н. polymorpha КБТ-14/pEMmalt-8, содержащего рекомбинантный ген ESC-Ag под контролем промотора MAL1.Example 6. Cultivation of H. polymorpha strain KBT-14 / pEMmalt-8 containing the recombinant ESC-Ag gene under the control of the MAL1 promoter.

Ферментацию штамма-продуцента KBT-14/pEMmalt-8 проводили в тех же условиях, что и штаммы с промоторами МОХ и DAK (Пример 5). За исключением того, что на втором этапе культивирования в качестве индуктора использовали 40% (вес.//об.) раствор сахарозы, который добавляли порциями по 0.5% (вес сахарозы / объем культуральной жидкости) через каждые два часа в течение 48-72 ч.The fermentation of the producer strain KBT-14 / pEMmalt-8 was carried out under the same conditions as the strains with MOX and DAK promoters (Example 5). Except that in the second stage of cultivation, a 40% (weight./vol.) Sucrose solution was used as an inductor, which was added in 0.5% portions (sucrose weight / volume of culture liquid) every two hours for 48-72 hours .

Пример 7. Выделение и очистка рекомбинантного белка ESC-Ag из клеток H. polymorpha.Example 7. Isolation and purification of recombinant ESC-Ag protein from H. polymorpha cells.

После ферментации белок ESC-Ag (аминокислотная последовательность - SEQ ID NO: 6) выделяли согласно опубликованной методике (Lunsdorf Н. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10: 48) с небольшими изменениями. Клетки из культуральной жидкости осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 мин при 4°С. Осажденную биомассу ресуспендировали до исходного объема в карбонатно-солевом буферном растворе для экстракции (50 mM NaHCO₃, 150 mM NaCl, рН 8.0) и снова осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 мин при 4°С. Полученную таким образом отмытую биомассу ресуспендировали в буферном растворе для экстракции с добавлением 1.7 mM EDTA и 2 mM PMSF до концентрации 400 г влажных клеток на литр суспензии. Далее клетки разрушали в проточном дезинтеграторе Dyno-Mill типа KDL при температуре 5-10°С, используя стеклянные шары диаметром 0.5-0.7 мм. Для удаления клеточного дебриса полученный гомогонизат центрифугировали при 4000g в течение 60 мин при 4°С.After fermentation, the ESC-Ag protein (amino acid sequence — SEQ ID NO: 6) was isolated according to a published procedure (Lunsdorf, H. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10: 48) with slight changes. Cells from the culture fluid were besieged by centrifugation at 4000 g for 30 min at 4 ° C. The precipitated biomass was resuspended to the initial volume in carbonate-salt extraction buffer (50 mM NaHCO ₃ , 150 mM NaCl, pH 8.0) and again precipitated by centrifugation at 4000 g for 30 min at 4 ° C. The washed biomass thus obtained was resuspended in extraction buffer with 1.7 mM EDTA and 2 mM PMSF added to a concentration of 400 g wet cells per liter of suspension. Next, the cells were destroyed in a Dyno-Mill flow disintegrator of the KDL type at a temperature of 5-10 ° C using glass balls with a diameter of 0.5-0.7 mm. To remove cell debris, the resulting homogonizate was centrifuged at 4000 g for 60 min at 4 ° C.

Полученный осветленный гомогенизат подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на системе Sartocon через мембрану с порогом отсечения 300 kDa (Sartorius, Германия), одновременно концентрировали и переводили в фосфатно-солевой буферный раствор (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 6.8). При этом отделяется большая часть примесных низкомолекулярных белков.The resulting clarified homogenizate was subjected to tangential flow ultrafiltration on a Sartocon system through a membrane with a cutoff threshold of 300 kDa (Sartorius, Germany), was simultaneously concentrated and transferred to phosphate-buffered saline (10 mM NaH ₂ PO ₄ , 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, pH 6.8). In this case, most of the impurity low molecular weight proteins are separated.

Дальнейшую очистку проводили методом адсорбционной хроматографии на колонке с макропористым стеклом (МПС) с использованием технологии Streamline (хроматография в восходящем потоке). Концентрированный раствор ESC-Ag, полученный после ультрафильтрации, наносили на колонку при скорости 1 мл/мин, промывали 3-4 объемами фосфатно-солевого буферного раствора (рН 6.8) и элюировали карбонатным буфером (50 mM NaHCO₃, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 9.5).Further purification was carried out by adsorption chromatography on a column with macroporous glass (MPS) using Streamline technology (upstream chromatography). The concentrated ESC-Ag solution obtained after ultrafiltration was applied to the column at a speed of 1 ml / min, washed with 3-4 volumes of phosphate-buffered saline (pH 6.8) and eluted with carbonate buffer (50 mM NaHCO ₃ , 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, pH 9.5).

Объединенные фракции, содержащие ESC антиген (определяли по иммуноблоту и SDS-PAGE), концентрировали ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембране 300 KDa и разделяли при помощи зонального ультрацентрифугирования (Beckman Coulter, USA) в градиенте плотности сахарозы (20-50% вес./вес.). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, а затем очищали гельфильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (ToyoSoda Corp., Japan) в фосфатном буферном растворе (10 mM NaH₂PO₄, 0.03% Tween-20, рН 7.2).The pooled fractions containing the ESC antigen (determined by immunoblot and SDS-PAGE) were concentrated by tangential flow ultrafiltration on a 300 KDa membrane and separated by zonal ultracentrifugation (Beckman Coulter, USA) in a sucrose density gradient (20-50% w / w) .). The fractions containing the target protein were combined and then purified by gel filtration on a Toyopearl HW-65 sorbent (ToyoSoda Corp., Japan) in phosphate buffered saline (10 mM NaH ₂ PO ₄ , 0.03% Tween-20, pH 7.2).

Чистоту полученного таким образом рекомбинантного белка ESC-Ag определяли методом SDS-PAGE электрофореза. Если чистота белка была недостаточна (менее 95%) производили дополнительную очистку при помощи анионообменной хроматографии на сорбенте Toyopearl DEAE-650M.The purity of the thus obtained recombinant ESC-Ag protein was determined by SDS-PAGE electrophoresis. If the protein purity was insufficient (less than 95%), additional purification was performed using anion exchange chromatography on a Toyopearl DEAE-650M sorbent.

В результате этих операций удается выделить около 30% антигена, присутствующего в осветленном клеточном лизате. Выход очищенного ESC-Ag составлял не менее 50 мг/л культуральной жидкости.As a result of these operations, it is possible to isolate about 30% of the antigen present in the clarified cell lysate. The yield of purified ESC-Ag was at least 50 mg / L of culture fluid.

Пример 8. Анализ рекомбинантного ESC-Ag.Example 8. Analysis of recombinant ESC-Ag.

1) Чистота рекомбинантного ESC-Ag определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) путем окрашивания с Coomassie Brilliant Blue R-250 и/или серебром. Анализ интенсивности полос отсканированных гелей проводится посредством компьютерной программы NIH Image (Рисунок 5).1) The purity of recombinant ESC-Ag is determined by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions (SDS-PAGE) by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250 and / or silver. The analysis of the intensity of the bands of scanned gels is carried out using the NIH Image computer program (Figure 5).

2) Образование вирусоподобных частиц (ВПЧ) рекомбинантного белка ESC-Ag подтверждали методом гель-фильтрационной хроматографии на полимерной колонке TSK G5000PW диаметром 7.5 мм и длиной 60 см, соединенной с предколонкой PrePW диаметром 7.5 мм и длиной 7.5 см (Tosoh Bioscience, Japan). Разделение проводили в фосфатном буферном растворе (10 mM KH₂PO₄, (рН 7.2), 0.03% Tween-20) при скорости потока 0.6 мл/мин. Мониторинг процесса осуществляли по поглощению на 280 нм. Размер пор сорбента 1000Å позволяет отделить правильно собранные ВПЧ от мономеров и агрегатов Esc-антигена. Время элюции очищенного препарата ESC-Ag соответствует времени элюции вирусоподобных частиц 23-26 мин (Рисунок 6).2) The formation of virus-like particles (HPV) of the recombinant ESC-Ag protein was confirmed by gel filtration chromatography on a TSK G5000PW polymer column with a diameter of 7.5 mm and a length of 60 cm connected to a PrePW column with a diameter of 7.5 mm and a length of 7.5 cm (Tosoh Bioscience, Japan). Separation was carried out in a phosphate buffer solution (10 mM KH ₂ PO ₄ , (pH 7.2), 0.03% Tween-20) at a flow rate of 0.6 ml / min. The process was monitored by absorbance at 280 nm. The sorbent pore size of 1000Å allows you to separate correctly collected HPV from monomers and aggregates of Esc antigen. The elution time of the purified ESC-Ag preparation corresponds to the elution time of virus-like particles of 23-26 min (Figure 6).

Электронно-микроскопический анализ полученного антигена показал наличие в образце частиц размером 15-25 нм. округлой и овальной формы. Ободок частиц имел низкую электронную плотность и относительно более темный центр при окраске 1% раствором молибдата аммония и уранилацетата (Рисунок 7). Эти данные подтверждают то, что полученный Esc-антиген собирается в вирусоподобные частицы.Electron microscopic analysis of the obtained antigen showed the presence of particles with a size of 15-25 nm. round and oval. The rim of the particles had a low electron density and a relatively darker center when stained with a 1% solution of ammonium molybdate and uranyl acetate (Figure 7). These data confirm that the resulting Esc antigen is assembled into virus-like particles.

3) Иммуноспецифичность рекомбинантного ESC антигена определяют методом иммуноблотинга. Первичные антитела для этой цели получали иммунизацией кроликов рекомбинантным HBsAg (ЗАО НПК «Комбиотех»), восстановленным в присутствии 2% SDS и 5% β-меркаптоэтанола. Из полученных высокоиммунных сывороток специфические поликлональные антитела выделяли на афинной колонке с коньюгированным рекомбинантным HBsAg (Крымский М.А. et al., Биофармацевтический Журнал, 2010, 2(5): 8-15) Этими антителами окрашивали иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам кроликов, коньюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген ESC-Ag представлен в виде полосы мономера белка размером 22-25 кДа и слабых полос димера и тримера (Рисунок 5).3) The immunospecificity of the recombinant ESC antigen is determined by immunoblotting. Primary antibodies for this purpose were obtained by immunizing rabbits with recombinant HBsAg (ZAO NPK Kombioteh), reconstituted in the presence of 2% SDS and 5% β-mercaptoethanol. From the obtained high-immune sera, specific polyclonal antibodies were isolated on an affinity column with conjugated recombinant HBsAg (Krymsky MA et al., Biopharmaceutical Journal, 2010, 2 (5): 8-15) Immunoblot was stained with these antibodies, followed by visualization with specific antibodies to rabbit immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase according to the method of improved ECL chemiluminescence (Amersham, UK). The recombinant ESC-Ag antigen is presented as a 22–25 kDa protein monomer band and weak dimer and trimer bands (Figure 5).

4) Серологический портрет рекомбинантных Esc антигенов проводили по методике, разработанной в лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, с применением репрезентативной панели конъюгатов моноклональных антител к HBsAg. Поликлональные кроличьи (КАТ) и моноклональные мышиные (11F3, Н10, НВ4, 10D10, 5Н7, 4F5, Н2) антитела к HBsAg, а также их конъюгаты с пероксидазой хрена были получены в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Также использовали коммерческие моноклональные конъюгаты NF5, NE2 («Сорбент», Россия) и Х7 («Фармакс», Россия). Реактивность антигенных образцов с 11-ю пероксидазными конъюгатами антител исследовали методом ИФА. Оптимальные концентрации для каждого конъюгата подбирались в предварительных опытах с помощью внутреннего производственного стандарта, оттитрованного по отраслевому стандартному образцу. Относительную реактивность образцов оценивали по сравнению с соответствующей реактивностью внутреннего производственного стандарта (ВПС) HBsAg. За относительную реактивность каждого образца (обр) с исследованными конъюгатами принимали отношение Собр/Свпс×10³. Реактивность образца с данным конъюгатом считали дефектной, если отношение Собр/Свпс для этого конъюгата не превышало 100. Полученные результаты представлены в таблице 1.4) A serological portrait of recombinant Esc antigens was carried out according to the method developed in the laboratory of mediators and immunity effectors of the State Research Institute of Electric Medicine named after N.F. Gamalei RAMS, using a representative panel of conjugates of monoclonal antibodies to HBsAg. Polyclonal rabbit (CAT) and monoclonal mouse (11F3, H10, HB4, 10D10, 5H7, 4F5, H2) antibodies to HBsAg, as well as their conjugates with horseradish peroxidase, were obtained at the State Research Institute of Electric Medicine named after N.F. Gamalei RAMS. Commercial monoclonal conjugates NF5, NE2 (Sorbent, Russia) and X7 (Pharmax, Russia) were also used. The reactivity of antigenic samples with 11 peroxidase antibody conjugates was studied by ELISA. The optimal concentration for each conjugate was selected in preliminary experiments using an internal production standard, titrated according to the industry standard sample. The relative reactivity of the samples was evaluated compared to the corresponding reactivity of the HBsAg internal production standard (IPN). For the relative reactivity of each sample (arr) with the studied conjugates, the Sobr / Svps × 10 ³ ratio was taken. The reactivity of the sample with this conjugate was considered defective if the Sobr / HPS ratio for this conjugate did not exceed 100. The results obtained are presented in table 1.

Из таблицы видно, что рекомбинантные антигены HBsAg субтипов «ау» и «ad» - стандартные компоненты вакцины, производимой ЗАО НПК «Комбиотех», распознаются всей панелью конъюгатов. Это означает, что их серологические и конформационные характеристики полностью соответствуют HBsAg дикого типа. Серологическое портретирование антигенов с эскейп-мутацией G145R показало, что все три исследуемых рекомбинантных препарата, рассматриваемые в данном изобретении, (Таблица 1, строки 7,8,9) имеют многочисленные дефекты в реактивности с большинством конъюгатов (Табл 1, выделение серым фоном). Точно такую же картину дефектов (или серологический портрет) показывают нативные Esc-антигены, выделенные из человеческих сывороток, несущих природную мутацию G145R (Таблица 1, строки 5,6), В то же время рекомбинантные образцы AHBV203 (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород) и HBs-878 («PROSPEC», Израиль), тоже содержащие мутацию G145R, не имели ни одного дефекта распознавания моноклональными конъюгатами, т.е. конформация этих рекомбинантных молекул полностью соответствовала HBsAg дикого типа, а не мутантного антигена.The table shows that the recombinant HBsAg antigens of the subtypes "au" and "ad" - the standard components of the vaccine manufactured by NPK Kombiotekh, are recognized by the entire panel of conjugates. This means that their serological and conformational characteristics are fully consistent with wild-type HBsAg. Serological portrayal of antigens with the G145R escape mutation showed that all three of the studied recombinant drugs considered in this invention (Table 1, lines 7,8,9) have numerous defects in reactivity with most conjugates (Table 1, gray background). Exactly the same picture of defects (or serological portrait) is shown by native Esc antigens isolated from human sera carrying the natural mutation G145R (Table 1, lines 5.6). At the same time, recombinant samples AHBV203 (NPO Diagnostic Systems, Lower Novgorod) and HBs-878 (PROSPEC, Israel), also containing the G145R mutation, did not have a single recognition defect with monoclonal conjugates, i.e. the conformation of these recombinant molecules is fully consistent with wild-type HBsAg and not mutant antigen.

Таким образом, серологическое портретирование показывает полное конформационное соответствие рекомбинантных Esc антигенов, полученных из штаммов, описанных в данном изобретении, с нативными мутантами G145R, в отличие от Esc-Ag других производителей.Thus, serological portraiture shows the complete conformational correspondence of recombinant Esc antigens obtained from the strains described in this invention with native G145R mutants, in contrast to Esc-Ag from other manufacturers.

Культурально-морфологические особенности штаммов: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой. Хранение штаммов - при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина.Cultural and morphological features of the strains: round-shaped cells, small in size, form large round colonies with a pronounced convex middle on an agarized YPD medium. The strains are stored at -70 ° C in the form of a suspension of cells in a sterile 30-50% glycerol solution.

Генетические особенности: Штаммы не являются зоопатогенными или фитопатогенными.Genetic features: Strains are not zoopathogenic or phytopathogenic.

Способ, условия и состав сред для размножения штаммов: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.Method, conditions and composition of media for the propagation of strains: incubation by pumping at 30 ° C in a nutrient medium composition: 2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose.

Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 30°С и рН 5.5-6.0 в питательной среде, содержащей до 4% глицерина.The conditions and composition of the medium for fermentation: pumping at 30 ° C and pH 5.5-6.0 in a nutrient medium containing up to 4% glycerol.

Выделенный белок ESC-Ag может быть использован в тест-системах, а также для создания на его основе вакцин для профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом гепатита В.Isolated ESC-Ag protein can be used in test systems, as well as to create vaccines based on it for the prevention of diseases associated with hepatitis B.

Claims

1. Recombinant strain of the yeast Hansenula polymorpha KBT-11 / pEMmulti-7, containing several copies of a DNA fragment integrated into the genome with a recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the promoter of the MOX H. polymorpha gene (SEQ ID NO: 2, nucleotide positions 4338-5554) - producer of the recombinant hepatitis B virus surface antigen of the ayw serotype having the G145R mutation (ESC-Ag).

2. Recombinant strain of the yeast Hansenula polymorpha KBT-12 / pEMmono-4, containing one copy of the DNA fragment integrated into the genome with the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the promoter of the MOX H. polymorpha gene (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 4188-5715) is a producer of the recombinant hepatitis B virus surface antigen of the ayw serotype having the G145R mutation (ESC-Ag).

3. Recombinant strain of the yeast Hansenula polymorpha KBT-14 / pEMmalt-8, containing several copies of the DNA fragment integrated into the genome with the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the promoter of the H. polymorpha MAL1 gene (SEQ ID NO: 4, nucleotide positions 1-1326) is a producer of the recombinant hepatitis B virus surface antigen of the ayw serotype having the G145R mutation (ESC-Ag).

4. Recombinant strain of the yeast Hansenula polymorpha KBT-14 / pEMmono2 containing one copy of the DNA fragment integrated into the genome with the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the promoter of the MOX H. polymorpha gene (SEQ ID NO: 3, nucleotide positions 4188- 5715) and one copy of the DNA fragment with the recombinant gene encoding the ESC-Ag polypeptide, under the control of the promoter of the DAK N. polymorpha gene (SEQ ID NO: 5, nucleotide positions 4404-5727) - producer of the recombinant hepatitis B virus antigen of the ayw serotype having a mutation G145R (ESC-Ag).