RU2586511C1

RU2586511C1 - RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN SEROTYPE "ayw"

Info

Publication number: RU2586511C1
Application number: RU2015115526/10A
Authority: RU
Inventors: Михаил Александрович Крымский; Иван Андреевич Борисов; Михаил Симеонович Яковлев; Михаил Олегович Агафонов; Михаил Давидович Тер-Аванесян
Original assignee: Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех"
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2016-06-10

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: disclosed is a Hansenula polymorpha yeast strain-producer of recombinant hepatitis B virus surface antigen serotype “ayw”. Strain is obtained by adding to yeast cell genome several copies of DNA sequence coding HBsAg/ayw, under control of a promoter MAL1 H. polymorpha. Strain provides high yield of recombinant protein HBsAg/ayw with antigenic and immunogenic properties of natural antigen, improved process conditions of cultivation process on media which do not contain toxic and inflammable components, and provides compliance with requirements of environmental protection.

EFFECT: invention can be used in microbiological synthesis of recombinant protein HBsAg.

1 cl, 3 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генной инженерии, и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа «ayw» (HBsAg/ayw).The invention relates to the field of biotechnology, namely genetic engineering, and can be used to create a microbiological yeast producer of the recombinant surface antigen of hepatitis B virus serotype "ayw" (HBsAg / ayw).

Гепатит В - одна из самых распространенных вирусных инфекций, которая ведет к таким тяжелым последствиям как хронический гепатит, цирроз печени и гепатокарцинома. Успешное применение вакцин против гепатита В существенно улучшило эпидемиологическую ситуацию по гепатиту В, прежде всего в странах с широкой распространенностью данной инфекции, к которым относится и Россия. В настоящее время используемые для вакцинации препараты содержат поверхностный антиген вирусного гепатита В, полученный рекомбинантным путем. Такие вакцины эффективны и более безопасны, чем вакцины, приготовленные с использованием природного вируса.Hepatitis B is one of the most common viral infections, which leads to such serious consequences as chronic hepatitis, cirrhosis of the liver and hepatocarcinoma. The successful use of hepatitis B vaccines has significantly improved the hepatitis B epidemiological situation, especially in countries with a wide spread of this infection, including Russia. Currently used for vaccination preparations contain a surface antigen of viral hepatitis B, obtained recombinantly. Such vaccines are more effective and safer than vaccines prepared using a natural virus.

Известны различные рекомбинантные штаммы, способные продуцировать поверхностный антиген вируса гепатита В.Various recombinant strains are known that are capable of producing hepatitis B virus surface antigen.

Так, в патенте RU 2088664 описано получение HBsAg (ayw) с использованием штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-2203, содержащим рекомбинантную плазмидную ДНК pDES20. При всех известных преимуществах - эффективность, безопасность, система экспрессии HBsAg на основе S. cerevisiae имеет недостатки, связанные с проблемой достижения высокого выхода и низкой себестоимости целевого белка. Для увеличения уровня экспрессии, как правило, используют автономно реплицирующиеся мультикопийные векторы, требующие специальных селективных сред для предотвращения накопления бесплазмидных клеток в процессе культивирования штамма-продуцента. Это осложняет получение достаточного количества биомассы на единицу объема культуры. Другой проблемой использования автономно реплицирующегося экспрессионного вектора является существенная вариабельность его копийности в отдельных клетках культуры. В результате в клетках с низкой копийностью вектора уровень экпрессии гена оказывается недостаточно высоким, а слишком высокая копийность может приводить к неспособности белка принять правильную конформацию из-за его гиперпродукции, и только часть клеток культуры содержит оптимальное количество копий экспрессионного вектора, способное обеспечить максимальный выход целевого белка. В качестве индуцируемого промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка, как правило, применяют промотор гена GAL1, требующий для индукции использования больших количеств хорошо очищенной галактозы, являющейся достаточно дорогим веществом.Thus, the patent RU 2088664 describes the preparation of HBsAg (ayw) using the yeast strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-2203 containing recombinant plasmid DNA pDES20. With all the known advantages - effectiveness, safety, the S. cerevisiae-based HBsAg expression system has the disadvantages associated with the problem of achieving high yield and low cost of the target protein. Autonomously replicating multicopy vectors, which require special selective media to prevent the accumulation of non-plasmid cells during the cultivation of the producer strain, are usually used to increase the level of expression. This makes it difficult to obtain a sufficient amount of biomass per unit volume of culture. Another problem of using an autonomously replicating expression vector is the significant variability of its copy number in individual cells of the culture. As a result, in the cells with a low copy number of the vector, the level of gene expression is not high enough, and too high copy number can lead to the inability of the protein to accept the correct conformation due to its overproduction, and only part of the culture cells contains the optimal number of copies of the expression vector, which can provide the maximum yield of the target squirrel. As an inducible promoter providing a high level of expression of the recombinant protein, as a rule, the GAL1 gene promoter is used, which requires the induction of the use of large quantities of well-purified galactose, which is a rather expensive substance.

Известно использование рекомбинантных метилотрофных дрожжей для получения поверхностного антигена вируса гепатита В. Например, для получения HBsAg серотипа adw был создан штамм Pichia pastoris PS, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pHBS, обеспечивающую биосинтез HBsAg (RU 2201452). HBsAg в виде иммуногенных частиц размером 22 mn и молекулярной массой 24000 Da выделен при культивировании штамма дрожжей Pichia pastoris С226, трансформированных плазмидой ТАО 906 (ЕР 0864649).It is known to use recombinant methylotrophic yeast to obtain the surface antigen of hepatitis B. For example, to obtain HBsAg serotype adw, a strain of Pichia pastoris PS was created containing recombinant plasmid DNA pHBS providing biosynthesis of HBsAg (RU 2201452). HBsAg in the form of immunogenic particles with a size of 22 mn and a molecular weight of 24,000 Da was isolated by culturing the Pichia pastoris C226 yeast strain transformed with TAO 906 plasmid (EP 0864649).

В ближайшем аналоге (RU 2230782) описано создание трансформированного штамма дрожжей Pichia augusta - продуцента рекомбинантного HBsAg/ayw. Штамм был получен трансформацией штамма-реципиента DLT плазмидой, содержащей фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим HBsAg, под контролем промотора гена метанолоксидазы H. polymorpha (МОХ) и селективным маркером TRP3 H. polymorpha. Полученный штамм обладал высоким выходом HBsAg серотипа «ayw». Однако в процессе культивирования штамма в качестве индуктора добавляется метиловый спирт, относящийся к 3-му классу опасности, при работе с которым необходимо соблюдать соответствующие требования безопасности и охраны окружающей среды.The closest analogue (RU 2230782) describes the creation of a transformed strain of Pichia augusta yeast, a producer of recombinant HBsAg / ayw. The strain was obtained by transforming the DLT recipient strain with a plasmid containing a DNA fragment with a recombinant gene encoding HBsAg, under the control of the promoter of the H. polymorpha methanol oxidase gene (MOX) and the H. polymorpha TRP3 selective marker. The resulting strain had a high yield of HBsAg serotype "ayw". However, in the process of cultivating the strain, methyl alcohol, belonging to the 3rd hazard class, is added as an inducer, when working with it, it is necessary to observe the relevant safety and environmental requirements.

Задачей изобретения является создание эффективного микробиологического дрожжевого штамма-продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа ayw, антигенные свойства которого позволяли бы использовать его в качестве вакцины для защиты от вируса гепатита В. Под эффективностью понимается возможность получения целевого продукта, обладающего необходимыми биологическими свойствами (правильная конформация, иммуногенность, чистота) и низкой себестоимостью, при этом штамм должен обеспечивать улучшение технологических условий процесса культивирования.The objective of the invention is the creation of an effective microbiological yeast strain producing a surface antigen of the hepatitis B virus of the ayw serotype, the antigenic properties of which would make it possible to use it as a vaccine to protect against the hepatitis B virus. Efficiency refers to the possibility of obtaining the target product with the necessary biological properties (correct conformation , immunogenicity, purity) and low cost, while the strain should provide an improvement in technological conditions otsessa cultivation.

Согласно изобретению, для получения рекомбинантного штамма Н. polymorpha - продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа «ayw», плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим HBsAg серотипа «ayw», под контролем промотора гена мальтазы К polymorpha (MALI) и селективным маркером (ген LEU2 S. cerevisiae) интегрируют в геном реципиентного штамма H.polymorpha DL1-L (Sohn J.H. et al., J Bacteriol. 1996, 178(15):4420-8). Для получения клонов, содержащих в геноме несколько копий плазмиды, применена процедура селекции множественной интеграции. По результатам проверки полученных в результате этой процедуры клонов на способность синтезировать белок поверхностного антигена вируса гепатита В был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. В процессе культивирования штамма в качестве индуктора добавляется сахароза. Полученный рекомбинантный штамм, содержащий несколько копий целевого гена под контролем промотора MALI, депонирован 24.03.2014 в коллекции микроорганизмов ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ-14/pAYmalt-l. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.According to the invention, to obtain a recombinant strain of H. polymorpha, a producer of hepatitis B virus surface antigen of the ayw serotype, a plasmid containing a DNA fragment with a recombinant gene encoding the ayw serotype HBsAg, under the control of the promoter of the polymorpha maltase gene K polymorpha (MALI) and selective marker (the S. cerevisiae LEU2 gene) is integrated into the genome of the recipient strain of H. polymorpha DL1-L (Sohn JH et al., J Bacteriol. 1996, 178 (15): 4420-8). To obtain clones containing several copies of the plasmid in the genome, a multiple integration selection procedure was used. According to the results of checking the clones obtained as a result of this procedure for the ability to synthesize the hepatitis B virus surface antigen protein, a transformant that best meets the required properties was isolated. During the cultivation of the strain, sucrose is added as an inducer. The resulting recombinant strain containing several copies of the target gene under the control of the MALI promoter was deposited on 24.03.2014 in the collection of microorganisms of NPK Kombiotekh CJSC under the number KBT-14 / pAYmalt-l. The strain is new and is neither described in the patent nor in the scientific and technical literature.

Штамм позволяет получать HBsAg, обладающий высокими антигенными и иммуногенными свойствами, обеспечивает улучшение технологических условий процесса культивирования, благодаря возможности избежать использование метилового спирта, имеющего 3-й класс опасности, обеспечивает соблюдение требований по защите окружающей среды.The strain allows to obtain HBsAg with high antigenic and immunogenic properties, provides improved technological conditions of the cultivation process, due to the ability to avoid the use of methyl alcohol, which has a 3rd hazard class, ensures compliance with environmental requirements.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.The invention can be illustrated by the following examples.

В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний-производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Трансформацию клеток Escherichia coli и H. polymorpha осуществляли согласно ранее описанным методам (Inoue H. et. al., Gene, 1990, 96:23-28; Bogdanova A.I. et. al., Yeast, 1995, 11(4):343-53). Для полимеразной цепной реакции (ПНР) использовали полимеразу Pwo (Roche). Синтез олигонуклеотидов, а также определение последовательности нуклеотидов производились ЗАО "Евроген" г. Москва.In the examples cited, all genetic engineering operations were performed according to standard procedures and instructions from manufacturers of enzymes and in vitro DNA manipulation kits. The transformation of Escherichia coli and H. polymorpha cells was carried out according to the previously described methods (Inoue H. et. Al., Gene, 1990, 96: 23-28; Bogdanova AI et. Al., Yeast, 1995, 11 (4): 343- 53). For polymerase chain reaction (NDP), Pwo polymerase (Roche) was used. The synthesis of oligonucleotides, as well as the determination of the nucleotide sequence, were carried out by ZAO Evrogen, Moscow.

Пример 1. Получение штамма Н. polymorpha, содержащего несколько копий рекомбинантного гена, кодирующего полипептид HBsAg/ayw, под контролем промотора MALI.Example 1. Obtaining a strain of N. polymorpha containing several copies of the recombinant gene encoding the HBsAg / ayw polypeptide, under the control of the MALI promoter.

Получали плазмиду pMAL-AYW1 (Фиг. 1; SEQ ID ΝΟ:1), которая содержала рекомбинантный ген, кодирующий полипептид HBsAg/ayw, под контролем промотора MALI (SEQ ID NO: 1, нуклеотидные позиции 1-2024). Помимо этого гена плазмида pMAL-AYWl состояла из: (а) фрагмента плазмиды рАМ619 (Agaphonov M., Alexandrov Α., FEMS Yeast Res., 2014, 14(7): 1048-54), включающего бактериальный селективный маркер устойчивости к ампициллину и дрожжевой селективный маркер - модифицированный ген LEU2 S. cerevisiae (SEQ ID NO: 1, нуклеотидные позиции 2913-6326), (б) фрагмента плазмиды AMIpSLl (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15(7):541-51), несущего терминатор транскрипции и автономно-реплицирующуюся последовательность Н. polymorpha, (SEQ ID NO: 1, нуклеотидные позиции 2025-2912) и (в) линкерной последовательности (SEQ ID NO: 1, нуклеотидные позиции 6327-6403).The plasmid pMAL-AYW1 (Fig. 1; SEQ ID ΝΟ: 1) was obtained, which contained a recombinant gene encoding the HBsAg / ayw polypeptide under the control of the MALI promoter (SEQ ID NO: 1, nucleotide positions 1-2024). In addition to this gene, plasmid pMAL-AYWl consisted of: (a) a fragment of plasmid pAM619 (Agaphonov M., Alexandrov Α., FEMS Yeast Res., 2014, 14 (7): 1048-54), including a bacterial selective marker of ampicillin resistance and yeast selective marker - a modified LEU2 gene of S. cerevisiae (SEQ ID NO: 1, nucleotide position 2913-6326), (b) a fragment of plasmid AMIpSLl (Agaphonov et al., Yeast. 1999, 15 (7): 541-51), bearing the transcription terminator and the autonomously replicating sequence of H. polymorpha, (SEQ ID NO: 1, nucleotide positions 2025-2912) and (c) the linker sequence (SEQ ID NO: 1, nucleotide positions 6327-6403).

Штамм DL1-L трансформировали плазмидой pMAL-AYW1. Трансформантов отбирали на среде, не содержащей лейцин. Несколько выросших трансформантов посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом, чтобы получить отдельные колонии. Среди выросших колоний отобрали самые крупные и снова посеяли на твердую среду без лейцина истощающим штрихом. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока вырастающие при рассеве колонии не стали одинаковыми по скорости роста. По одному такому субклону нескольких независимых трансформантов отобрали для анализа продукции белка HBsAg/ayw. Трансформант с лучшей продуктивностью был обозначен КБТ-14/pAYmalt-1.Strain DL1-L was transformed with plasmid pMAL-AYW1. Transformants were selected on leucine-free medium. Several grown transformants were seeded onto a solid leucine-free medium with a draining stroke to obtain individual colonies. Among the grown colonies, the largest were selected and again sown on solid medium without leucine with a draining stroke. This procedure was repeated until the colonies growing during sieving were equal in growth rate. One such subclone of several independent transformants was selected for analysis of HBsAg / ayw protein production. The transformant with the best productivity was designated KBT-14 / pAYmalt-1.

Пример 2. Культивирование штамма Н. polymorpha КБТ-14/pAYmalt-1.Example 2. Cultivation of a strain of H. polymorpha KBT-14 / pAYmalt-1.

Ферментацию штамма-продуцента Н. polymorpha осуществляли в два этапа. На первом этапе культивирования в режиме фед-бэтч при температуре 30°С наращивали биомассу в культуральной среде, содержащей 4% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона и 4% глицерина. Процесс вели до истощения источника углерода в питательной среде и прекращения роста биомассы. На втором этапе культивирование проводили с подпиткой культуры путем непрерывной подачи 30%-ного раствора дрожжевого экстракта. Одновременно с подпиткой добавляли индуктор (раствор сахарозы, 40% вес/объем), который добавляли порциями по 0.5% (вес сахарозы / объем культуральной жидкости) через каждые два часа в течение 48-72 часов. Продолжительность всего процесса составляла около 96 часов.Fermentation of the producer strain H. polymorpha was carried out in two stages. At the first stage of cultivation in the fed-batch mode at a temperature of 30 ° C, biomass was increased in a culture medium containing 4% yeast extract, 2% bactopeptone and 4% glycerol. The process was conducted until the carbon source in the nutrient medium was depleted and the biomass stopped growing. In the second stage, the cultivation was carried out with feeding the culture by continuous supply of a 30% solution of yeast extract. Simultaneously with the replenishment, an inductor (sucrose solution, 40% weight / volume) was added, which was added in 0.5% portions (sucrose weight / volume of culture liquid) every two hours for 48-72 hours. The duration of the whole process was about 96 hours.

Пример 3. Выделение и очистка рекомбинантного белка HBsAg/ayw из клеток Н. polymorpha.Example 3. Isolation and purification of the recombinant HBsAg / ayw protein from H. polymorpha cells.

После ферментации белок HBsAg/ayw (SEQ ID NO: 2) выделяли согласно опубликованной методике (Lunsdorf H. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10:48) с небольшими изменениями. Клетки из культуральной жидкости осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 минут при 4°С. Осажденную биомассу ресуспендировали до исходного объема в карбонатно-солевом буферном растворе для экстракции (50 mM NaHCO₃, 150 mM NaCl, рН 8.0) и снова осаждали центрифугированием при 4000g в течение 30 минут при 4°С. Полученную таким образом отмытую биомассу ресуспендировали в буферном растворе для экстракции с добавлением 1.7mM EDTA и 2 mM PMSF до концентрации 400 г влажных клеток на литр суспензии. Далее клетки разрушали в проточном дезинтеграторе Dyno-Mill типа KDL при температуре 5-10°С, используя стеклянные шары диаметром 0.5-0.7 мм. Для удаления клеточного дебриса полученный гомогенизат центрифугировали при 4000g в течение 60 минут при 4°С.After fermentation, the HBsAg / ayw protein (SEQ ID NO: 2) was isolated according to the published procedure (Lunsdorf H. et al., Microbial Cell Factories, 2011, 10:48) with slight changes. Cells from the culture fluid were besieged by centrifugation at 4000 g for 30 minutes at 4 ° C. The precipitated biomass was resuspended to its original volume in carbonate-salt extraction buffer (50 mM NaHCO ₃ , 150 mM NaCl, pH 8.0) and again precipitated by centrifugation at 4000 g for 30 minutes at 4 ° C. The washed biomass thus obtained was resuspended in extraction buffer with 1.7 mM EDTA and 2 mM PMSF added to a concentration of 400 g wet cells per liter of suspension. Next, the cells were destroyed in a Dyno-Mill flow disintegrator of the KDL type at a temperature of 5-10 ° C using glass balls with a diameter of 0.5-0.7 mm. To remove cell debris, the resulting homogenizate was centrifuged at 4000 g for 60 minutes at 4 ° C.

Полученный осветленный гомогенизат подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на системе Sartocon через мембрану с порогом отсечения 300 kDa (Sartorius, Германия), одновременно концентрировали и переводили в фосфатно-солевой буферный раствор (10mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 6.8). При этом отделяется большая часть примесных низкомолекулярных белков.The resulting clarified homogenizate was subjected to tangential flow ultrafiltration on a Sartocon system through a membrane with a cutoff threshold of 300 kDa (Sartorius, Germany), was simultaneously concentrated and transferred to phosphate-buffered saline (10 mM NaH ₂ PO ₄ , 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, pH 6.8). In this case, most of the impurity low molecular weight proteins are separated.

Дальнейшую очистку проводили методом адсорбционной хроматографии на колонке с макропористым стеклом (МПС) с использованием технологии Streamline (хроматография в восходящем потоке). Концентрированный раствор HBsAg/ayw, полученный после ультрафильтрации, наносили на колонку при скорости 1 мл/мин, промывали 3-4 объемами фосфатно-солевого буферного раствора (рН 6.8) и элюировали карбонатным буфером (50mM NaHCO₃, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, рН 9.5).Further purification was carried out by adsorption chromatography on a column with macroporous glass (MPS) using Streamline technology (upstream chromatography). The concentrated HBsAg / ayw solution obtained after ultrafiltration was applied to the column at a speed of 1 ml / min, washed with 3-4 volumes of phosphate-buffered saline (pH 6.8) and eluted with carbonate buffer (50 mM NaHCO ₃ , 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA , pH 9.5).

Объединенные фракции, содержащие HBs антиген (определяли по иммуноблоту и SDS-PAGE), концентрировали ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембране 300 KDa и разделяли при помощи зонального ультрацентрифугирования (Beckman Coulter, USA) в градиенте плотности сахарозы (20-50% вес./вес.). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, а затем очищали гель-фильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (Tosoh Bioscience, Japan) в фосфатном буферном растворе (10mM NaH₂PO₄, 0.03% Tween-20, рН 7.2).Combined fractions containing HBs antigen (determined by immunoblot and SDS-PAGE) were concentrated by tangential flow ultrafiltration on a 300 KDa membrane and separated by zonal ultracentrifugation (Beckman Coulter, USA) in a sucrose density gradient (20-50% w / w) .). The fractions containing the target protein were pooled and then gel-filtered on a Toyopearl HW-65 sorbent (Tosoh Bioscience, Japan) in phosphate buffered saline (10mM NaH ₂ PO ₄ , 0.03% Tween-20, pH 7.2).

Если чистота белка на данной стадии была недостаточна (менее 95%), производили дополнительную очистку при помощи анионообменной хроматографии на сорбенте Toyopearl DEAE-650M (Tosoh Bioscience, Japan).If the protein purity at this stage was insufficient (less than 95%), additional purification was performed using anion exchange chromatography on a Toyopearl DEAE-650M sorbent (Tosoh Bioscience, Japan).

В результате этих операций удается выделить около 30% антигена, присутствующего в осветленном клеточном лизате. Выход очищенного HBsAg/ayw составлял не менее 50 мг/л культуральной жидкости.As a result of these operations, it is possible to isolate about 30% of the antigen present in the clarified cell lysate. The yield of purified HBsAg / ayw was at least 50 mg / L of culture fluid.

Пример 4. Анализ рекомбинантного HBsAg/ayw.Example 4. Analysis of recombinant HBsAg / ayw.

1) Чистота рекомбинантного HBsAg/ayw определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) путем окрашивания с Coomassie Brilliant Blue R-250 и/или серебром (Фиг. 2A). Анализ интенсивности полос отсканированных гелей проводится посредством компьютерной программы NIH Image.1) Purity of recombinant HBsAg / ayw is determined by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions (SDS-PAGE) by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250 and / or silver (Fig. 2A). The analysis of the intensity of the bands of scanned gels is carried out using the computer program NIH Image.

2) Иммуноспецифичность рекомбинантного HBs антигена определяют методом иммуноблотинга. Первичные антитела для этой цели получали иммунизацией кроликов рекомбинантным HBsAg (ЗАО НПК «Комбиотех»), восстановленным в присутствии 2% SDS и 5% β-меркаптоэтанола. Из полученных высокоиммуных сывороток специфические поликлональные антитела выделяли на афинном сорбенте с конъюгированным рекомбинантным HBsAg (Крымский М.А. et. al., Биофармацевтический Журнал, 2010, 2(5):8-15). Этими антителами окрашивали иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам кроликов, конъюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген HBsAg/ayw представлен в виде полосы мономера белка размером 22-25 кДа и полос димера и тримера (Фиг. 2Б).2) The immunospecificity of the recombinant HBs antigen is determined by immunoblotting. Primary antibodies for this purpose were obtained by immunizing rabbits with recombinant HBsAg (ZAO NPK Kombioteh), reconstituted in the presence of 2% SDS and 5% β-mercaptoethanol. From the obtained high-immune sera, specific polyclonal antibodies were isolated on an affinity sorbent with conjugated recombinant HBsAg (Krymsky MA et. Al., Biopharmaceutical Journal, 2010, 2 (5): 8-15). These antibodies stained the immunoblot, followed by visualization using specific antibodies to rabbit immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase according to the method of improved ECL chemiluminescence (Amersham, UK). The recombinant HBsAg / ayw antigen is presented as a 22-25 kDa protein monomer band and dimer and trimer bands (Fig. 2B).

3) Образование вирусоподобных частиц (ВПЧ) рекомбинантного белка HBsAg/ayw подтверждали методом гель-фильтрационной хроматографии на полимерной колонке TSK G5000PW диаметром 7.5 мм и длиной 60 см, соединенной с предколонкой PrePW диаметром 7.5 мм и длиной 7.5 см (Tosoh Bioscience, Japan). Разделение проводили в фосфатном буферном растворе (10mM КН₂РО₄, (рН 7.2), 0.03% Tween-20) при скорости потока 0.6 мл/мин. Мониторинг процесса осуществляли по поглощению на 280 нм. Размер пор сорбента 1000 Å позволяет отделить правильно собранные ВПЧ от мономеров и агрегатов HBs-антигена. Время элюции очищенного препарата HBsAg/ayw соответствует времени элюции вирусоподобных частиц 23-26 мин (Фиг. 3).3) The formation of virus-like particles (HPVs) of the recombinant HBsAg / ayw protein was confirmed by gel filtration chromatography on a TSK G5000PW polymer column with a diameter of 7.5 mm and a length of 60 cm connected to a PrePW column with a diameter of 7.5 mm and a length of 7.5 cm (Tosoh Bioscience, Japan). Separation was carried out in a phosphate buffer solution (10mM KH ₂ PO ₄ , (pH 7.2), 0.03% Tween-20) at a flow rate of 0.6 ml / min. The process was monitored by absorbance at 280 nm. The sorbent pore size of 1000 Å allows you to separate correctly collected HPV from monomers and aggregates of HBs antigen. The elution time of the purified HBsAg / ayw preparation corresponds to an elution time of virus-like particles of 23-26 minutes (Fig. 3).

4) Иммуногенность рекомбинантного антигена HBsAg/ayw, определенная в тесте "in vivo" на мышах линии Balb/c с массой 12-14 г в расчете на ED⁵⁰ (доза антигена, вызывающая сероконверсию у 50% мышей), составляет 0.05-0.1 мкг.4) Immunogenicity of the recombinant HBsAg / ayw antigen, determined in the in vivo test on Balb / c mice weighing 12-14 g per ED ⁵⁰ (the dose of antigen causing seroconversion in 50% of mice) is 0.05-0.1 μg .

Культурально-морфологические особенности штамма: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой. Хранение штамма - при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина.Cultural and morphological features of the strain: round-shaped cells, small in size, form large round colonies with a pronounced convex middle on an agarized YPD medium. The strain is stored at -70 ° C in the form of a suspension of cells in a sterile 30-50% glycerol solution.

Генетические особенности: штамм не является зоопатогенными или фитопатогенными.Genetic features: the strain is not zoopathogenic or phytopathogenic.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.Method, conditions and composition of media for the propagation of the strain: incubation by pumping at 30 ° C in a nutrient medium composition: 2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose.

Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 30°С и рН 5.5-6.0 в питательной среде, содержащей до 4% глицерина.The conditions and composition of the medium for fermentation: pumping at 30 ° C and pH 5.5-6.0 in a nutrient medium containing up to 4% glycerol.

Выделенный белок HBsAg/ayw может быть использован в тест-системах, а также для создания на его основе вакцин для профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом гепатита В.The isolated HBsAg / ayw protein can be used in test systems, as well as to create vaccines based on it for the prevention of diseases associated with hepatitis B.

Claims

Recombinant yeast strain Hansenula polymorpha KBT-14 / pAYmalt-1, containing several copies of a DNA fragment integrated into the genome with a recombinant gene encoding the HBsAg / ayw polypeptide, under the control of the promoter of the H. polymorpha MALI gene (SEQ ID NO: 1, nucleotide positions 1- 2024) - producer of the recombinant hepatitis B virus surface antigen of the ayw serotype.