RU2088664C1 - Recombinant plasmid dna pdes 20 encoding the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw), the yeast strain saccharomyces cerevisiae containing the recombinant plasmid dna pdes 20 - a producer of the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw) - Google Patents
Recombinant plasmid dna pdes 20 encoding the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw), the yeast strain saccharomyces cerevisiae containing the recombinant plasmid dna pdes 20 - a producer of the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2088664C1 RU2088664C1 RU96101565A RU96101565A RU2088664C1 RU 2088664 C1 RU2088664 C1 RU 2088664C1 RU 96101565 A RU96101565 A RU 96101565A RU 96101565 A RU96101565 A RU 96101565A RU 2088664 C1 RU2088664 C1 RU 2088664C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hbsag
- ayw
- hepatitis
- pdes
- yeast
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретения относятся к биотехнологии и, в частности, генной инженерии, а также медицине и могут быть использованы для производства рекомбинантного НВsAg/ayw культивированием трансформированных клеток дрожжей и получения на его основе вакцины против гепатита В. The invention relates to biotechnology and, in particular, genetic engineering, as well as medicine, and can be used for the production of recombinant HBsAg / ayw by culturing transformed yeast cells and producing a hepatitis B vaccine based on it.
В настоящее время известно достаточно много вакцин против гепатита В на основе рекомбинантных поверхностных антигенных детерминант этого вируса (US 5098704; Fr 2635532; Fr 2606281). Currently, there are a lot of hepatitis B vaccines based on the recombinant surface antigenic determinants of this virus (US 5098704; Fr 2635532; Fr 2606281).
При этом наиболее безопасные и эффективные медицинские иммунобиологические препараты, содержащие антиген вируса гепатита В, получены культивированием трансформированных клеток S.cerevisiae. Как правило, в них используют плазмиды с природными участками генома вируса гепатита В (серотипы adr и adw), кодирующими его поверхностную антигенную детерминанту, экспрессируемыми под контролем сильных конструктивных промоторов дрожжевых генов (ЕР 0533492б, US 5133961). Подобные конструкции хотя и обеспечивают получение высокого уровня экспрессии целевого продукта, обладают рядом существенных для промышленных продуцентов недостатков: не позволяют эффективно контролировать экспрессию целевого белка, недостаточно стабильны при наращивании больших количеств биомассы, часто вынуждают использовать для роста клеток реципиентов сложные и дорогостоящие питательные среды. Moreover, the safest and most effective medical immunobiological preparations containing the hepatitis B virus antigen were obtained by culturing transformed S. cerevisiae cells. As a rule, they use plasmids with natural regions of the hepatitis B virus genome (adr and adw serotypes) encoding its surface antigenic determinant expressed under the control of strong constructive promoters of yeast genes (EP 0533492b, US 5133961). Although such constructions provide a high level of expression of the target product, they have a number of disadvantages that are important for industrial producers: they do not allow effective control of the expression of the target protein, are not stable enough when large amounts of biomass are accumulated, and often they require complex and expensive nutrient media to grow recipient cells.
Этих недостатков практически лишены векторные ДНК, в которых для экспрессии гетерологичного белка используют регулируемые дрожжевые промоторы и, в частности, промотор гена кислой фосфатазы (РН05). These shortcomings are practically devoid of vector DNA, in which regulated yeast promoters, and in particular, the promoter of the acid phosphatase gene (PH05), are used to express a heterologous protein.
Наиболее близкими техническими решениями к настоящим изобретениям из указанных стабильных микробиологических систем для наработки рекомбинантных поверхностных антигенных детерминант вируса гепатита В на основе S.cerevisiae являются рекомбинантная плазмидная ДНК р АН 203 с участком генома вируса гепатита В природной структуры под контролем РН05-промотора и трансформированный ею штамм-продуцент S.cerevisiae АН 22/р АН 203 (US 4778761). The closest technical solutions to the present invention from these stable microbiological systems for producing recombinant surface antigenic determinants of hepatitis B virus based on S. cerevisiae are recombinant plasmid DNA p AN 203 with a naturally occurring structure of the hepatitis B virus genome under the control of the PH05 promoter and the strain transformed by it producer S.cerevisiae AN 22 / p AN 203 (US 4778761).
Однако плазмида р АН 203 не обеспечивает высокий уровень экспрессии поверхностного антигена вируса гепатита В, а трансформированный ею штамм-продуцент недостаточно эффективен. However, the plasmid p AN 203 does not provide a high level of expression of the hepatitis B virus surface antigen, and the producer strain transformed by it is not effective enough.
Известна рекомбинантная дрожжевая вакцина против гепатита В, содержащая поверхностный антиген вируса гепатита В, адъювант, консервант и физиологически приемлемый разбавитель (WO 93/12815). Однако указанная вакцина недостаточно иммуногенна. A recombinant hepatitis B yeast vaccine is known containing the hepatitis B virus surface antigen, an adjuvant, a preservative and a physiologically acceptable diluent (WO 93/12815). However, this vaccine is not sufficiently immunogenic.
Заявляемые рекомбинантная плазмидная ДНК p DES 20 и штамм ДАН-041/рDES 20 являются новыми и в литературе не описаны. The inventive recombinant plasmid DNA p DES 20 and strain DAN-041 / pDES 20 are new and are not described in the literature.
В основу изобретений положена задача создания эффективного микробиологического дрожжевого продуцента, обеспечивающего повышение выхода рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа ayw (HBsAg/ayw), и получения на его основе высокоиммуногенной, нетоксичной, не обладающей побочными эффектами вакцины. The basis of the inventions is the task of creating an effective microbiological yeast producer that provides an increase in the yield of the recombinant surface antigen of hepatitis B virus ayw serotype (HBsAg / ayw), and obtain a highly immunogenic, non-toxic, non-toxic vaccine based on it.
Задача решена тем, что заявляемая рекомбинантная плазмидная ДНК, согласно изобретению, содержит следующие существенные для ее функционирования структурные элементы:
бактериальный ориджин репликации СоlEl [необходим для работы в E.coli] NN н.п.4211-4841
бактериальный оперон bla, экспрессирующий E.coli функционально активный белок β -лактамазу (необходим для отбора целевых клонов при конструировании рDES20) NN н.п. 1253-2303
фрагмент природной дрожжевой 2 m -плазмиды, содержащий все необходимые нуклеотидные последовательности для обеспечения в S.cerevisiae ее эффективной автономной репликации и размножения до уровня 50-200 копий на клетку NN н.п. 2311-4203
дрожжевой оперон leu2, экспрессия которого в штамме S.cerevisiae ДАН-041/рDES20 придает ему способность расти на селективной среде без лейцина (необходим как селективный маркер при трансформации штамма S.cerevisiae YPH501) NN н.п. 4848-7062
искусственный дрожжевой оперон НВsAg/ayw (обеспечивает эффективную контролируемую уровнем свободного экзогенного фосфата экспрессию целевого полипептида НВsAg/ayw), включающий: минимальный фрагмент 5' нетранслируемой области дрожжевого оперона рh05, обеспечивающий контролируемую инициацию транскрипции NN н.п. 7-313 минимальный фрагмент 3' нетранслируемый области дрожжевого оперона рh05, обеспечивающий эффективную терминацию транскрипции и процессинг мРНК NN н.п. 1058-1237 модифицированный синтетический участок, кодирующий лидерную нетранслируемую область мРНК секретируемой кислой фосфатазы (ген РН05): AAAAAAAACAACAACAAATAGA- GCAAGCAAATTCGAGATTACCA NN н.п. 314-357 синтетичекий ген полипептида НВsAg/ayw NN н.п. 358-1035
ATGGAAACATTACTTCTGCTTTCCTAGGTCCATTGTTGGTTTTGCAAGCTGGTTTTTTC CTGCTGACTAGAATTTTGACTATTCCACAAAGTCTAGACTCTTGGTGGACTTCTTTGAAT TTTTTGGGTGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC TCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATAGATGGATGTGTTTGAGAAGATTT ATTATTTTCTTGTTCATTTTGTTGTTGTGTTTGATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTAT СAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCTTCAACTACTTCTACTGGTCCA TGTAGAACTTGTATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACC AAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAA Заявляемая плазмида р DES 20 включает искусственный дрожжевой оперон НВsAg/ayw с синтетическим геном полипептида НВsAg/ayw, первичная структура которого составлена с учетом кодонов, наиболее часто используемых в интенсивно экспрессируемых генах S. cerevisiae (T. Maryama, T.Gojobort,S-I.Aota, T.Ikemura. Nucl. Acids Res. 1986. V.14, Suppl. P.151-197), и модифицированным синтетическим участком, кодирующим лидерную нетранслируемую область m РНК секретируемой кислой фосфатазы (ген РН05), обусловливающими повышение выхода рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В культивированием заявляемого штамма ДАН-041/рDES 20 по сравнению с известным.The problem is solved in that the inventive recombinant plasmid DNA, according to the invention, contains the following structural elements essential for its functioning:
ColEl bacterial origin of replication [required for work in E. coli] NN n.a. 4211-4841
bacterial bla operon expressing E. coli functionally active protein β-lactamase (necessary for selection of target clones when constructing pDES20) NN n.p. 1253-2303
a fragment of natural yeast 2 m plasmid containing all the necessary nucleotide sequences to ensure its effective autonomous replication and reproduction in S. cerevisiae to the level of 50-200 copies per NN cell n.a. 2311-4203
yeast operon leu2, the expression of which in the strain S.cerevisiae DAN-041 / pDES20 gives it the ability to grow on selective medium without leucine (necessary as a selective marker for the transformation of the strain S.cerevisiae YPH501) NN n.p. 4848-7062
artificial yeast operon HBsAg / ayw (provides efficient controlled exogenous phosphate level expression of the target HBsAg / ayw polypeptide), including: a minimal fragment of the 5 'untranslated region of the yeast operon ph05, providing controlled initiation of NN transcription n.a. 7-313 minimum fragment of the 3 'untranslated region of the yeast operon ph05, providing efficient termination of transcription and processing of NN mRNA n.p. 1058-1237 modified synthetic region encoding the leader untranslated region of secreted acid phosphatase mRNA (gene PH05): AAAAAAAACAACAACAAATAGA-GCAAGCAAATTCGAGATTACCA NN n.p. 314-357 synthetic gene of HBsAg / ayw NN n.p. 358-1035
ATGGAAACATTACTTCTGCTTTCCTAGGTCCATTGTTGGTTTTGCAAGCTGGTTTTTTC CTGCTGACTAGAATTTTGACTATTCCACAAAGTCTAGACTCTTGGTGGACTTCTTTGAAT TTTTTGGGTGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC TCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATAGATGGATGTGTTTGAGAAGATTT ATTATTTTCTTGTTCATTTTGTTGTTGTGTTTGATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTAT SAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCTTCAACTACTTCTACTGGTCCA TGTAGAACTTGTATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACC AAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAA The claimed plasmid p DES 20 includes yeast artificial operon HBsAg / ayw with a synthetic gene HBsAg / ayw polypeptide primary structure which takes into account the codons most frequently used in intensively expressed genes S. cerevisiae (T. Maryama , T. Gojobort, SI.Aota, T. Ikemura. Nucl. Acids Re s. 1986. V.14, Suppl. P.151-197), and a modified synthetic region encoding the leader untranslated region of mRNA of secreted acid phosphatase (PH05 gene), which increase the yield of the recombinant hepatitis B virus surface antigen by culturing the inventive strain DAN- 041 / pDES 20 compared with the known.
Заявляемый штамм-продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В получен трансформацией клеток дрожжевого штамма S.cerevisiae YPH501 (Stratagen). The inventive strain producing the surface antigen of hepatitis B virus obtained by transformation of cells of the yeast strain S. cerevisiae YPH501 (Stratagen).
Клетки заявляемого штамма ДАН-041/рDES 20 слегка овальной формы размером около 12 мкм. Деление клеток происходит в форме почкования, максимальный титр культуры в жидкой полноценной среде достигает 3,5х10 кл/мл. На твердой среде клетки штамма ДАН-041/рDES20 образуют характерные для сахаромицетов гладкие с ровными краями колонии светло-серо-коричневого цвета. На некоторых специальных средах клетки S.cerevisiae ДАН-041/рDES20 претерпевают мейоз и превращаются в аск с четырьмя спорами в общей оболочке. Эффективность споруляции высокая. The cells of the inventive strain DAN-041 / pDES 20 are slightly oval in shape with a size of about 12 microns. Cell division occurs in the form of budding, the maximum titer of the culture in a full-fledged liquid medium reaches 3.5x10 cells / ml. On a solid medium, cells of the DAN-041 / pDES20 strain form colonies of light gray-brown color, characteristic of saccharomycetes, smooth with smooth edges. On some special media, S.cerevisiae DAN-041 / pDES20 cells undergo meiosis and turn into ask with four spores in the common membrane. The effectiveness of sporulation is high.
Плазмида pDES20 не претерпевает структурных перестроек в S.cerevisiae. Клетки штамма ДАН-041/рDES20 практически всегда содержат большое (50-200) число копий плазмиды pDES20. Это обеспечивает ее исключительную стабильность в условиях митотического деления, что весьма важно при промышленном культивировании этого микроорганизма. Plasmid pDES20 does not undergo structural rearrangements in S. cerevisiae. Cells of strain DAN-041 / pDES20 almost always contain a large (50-200) number of copies of the plasmid pDES20. This ensures its exceptional stability under conditions of mitotic division, which is very important in the industrial cultivation of this microorganism.
В контрольных экспериментах на богатой неселективной среде не удавалось выявить заметную фракцию клеток S.cerevisiae, утративших плазмиду рDES20 [неспособных расти на селективной (leu) среде] даже через 120-150 циклов деления. In control experiments on a rich non-selective medium, it was not possible to detect a noticeable fraction of S. cerevisiae cells that lost the plasmid pDES20 [incapable of growing on selective (leu) medium] even after 120-150 fission cycles.
Дрожжи S. cerevisiae штамма ДАН-041/рDES20 растут в пределах широкого диапазона температур и рН. Оптимальные условия роста: 30oС, рН 5,8-6,0. В качестве источника углерода могут использовать различные моно- и дисахариды (дыхание), а также лактат, ацетаты, глицерин, этанол (брожение). В условиях промышленной культивации дрожжи S.cerevisiae штамма ДАН-041/рDES20 позволяют получать до 5 мг высокоиммуногенного полипептида НВsAg/ayw на 1 л плотной стационарной культуры.Yeast S. cerevisiae strain DAN-041 / pDES20 grows over a wide range of temperatures and pH. Optimum growth conditions: 30 o C, pH 5.8-6.0. Various mono- and disaccharides (respiration), as well as lactate, acetates, glycerin, ethanol (fermentation) can be used as a carbon source. Under the conditions of industrial cultivation, the yeast S. cerevisiae strain DAN-041 / pDES20 can produce up to 5 mg of the highly immunogenic HBsAg / ayw polypeptide per 1 liter of dense stationary culture.
Штамм депонирован во Всесоюзной Коллекции Промышленных Микроорганизмов, получив номер ВКПМ Y-2203. The strain is deposited in the All-Union Collection of Industrial Microorganisms, having received the VKPM number Y-2203.
Заявляемая вакцина против гепатита В, согласно изобретению, содержит в 1 мл (одна прививочная доза) 20 мкг очищенного полипептида НВsAg/ayw, полученного с помощью штамма S.cerevisiae ВКПМ Y-2203, 0,5 мг геля гидроокиси алюминия (в пересчете на AL) в буфере ПБС (50 mM Na-фосфатный буфер, рН 6,8+0,13 М NaCl) с 0,005%-ным мертиолятом натрия. The inventive hepatitis B vaccine, according to the invention, contains in 1 ml (one vaccination dose) 20 μg of purified HBsAg / ayw polypeptide obtained using S.cerevisiae strain VKPM Y-2203, 0.5 mg of aluminum hydroxide gel (in terms of AL ) in PBS buffer (50 mM Na-phosphate buffer, pH 6.8 + 0.13 M NaCl) with 0.005% sodium merthiolate.
Иммуногенность вакцины в тесте на мышах линии Ваlb/c c массой 12-14 г составляет 0,2-0,25 мкг в расчете на ED 50 (доза вакцины, вызывающая сероконверсию у 50% мышей). The immunogenicity of the vaccine in the test on Balb / c mice weighing 12-14 g is 0.2-0.25 μg per ED 50 (the dose of the vaccine that causes seroconversion in 50% of mice).
В испытаниях на волонтерах заявляемая вакцина по сравнению с известными обнаруживает наиболее высокие иммуногенные свойства на фоне самого низкого побочного реактогенного эффекта. In tests on volunteers, the claimed vaccine, in comparison with the known ones, shows the highest immunogenic properties against the background of the lowest side reactogenic effect.
Изобретение может быть проиллюстрированно следующими примерами. При этом все рутинные генно-инженерные (Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М. Мир, 1984) и микробиологические (Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ. Москва, Мир, 1988) операции, а также процедуры ПЦР (Saiki R.K. Gelfand D.H. Stoffel S. Sharf S.J. Higuchi R. Horn G.T. Mullis K.B. Erlich H.A. Science, 1988. V.239, N 4839, p. 487-491) и секвенирования ДНК (Sanger F. Nicklen S. Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 1977, V.74, p. 5463-5467) проводили по известным методикам. The invention can be illustrated by the following examples. Moreover, all routine genetic engineering (Maniatis T. Fritsch E. Sambrook J. Molecular cloning, M. Mir, 1984) and microbiological (DNA Cloning. Methods. Edited by D. Glover, Per. From English. Moscow, Mir, 1988) operations, as well as PCR procedures (Saiki RK Gelfand DH Stoffel S. Sharf SJ Higuchi R. Horn GT Mullis KB Erlich HA Science, 1988. V.239, N 4839, p. 487-491) and DNA sequencing (Sanger F Nicklen S. Coulson AR Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 1977, V.74, p. 5463-5467) was carried out according to known methods.
Пример 1. Получение челночной (Е.coli/ S.cerevisiae) рекомбинантной плазмиды рDES20 с искусственным опероном для экспрессии в дрожжах S.cerevisiae синтетического гена полипептида НВsAg/ayw. Example 1. Obtaining a shuttle (E. coli / S. cerevisiae) recombinant plasmid pDES20 with an artificial operon for expression of the synthetic gene HBsAg / ayw polypeptide in yeast S. cerevisiae.
А. Химический синтез однотяжевых фрагментов ДНК (олигодезоксирибонуклеотидов). A. Chemical synthesis of single-stranded DNA fragments (oligodeoxyribonucleotides).
Синтетические олигонуклеотиды получены стандартным твердофазным амидофосфитным методом на отечественном автоматическом синтезатора ASM102Q (Новосибирск) и очищены электрофорезом в 12% -ном полиакриламидном геле (Matteucci M.D. Caruthers M.H. J.Amer.Chem.Soc. 1981, V.103, N 11, p. 3185- 3191). Synthetic oligonucleotides were obtained by the standard solid-phase amidophosphite method on a domestic automatic synthesizer ASM102Q (Novosibirsk) and purified by electrophoresis in 12% polyacrylamide gel (Matteucci MD Caruthers MHJAmer.Chem.Soc. 1981, V.103, N 11, p. 3185-3191, 3185-3191 )
5'-Фосфорилирование олинонуклеотидов приводили с помощью АТР и полинуклеотидкиназы фага Т4 по стандартной прописи (Королева О.Н. Друца В.Л. Долинная Н. Г. Цытович А.В. Шабарова З.А. Молекуляр.биология, 1984, т.18, с. 146-160). 5'-phosphorylation of olinonucleotides was carried out using ATP and polynucleotide kinase of phage T4 according to a standard prescription (Koroleva O.N. Drutsa V.L. Dolinnaya N.G. Tsytovich A.V. Shabarova Z.A. 18, p. 146-160).
В работе использовано 48 синтетических олигонуклеотидов: рGCAGCAATGGCAACAAC= p17rpst; pCGGCATCGTGGTGTCACGC= p19pst; pATCGGAGGACCGAAGGA=p17rpvu; pGGTTGTCAGAAGTAAGTTG=p19pvu; pTAGGATCCTCGAGGCCGCGTTGCTGG=p26ao; pACCCCGTAGAAAAGATCA= p18rao; pAACCCCTATTTGTTTATTTTTC=p22rab; pGCTGCAGCTATCGCGAGATTATCAAAAAGGATCT= p34ab; CGGATCCAACGAACGCAACTGC=22ap; TTCTCATGAGAGATGAAG=18rap; CGGATCCTGGTACTCCTCAAGGT= 23at; CCGCTGCAGAAGTCAGTACCGGCT= 24rat; CGGCTCGAGAACTTCTAGTATATC= 24al; CCGCTCGAGTACGTCGTAAGGCCG= 24ral; GACGGTAACCAGCTTCTCAATGATATT= 27au; GTCGGTTACCAAGCTTTGAAGAAAAATGC= 29rau; CATCTCTCATGAGA=14gl; pCTTGCTCTATTTGTTGTTGTTTTTTTTCTCATGAGAGATG=p40rg2; pTAGAGCAAGCAAATTCGA=p18g3; pGAAAGCAGAAGTAATGTTTTCCATTGGTAATCTCGAATTTGp41rg4; pTCTGCTTTCCTAGGTCC=p17g5; pCAGGAAAAAACCAGCTTGCAAAACCAACAATGGACCTAG=p39rg6; pGTTTTTTCCTGCTGACTAGAp20g7; pCACCAAGAGTCTAGACTTTGTGGAATAGTCAAAATTCTAGTCAG= p44rg8; pCTCTTGGTGGACTTCTTT= p18g9; pCGAATTTTGGCCAAGACACACGGTAGTTCCACCCAAAAAATTCAAAGAAGTC p52rg10; pCCAAAATTCGCAGTCCCC= p18g11; pGACAAGTTGGAGGACAGGAGGTTGGTGAGTGATTGGAGGTTGGGGACTG= p49rg12; pCAACTTGTCCTGGTTATAG p19g13; pAACAAGAAAATAATAAATCTTCTCAAACACATCCATCTATAACCAG= p46rg14; pTTTTCTTGTTCATTTTGTTG=p20g15; pCTTGATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGATCAAACACAACAACAAAATG= p50rg16; pGACTATCAAGGTATGTTGC p19g17; pCAGTAGAAGTAGTTGAAGATCCTGGAATTAGAGGACAAACGGGCAACATAC= p51rg18; pCTTCTACTGGTCCATGTA p18g19; pGATACATAGAGGTTCCTTGAGCAGTAGTCATACAAGTTCTACATGGAC= p48rg20; pTCTATGTATCCCTCCTGTT= p19g21; pGATGGGAATACAGGTGCAATTTCCGTCCGAAGGTTTGGTACAGCAACAGGAGG= p53rg22; pATTCCCATCCCATCATCC= p18g23; pGCTGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTCCGAAAGCCCAGGATGATGG= p47rg24; pGCCTCAGCCCGTTTCTC= p17g25; pCATTGAACAAATGGAACCAACAAAGACAACCAGGAGAAACGG p42rg26; pTTGTTCAATGGTTCGTTGG=p19g27; pCCAATACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCAAACAGTTGGAGACAAACCAACGAAC p58rg28; pTGGTATTGGGGTCCATCT p18g29; pCCACAAACAGAAGAAAATTGGCAACAATGGCAAAAATGGAGACAAAATAGAGTACAAAGATGGACCp66rg30; pTGTTTGTGGGTTTACATTTA=p20g31; CGGATCCTACTTAGCTATCATTAAATGTAAAC 32rg32. 48 synthetic oligonucleotides were used in the work: pGCAGCAATGGCAACAAC = p17rpst; pCGGCATCGTGGTGTCACGC = p19pst; pATCGGAGGACCGAAGGA = p17rpvu; pGGTTGTCAGAAGTAAGTTG = p19pvu; pTAGGATCCTCGAGGCCGCGTTGCTGG = p26ao; pACCCCGTAGAAAAGATCA = p18rao; pAACCCCTATTTGTTTATTTTTC = p22rab; pGCTGCAGCTATCGCGAGATTATCAAAAAGGATCT = p34ab; CGGATCCAACGAACGCAACTGC = 22ap; TTCTCATGAGAGATGAAG = 18rap; CGGATCCTGGTACTCCTCAAGGT = 23at; CCGCTGCAGAAGTCAGTACCGGCT = 24rat; CGGCTCGAGAACTTCTAGTATATC = 24al; CCGCTCGAGTACGTCGTAAGGCCG = 24ral; GACGGTAACCAGCTTCTCAATGATATT = 27au; GTCGGTTACCAAGCTTTGAAGAAAAAATGC = 29rau; CATCTCTCATGAGA = 14gl; pCTTGCTCTATTTGTTGTTGTTTTTTTTCTCATGAGAGATG = p40rg2; pTAGAGCAAGCAAATTCGA = p18g3; pGAAAGCAGAAGTAATGTTTTCCATTGGTAATCTCGAATTTGp41rg4; pTCTGCTTTCCTAGGTCC = p17g5; pCAGGAAAAAACCAGCTTGCAAAACCAACAATGGACCTAG = p39rg6; pGTTTTTTCCTGCTGACTAGAp20g7; pCACCAAGAGTCTAGACTTTGTGGAATAGTCAAAATTCTAGTCAG = p44rg8; pCTCTTGGTGGACTTCTTT = p18g9; pCGAATTTTGGCCAAGACACACGGTAGTTCCACCCAAAAAATTCAAAGAAGTC p52rg10; pCCAAAATTCGCAGTCCCC = p18g11; pGACAAGTTGGAGGACAGGAGGTTGGTGAGTGATTGGAGGTTGGGGACTG = p49rg12; pCAACTTGTCCTGGTTATAG p19g13; pAACAAGAAAATAATAAATCTTCTCAAACACATCCATCTATAACCAG = p46rg14; pTTTTCTTGTTCATTTTGTTG = p20g15; pCTTGATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGATCAAACACAACAACAAAATG = p50rg16; pGACTATCAAGGTATGTTGC p19g17; pCAGTAGAAGTAGTTGAAGATCCTGGAATTAGAGGACAAACGGGCAACATAC = p51rg18; pCTTCTACTGGTCCATGTA p18g19; pGATACATAGAGGTTCCTTGAGCAGTAGTCATACAAGTTCTACATGGAC = p48rg20; pTCTATGTATCCCTCCTGTT = p19g21; pGATGGGAATACAGGTGCAATTTCCGTCCGAAGGTTTGGTACAGCAACAGGAGG = p53rg22; pATTCCCATCCCATCATCC = p18g23; pGCTGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTCCGAAAGCCCAGGATGATGG = p47rg24; pGCCTCAGCCCGTTTCTC = p17g25; pCATTGAACAAATGGAACCAACAAAGACAACCAGGAGAAACGG p42rg26; pTTGTTCAATGGTTCGTTGG = p19g27; pCCAATACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCAAACAGTTGGAGACAAACCAACGAAC p58rg28; pTGGTATTGGGGTCCATCT p18g29; pCCACAAACAGAAGAAAATTGGCAACAATGGCAAAAATGGAGACAAAATAGAGTACAAAGATGGACCp66rg30; pTGTTTGTGGGTTTACATTTA = p20g31; CGGATCCTACTTAGCTATCATTAAATGTAAAC 32rg32.
Б. Сборка синтетического гена полипептида НВsAg/ayw с лидерной нетранслируемой областью мРНК секретируемой кислой фосфатазы, кассетой кодонов-терминаторов и 3'-концевым сайтом рестрикции BamHI. B. Assembling a synthetic HBsAg / ayw polypeptide gene with a leader untranslated secreted acid phosphatase mRNA region, a codon terminator cassette, and a 3-terminal BamHI restriction site.
Реакционную смесь (500 мкл), содержащую буфер L (50 мМ трис-НСl, рН 7,5, 10 мМ МgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА), АТР (1 мМ) и олигонуклеотиды: 32rg32 (100 пмоль, 0,0318 О.Е./260 нм), р20g31 (102 пмоль, 0,0191 О.Е. /260 нм), р66rg30 (104 пмоль, 0,0772 О.Е./260 нм), р18g29 (106 пмоль, 0,0175 О. Е. /260 нм), р58rg28 (108 пмоль, 0,0654 О.Е./260 нм), р19g27 (110 пмоль, 0,0192 О. Е. /260 нм), р42rg26 (112 пмоль, 0,0522 О.Е./260 нм), р17g25 (114 пмоль, 0,0156 О.Е./260 нм), р47rg24 (116 пмоль, 0,053 О.Е./260 нм), р18g23 (118 пмоль, 0,0181 О.Е./260 нм), р53rg22 (120 пмоль, 0,0649 О.Е./260 нм), р19g21 (122 пмоль, 0,0194 О.Е./260 нм), р48rg20 (124 пмоль, 0,0599 О.Е./260 нм), р18g19 (126 пмоль, 0,0202 О.Е./260 нм), р51rg18 (128 пмоль, 0,0698 О.Е. /260 нм), р19g17 (130 пмоль, 0,0245 О.Е./260 нм), р50rg16 (132 пмоль, 0,0727 О. Е. /260 нм), р20g15 (134 пмоль, 0,0226 О.Е./260 нм), р46rg14 (136 пмоль, 0,0664 О. Е. /260 нм), р19g13 (138 пмоль, 0,0246 О.Е./260 нм), р49rg12 (140 пмоль, 0,0713 О.Е./260 нм), р18g11 (142 пмоль, 0,0235 О.Е./260 нм), р52rg10 (144 пмоль, 0,0768 О. Е. /260 нм), р18g9 (146 пмоль, 0,0223 О.Е./260 нм), р44rg8 (148 пмоль, 0,0663 О.Е./260 нм), р20g7 (150 пмоль, 0,027 О.Е./260 нм), р39rg6 (152 пмоль, 0,0636 О.Е./260 нм), р17g5 (154 пмоль, 0,0215 О.Е. /260 нм), р41rg4 (156 пмоль, 0,065 О.Е./260 нм), р18g3 (158 пмоль, 0,0309 О. Е. /260 нм), р40rg2 (160 пмоль, 0,0574 О.Е./260 нм), 14g1 (162 пмоль, 0,0217 О. Е. /260 нм), нагревали до 65oС, выдерживали 3 мин и медленно (3 ч) охлаждали до 10oС. Добавляли Т4-ДНК-лигазу (100 ед.акт.), выдерживали при этой температуре 18 ч, добавляли смесь 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов SdNTP до концентрации каждого 0,2 мМ и Т4-ДНК-полимеразу (60 ед.акт.), выдерживали при комнатной температуре 1 ч, снова добавляли Т4-ДНК-лигазу (30 ед.акт.) и выдерживали при комнатной температуре еще 3 ч. Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/ хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис-НСl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), добавляли 1/10 объема буфера А (ТЕ с сахарозой (40%) и красителями ксиленцианолом и бромфеноловым синим) и выделяли целевой ген (758 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы. Для извлечения ДНК из геля кусочек легкоплавкой агарозы с соответствующим по электрофоретической подвижности фрагментом ДНК расплавляли при 65oС (5 мин), обрабатывали ферментом b-агаразой (1 ед.акт. 1 ч), раствор перевара агарозы экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ.The reaction mixture (500 μl) containing buffer L (50 mm Tris-Hcl, pH 7.5, 10 mm MgCl 2 , 10 mm 2-mercaptoethanol, 0.1 mm EDTA), ATP (1 mm) and oligonucleotides: 32rg32 ( 100 pmol, 0.0318 O.E. / 260 nm), p20g31 (102 pmol, 0.0191 O.E. / 260 nm), p66rg30 (104 pmol, 0.0772 O.E. / 260 nm), p18g29 (106 pmol, 0.0175 O.E. / 260 nm), p58rg28 (108 pmol, 0.0654 O.E. / 260 nm), p19g27 (110 pmol, 0.0192 O.E. / 260 nm), p42rg26 (112 pmol, 0.0522 O.E. / 260 nm), p17g25 (114 pmol, 0.0156 O.E. / 260 nm), p47rg24 (116 pmol, 0.053 O.E. / 260 nm), p18g23 (118 pmol, 0.0181 O.E. / 260 nm), p53rg22 (120 pmol, 0.0649 O.E. / 260 nm), p19g21 (122 pmol, 0.0194 O.E. / 260 nm), p48rg20 (124 pmol, 0.0599 O.E. / 260 nm), p18g19 (126 pmol, 0.0202 O.E. / 260 nm), p51rg18 (128 pmol, 0.0698 O.E. / 260 nm), p19g17 (130 pmol, 0.0245 O.E. / 260 nm), p50rg16 (132 pmol, 0.0727 O.E. / 260 nm), p20g15 (134 pmol, 0.0226 O.E. / 260 nm), p46rg14 (136 pmol, 0.0664 O.E. / 260 nm), p19g13 (138 pmol, 0.0246 O.E. / 260 nm), p49rg12 (140 pmol, 0.0713 O.E. (260 nm), p18g11 (142 pmol, 0.0235 O.E. / 260 nm), p52rg10 (144 pmol, 0.0768 O.E. / 260 nm), p18g9 (146 pmol, 0.0223 O.E. ./260 nm), p44rg8 (148 pmol, 0.0663 O.E. / 260 nm), p20g7 (150 pmol, 0.027 O.E. / 260 nm), p39rg6 (152 pmol, 0.0636 O.E. / 260 nm), p17g5 (154 pmol, 0.0215 O.E. (260 nm), p41rg4 (156 pmol, 0.065 O.E. / 260 nm), p18g3 (158 pmol, 0.0309 O.E. / 260 nm), p40rg2 (160 pmol, 0.0574 O.E. / 260 nm), 14g1 (162 pmol, 0.0217 O.E. / 260 nm), heated to 65 ° C. , held for 3 minutes and cooled slowly (3 hours) to 10 ° C. T4 DNA ligase (100) was added. units), kept at this temperature for 18 hours, a mixture of 4 SoxNTP deoxynucleoside triphosphates was added to a concentration of 0.2 mM each and T4 DNA polymerase (60 units), kept at room temperature for 1 hour, and again added T4 DNA ligase (30 units) and kept at room temperature for another 3 hours. The reaction mixture was extracted with an equal volume a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and DNA was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer (10 mM Tris-Hcl, pH 8.0, 1 mM EDTA), 1/10 volume of buffer A (TE with sucrose (40%) and dyes was added xylene cyanol and bromophenol blue) and isolated the target gene (758 bp) in a 0.6% gel of low-melting agarose. To extract DNA from the gel, a piece of low-melting agarose with an appropriate electrophoretic mobility fragment of the DNA was melted at 65 ° C (5 min), treated with the enzyme b-agarase (1 unit act. 1 h), the agarose digest solution was extracted with an equal volume of phenol / chloroform mixture (1: 1), then with an equal volume of a mixture of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) and DNA was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, and dissolved in TE buffer.
В. Получение минимального фрагмента 5'-нетранслируемой области дрожжевого оперона рho5, обеспечивающего контролируемую инициацию транскрипции. B. Obtaining a minimal fragment of the 5'-untranslated region of the yeast operon pho5 providing for controlled initiation of transcription.
Копию фрагмента промоторной области оперона рho5 получали методом полимеразных цепных реакций (ПЦР). Реакционную смесь (100 мкл), содержащую суммарную ДНК дрожжей S.cerevisiae дикого типа (100 мкг), олигонуклеотиды 22ар (0.1 нмоль, 0,022 О.Е./260 нм) и 18rap (0,1 нмоль, 0,019 О.Е./260 нм), смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dGTP, dCTP и dTTP (ΣdNTP; каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Тag 10 ед.акт.) в буфере П (67 мМ трис-НСl/рН 8,8 при 25oС), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% ТВИН-20) подвергали периодическому нагреву и охлаждению (18 циклов: 94oС 0,5 мин; 50oС 1 мин; 72oС 1 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1: 1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ПЦР-продукт (316 н.п.) в 1,0%-ном геле легкоплавкой агарозы.A copy of the promoter region fragment of the pho operon was obtained by polymerase chain reaction (PCR). The reaction mixture (100 μl) containing the total DNA of wild-type S. cerevisiae yeast (100 μg), oligonucleotides 22AR (0.1 nmol, 0.022 O.E. / 260 nm) and 18rap (0.1 nmol, 0.019 O.E. / 260 nm), a mixture of dATP, dGTP, dCTP and dTTP deoxynucleoside triphosphates (ΣdNTP; each 0.2 mM) and Tag DNA polymerase 10 units of act.) In buffer P (67 mM Tris-Hcl / pH 8.8 at 25 o C), 16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% TWIN-20) were subjected to periodic heating and cooling (18 cycles: 94 o C 0.5 min; 50 o C 1 min; 72 o C 1 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added, and the target PCR product (316 bp) was isolated in a 1.0% low-melting agarose gel.
Г. Присоединение промотора к синтетическому гену мРНК полипептида НВsAg/ayw с кассетой кодонов-терминаторов и 3'-концевым сайтом рестрикции BamHl. D. Attachment of the promoter to the synthetic mRNA gene of the HBsAg / ayw polypeptide with a codon of terminator codons and a 3'-terminal restriction site BamHl.
Соединение фрагмента промотора и синтетического гена полипептида НВsAg/may проводили методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую полученный в примере N 3 ПЦР-продукт (0,1 мкг), собранный и очищенный (пример N 2) синтетический ген полипептида НВsAg/ayw (0,2 мкг), олигонуклеотиды 22 ар (0,1 нмоль, 0,022 О.Е./260 нм) и 32rg32 (0,1 нмоль, 0,032 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таg (10 ед.акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (8 циклов: 94oС 0,5 мин; 42oС 2 мин; 72oС 1,5 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24: 1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р (10 мМ трис-НСl (рН 7,5 при 37oС), 10 мМ МgCl2, 50 мМ NaCl) расщепляли эндонуклеазой рестрикции BamНl (50 ед.акт. 1 ч, 37oС). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (1051 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.The connection of the promoter fragment and the synthetic gene of the HBsAg / may polypeptide was carried out by PCR. The reaction mixture (100 μl) containing the PCR product obtained in Example 3 (0.1 μg), collected and purified (Example 2), the HBsAg / ayw synthetic polypeptide gene (0.2 μg), 22 ar oligonucleotides (0, 1 nmol, 0.022 O.E. / 260 nm) and 32rg32 (0.1 nmol, 0.032 O.E. / 260 nm), a mixture of ΣdNTP (each 0.2 mM) and Tag DNA polymerase (10 unit act. ) in buffer P was subjected to periodic heating and cooling (8 cycles: 94 o C 0.5 min; 42 o C 2 min; 72 o C 1.5 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air and dissolved in TE buffer. DNA after PCR in 100 μl of buffer P (10 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 37 ° C), 10 mM MgCl 2 , 50 mM NaCl) was digested with BamHl restriction endonuclease (50 unit act. 1 h, 37 o C ) The reaction mixture was extracted with an equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added, and the target DNA duplex (1051 bp) was isolated in a 0.6% gel of low-melting agarose.
Д. Получение минимального фрагмента 3'-нетранслируемой области дрожжевого оперона рho5, обеспечивающего эффективную терминацию транскрипции и процессинг мРНК. D. Obtaining a minimal fragment of the 3'-untranslated region of the yeast operon pho5, which provides effective termination of transcription and processing of mRNA.
Копию минимального терминатора дрожжевого оперона pho5 получали методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую суммарную ДНК дрожжей S.cerevisiae дикого типа (100 мкг), олигонуклеотиды 23at (0,1 нмоль, 0,021 О.Е./260 нм) и 24rat (0,1 нмоль, 0,023 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед.акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (18 циклов: 94oС 0,5 мин; 50oС 1 мин; 72oС 1 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24: 1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHl и Pstl (по 20 ед. акт. 1 ч, 37oС). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1: 1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (186 н. п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы. Е. Получение фрагмента дрожжевой ДНК с опероном leu2.A copy of the minimal terminator of the pho5 yeast operon was obtained by PCR. The reaction mixture (100 μl) containing the total DNA of wild-type S. cerevisiae yeast (100 μg), oligonucleotides 23at (0.1 nmol, 0.021 OE / 260 nm) and 24rat (0.1 nmol, 0.023 OE ./260 nm), a mixture of ΣdNTP (each 0.2 mM) and Taq DNA polymerase (10 act units) in buffer P were periodically heated and cooled (18 cycles: 94 ° C 0.5 min; 50 ° C) 1 min; 72 o C 1 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air and dissolved in TE buffer. DNA after PCR in 100 μl of buffer P was digested with restriction endonucleases BamHl and Pstl (20 units of act. 1 h, 37 ° C). The reaction mixture was extracted with an equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added, and the target DNA duplex (186 bp) was isolated in a 0.6% low-melting agarose gel. E. Preparation of a yeast DNA fragment with the leu2 operon.
Копию фрагмента дрожжевой ДНК с опероном leu2 получали методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую суммарную ДНК дрожжей S.cerevisiae дикого типа (100 мкг), олигонуклеотиды 24аl (0,1 нмоль, 0,023 О.Е./260 нм) и 24ral (0,1 нмоль, 0,022 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНКполимеразу Таq (10 ед. акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (18 циклов: 94oС 0,5 мин; 48oС 1 мин; 72oС 3 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р расщепляли эндонуклеазой рестрикции Xhol (50 ед.акт. 1 ч, 37oС). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (2221 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.A copy of the yeast DNA fragment with the leu2 operon was obtained by PCR. The reaction mixture (100 μl) containing the total DNA of wild-type S. cerevisiae yeast (100 μg), oligonucleotides 24al (0.1 nmol, 0.023 OE / 260 nm) and 24ral (0.1 nmol, 0.022 OE ./260 nm), a mixture of ΣdNTP (each 0.2 mM) and Taq DNA polymerase (10 act units) in buffer P were periodically heated and cooled (18 cycles: 94 ° C 0.5 min; 48 ° C 1 min ; 72 o C 3 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air and dissolved in TE buffer. DNA after PCR in 100 μl of buffer P was digested with Xhol restriction endonuclease (50 unit act. 1 h, 37 ° C). The reaction mixture was extracted with an equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added, and the target DNA duplex (2221 bp) was isolated in a 0.6% low-melting agarose gel.
Ж. Получение фрагмента природной дрожжевой 2m-плазмиды. G. Obtaining a fragment of a natural yeast 2m plasmid.
Копию фрагмента природной дрожжевой 2m-плазмиды получали методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую 100 мкг суммарной ДНК дрожжей S.cerevisiae дикого типа [cir+] олигонуклеотиды 27au (0,1 нмоль, 0,027 О.Е./260 нм) и 29 rau (0,1 нмоль, 0,03 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед.акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (18 циклов: 94oС 0,5 мин; 48oС 1 мин; 72oС 3 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р расщепляли эндонуклеазой рестрикции Eco91l (50 ед.акт 1 ч, 37oС). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (1990 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.A copy of a fragment of a natural yeast 2m plasmid was obtained by PCR. The reaction mixture (100 μl) containing 100 μg of the total DNA of wild-type S. cerevisiae yeast [cir + ] oligonucleotides 27au (0.1 nmol, 0.027 OE / 260 nm) and 29 rau (0.1 nmol, 0, 03 O.E. / 260 nm), a mixture of ΣdNTP (each 0.2 mM) and Taq DNA polymerase (10 units), in buffer P, was subjected to periodic heating and cooling (18 cycles: 94 ° C. 0.5 min ; 48 o C 1 min; 72 o C 3 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air and dissolved in TE buffer. DNA after PCR in 100 μl of buffer P was digested with restriction endonuclease Eco91l (50 units of act 1 h, 37 o C). The reaction mixture was extracted with an equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added and the target DNA duplex (1990 bp) was isolated in a 0.6% gel of low-melting agarose.
З. Получение бактериального оперона β -лактамазы. H. Obtaining the bacterial operon β-lactamase.
Копию оперона b-лактамазы, не содержащего сайтов рестрикции Pvul и Pstl, получали в два этапа. A copy of the b-lactamase operon without the Pvul and Pstl restriction sites was obtained in two steps.
З. 1. На первом этапе методом ПЦР получали модифицированные копии двух фрагментов (4235 и 126 н.п.) плазмиды pBR322. Модификации замены одной н.п. в каждой копии, уничтожающие сайты рестрикции Pvul и Pstl без нарушения аминокислотной последовательности b -лактамазы. Z. 1. At the first stage, modified copies of two fragments (4235 and 126 np) of plasmid pBR322 were obtained by PCR. Modifications for the replacement of one n.p. in each copy, destroying the restriction sites Pvul and Pstl without disrupting the amino acid sequence of β-lactamase.
З. 1.1. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую плазмиду pBR322 (10 нг), олигонуклеотиды р19рvu (0,1 нмоль, 0,02 О.Е./ 260 нм) и р17rpst (0,1 нмоль, 0,018 О.Е./260 нм), смесь SdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед. акт. ) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (8 циклов: 94oС 0,5 мин; 52oС 1 мин; 72oС 6 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р обрабатывали ДНК-полимеразой фага Т4 (5 ед. акт. 15 мин, 37oС) в присутствии смеси ΣdNTP (каждый 0,2 мМ). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (4235 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.Z. 1.1. The reaction mixture (100 μl) containing the plasmid pBR322 (10 ng), p19pvu oligonucleotides (0.1 nmol, 0.02 O.E. / 260 nm) and p17rpst (0.1 nmol, 0.018 O.E. / 260 nm ), a mixture of SdNTP (each 0.2 mM) and Taq DNA polymerase (10 act units) in buffer P were periodically heated and cooled (8 cycles: 94 ° C 0.5 min; 52 ° C 1 min; 72 o C 6 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air and dissolved in TE buffer. DNA after PCR in 100 μl of buffer P was treated with T4 phage DNA polymerase (5 units act. 15 min, 37 ° C) in the presence of a ΣdNTP mixture (each 0.2 mM). The reaction mixture was extracted with an equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added, and the target DNA duplex (4235 bp) was isolated in a 0.6% low-melting agarose gel.
З. 1.2. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую плазмиду pBR322 (10 нг), олигонуклеотиды р19pst (0,1 нмоль, 0,017 О.Е./260 нм) и р17rpvu (0,1 нмоль, 0,018 О.Е./260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед. акт) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (14 циклов: 94oС 0,5 мин; 52oС 1 мин; 72oС 1 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1: 1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р обрабатывали ДНК-полимеразой фага Т4 (5 ед.акт. 15 мин, 37oС) в присутствии смеси ΣdNTP (каждый 0,2 мМ). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/ хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (126 н.п.) в 1,0%-ном геле легкоплавкой агарозы.Z. 1.2. The reaction mixture (100 μl) containing the plasmid pBR322 (10 ng), p19pst oligonucleotides (0.1 nmol, 0.017 O.E. / 260 nm) and p17rpvu (0.1 nmol, 0.018 O.E. / 260 nm), a mixture of ΣdNTP (each 0.2 mM) and Taq DNA polymerase (10 units of act) in buffer P was subjected to periodic heating and cooling (14 cycles: 94 ° C 0.5 min; 52 ° C 1 min; 72 ° C 1 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air and dissolved in TE buffer. DNA after PCR in 100 μl of buffer P was treated with T4 phage DNA polymerase (5 unit act. 15 min, 37 ° C. ) in the presence of a ΣdNTP mixture (each 0.2 mM). The reaction mixture was extracted with an equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added and the target DNA duplex (126 bp) was isolated in 1.0% low-melting agarose gel.
З.1.3. Реакционную смесь (10 мкл), содержащую ПЦР-дуплексы, полученные в экспериментах "З. 1.1" (0,2 мкг) и "З.1.2" (0,1 мкг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед.акт.) в буфере L выдерживали при комнатной температуре 18 ч и использовали для трансформации E. coli: добавляли к 200 мкл компетентных клеток штамма JM109, выдерживали полученный коктейль 30 мин во льду и 3 мин при 45oС, разбавляли его 1 мл питательной среды dyt (16 г/л бакто-триптон, 10 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl), инкубировали 40 мин при 37oС и высевали на чашки с агаризованной (1,2%) средой dyt, содержащей ампициллин (100 мг/л). Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (рBR322-PP) не расщеплялась рестриктазами Рvul и Pstl.H.1.3. The reaction mixture (10 μl) containing PCR duplexes obtained in experiments "Z. 1.1" (0.2 μg) and "Z.1.2" (0.1 μg), ATP (1 mm) and T4-DNA ligase (10 act.) In buffer L was kept at room temperature for 18 h and used for transformation of E. coli: added to 200 μl of competent cells of strain JM109, the resulting cocktail was kept for 30 min in ice and 3 min at 45 ° C, diluted 1 ml of dyt culture medium (16 g / l bacto-tryptone, 10 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl) were incubated for 40 min at 37 ° C and plated on plates with agarized (1.2%) dyt medium, containing ampicillin (100 mg / l). Clones were selected whose plasmid DNA (pBR322-PP) was not cleaved with restriction enzymes Pvul and Pstl.
3.2. На втором этапе с помощью ПЦР получали копию оперона β -лактамазы, не содержащего сайтов рестрикции Pvul и Pstl. 3.2. At the second stage, a copy of the β-lactamase operon that does not contain the restriction sites Pvul and Pstl was obtained by PCR.
Реакционную смесь (100 мкл), содержащую плазмиду рBR322- PP (10 нг), олигонуклеотиды р34аb (0,1 нмоль, 0,034 О.Е./260 нм) и р22rab (0,1 нмоль, 0,019 О.Е./260 нм), смесь SdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед. акт. ) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (8 циклов: 94oС 0,5 мин; 56oС 1 мин; 72oС 1,5 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р обрабатывали ДНК-полимеразой фага Т4 (5 ед. акт. 15 мин, 37oС) в присутствии смеси ΣdNTP (каждый 0,2 мМ). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (1071 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.The reaction mixture (100 μl) containing plasmid pBR322-PP (10 ng), oligonucleotides p34ab (0.1 nmol, 0.034 O.E. / 260 nm) and p22rab (0.1 nmol, 0.019 O.E. / 260 nm ), a mixture of SdNTP (each 0.2 mM) and Taq DNA polymerase (10 act units) in buffer P were periodically heated and cooled (8 cycles: 94 ° C 0.5 min; 56 ° C 1 min; 72 o With 1.5 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air and dissolved in TE buffer. DNA after PCR in 100 μl of buffer P was treated with T4 phage DNA polymerase (5 units act. 15 min, 37 ° C) in the presence of a ΣdNTP mixture (each 0.2 mM). The reaction mixture was extracted with an equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added, and the target DNA duplex (1071 bp) was isolated in 0.6% low-melting agarose gel.
И. Получение бактериального ориджина репликации СоlEl. I. Obtaining bacterial origin of replication of ColEl.
Копию бактериального ориджина репликации СоlEl получали методом ПЦР. Реакционную смесь (100 мкл), содержащую плазмиду рВR322 (10 нг), олигонуклеотиды р26ао (0,1 нмоль, 0,025 О.Е./260 нм) и р18rao (0,1 нмоль, 0,019 О.Е. /260 нм), смесь ΣdNTP (каждый 0,2 мМ) и ДНК-полимеразу Таq (10 ед.акт.) в буфере П подвергали периодическому нагреву и охлаждению (12 циклов: 94oС 0,5 мин; 54oС 1 мин; 72oС 1 мин). Полученную ПЦР-смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1: 1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере ТЕ. ДНК после ПЦР в 100 мкл буфера Р обрабатывали ДНК-полимеразой фага Т4 (5 ед. акт. 15 мин, 37oС) в присутствии смеси ΣdNTP (каждый 0,2 мМ). Реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80% -ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в буфере ТЕ, добавляли 1/10 объема буфера А и выделяли целевой ДНК-дуплекс (647 н.п.) в 0,6%-ном геле легкоплавкой агарозы.A copy of the bacterial origin of ColEl replication was obtained by PCR. The reaction mixture (100 μl) containing plasmid pBR322 (10 ng), oligonucleotides p26ao (0.1 nmol, 0.025 O.E. / 260 nm) and p18rao (0.1 nmol, 0.019 O.E. / 260 nm), a mixture of ΣdNTP (each 0.2 mM) and Taq DNA polymerase (10 units) in buffer P was periodically heated and cooled (12 cycles: 94 ° C 0.5 min; 54 ° C 1 min; 72 ° C) 1 min). The resulting PCR mixture was extracted with an equal volume of a phenol / chloroform mixture (1: 1), then an equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol mixture (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air and dissolved in TE buffer. DNA after PCR in 100 μl of buffer P was treated with T4 phage DNA polymerase (5 units act. 15 min, 37 ° C) in the presence of a ΣdNTP mixture (each 0.2 mM). The reaction mixture was extracted with an equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then with an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, dissolved in TE buffer, 1/10 volume of buffer A was added, and the target DNA duplex (647 bp) was isolated in 0.6% low-melting agarose gel.
К. Сборка челночной (E.coli/S.cerevisiae) рекомбинантной плазмиды рDES20 с искусственным опероном для экспрессии в дрожжах S.cerevisiae синтетического гена полипептида НВsAg/ayw. K. Assembly of the shuttle (E. coli / S. cerevisiae) recombinant plasmid pDES20 with an artificial operon for expression of the synthetic gene HBsAg / ayw polypeptide in yeast S. cerevisiae.
Конструирование плазмиды рDES20 проводили путем сборки из ориджина репликации СоlEl и оперона bla базового вектора рВ1 и последовательного встраивания в него фрагмента 3'-нетранслируемой области дрожжевого оперона рho5 (вектор рВ2), фрагмента 2m-плазмиды (вектор рВ3), фрагмента дрожжевой ДНК с опероном leu2 (вектор рВ4) и кассеты экспрессии: модифицированный промотор дрожжевого оперона рh05 + синтетический ген полипептида НВsAg/ayw. The construction of plasmid pDES20 was performed by assembling from the origin of replication ColEl and the bla operon of the base vector pB1 and sequentially inserting a fragment of the 3'-untranslated region of the yeast operon pho5 (vector pB2), a fragment of the 2m plasmid (vector pB3), and a fragment of yeast DNA with the leu operon (pB4 vector) and expression cassettes: modified yeast operon promoter ph05 + synthetic HBsAg / ayw polypeptide gene.
К. 1. Реакционной смесью (10 мкл), содержащий ПЦР-дуплексы, описанные в примерах З (50 нг) и Д (50 нг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед.акт.) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки E. coli JM109. Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (1718 н.п.) расщеплялась рестриктазой Eco911 (этот сайт рестрикции возникает при "правильной" стыковке соединявшихся ДНК-дуплексов). Первичную структуру полученной плазмиды рВ1 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера. K. 1. The reaction mixture (10 μl) containing PCR duplexes described in examples Z (50 ng) and D (50 ng), ATP (1 mm) and T4-DNA ligase (10 units) in buffer L, after incubation at room temperature (2 h), competent E. coli JM109 cells were transformed. Clones were selected whose plasmid DNA (1718 bp) was digested with Eco911 restriction enzyme (this restriction site arises when the joined DNA duplexes are joined correctly). The primary structure of the obtained plasmid pB1 was confirmed by sequencing with the Sanger dideoxymethod.
К. 2. Реакционную смесь (50 мкл) плазмиды РВ1 (0,5 мкг) с эндонуклеазами рестрикции ВаmHl (20 ед.акт.) и Рstl (20 ед.акт.) в буфере Р инкубировали 1 ч при 37oС, экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, и растворяли в буфере ТЕ. Реакционной смесью (10 мкл), содержащей расщепленную эндонуклеазами рестрикции BamHl и Pstl плазмиду рВ1 (0,1 мкг), ПЦР-дуплекс, описанный в примере Д (50 нг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед.акт.) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки E.coli JM109. Отбирали клоны, из плазмидной ДНК которых (1895 н.п.) рестриктазами BamHl и Pstl выщеплялся фрагмент величиной 186 н.п. Первичную структуру полученной плазмиды рВ2 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.K. 2. The reaction mixture (50 μl) of plasmid PB1 (0.5 μg) with restriction endonucleases BamHl (20 units) and Pstl (20 units) was incubated for 1 h at 37 ° C, extracted equal volume of phenol / chloroform (1: 1), then equal volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, and dissolved in TE buffer. The reaction mixture (10 μl) containing the BamHl and Pstl restriction endonuclease digested plasmid pB1 (0.1 μg), the PCR duplex described in Example D (50 ng), ATP (1 mM) and T4 DNA ligase (10 units) .act.) in buffer L, after incubation at room temperature (2 h), competent E. coli JM109 cells were transformed. Clones were selected, from the plasmid DNA of which (1895 bp), a 186 bp fragment was cleaved by restriction enzymes BamHl and Pstl. The primary structure of the obtained plasmid pB2 was confirmed by sequencing with the Sanger dideoxymethod.
К. 3. Реакционную смесь (50 мкл) плазмиды РВ2 (0,5 мкг) с эндонуклеазой рестрикции Eco911 (10 ед.акт.) в буфере Р инкубировали 1 ч при 37oС, экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, и растворяли в буфере ТЕ. Реакционной смесью (10 мкл), содержащей расщепленную эндонуклеазой рестрикции Есо91l плазмиду рВ2 (0,1 мкг), ПЦР-дуплекс, описанный в примере Ж (0,5 мкг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНКлигазу (10 ед. акт.) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки Е. coli JM109. Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (3795 н.п.) рестриктазой Есо91l расщеплялась на фрагменты величиной 1895 и 1900 н.п. Ориентацию вставки проверяли методом ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды р26ао и 29rau. Первичную структуру полученной плазмиды рВ3 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.K. 3. The reaction mixture (50 μl) of plasmid PB2 (0.5 μg) with the restriction endonuclease Eco911 (10 units) was incubated in buffer P for 1 h at 37 ° C, extracted with an equal volume of phenol / chloroform mixture (1: 1), then with an equal volume of a mixture of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, and dissolved in TE buffer. The reaction mixture (10 μl) containing the Eco91l digested restriction endonuclease plasmid pB2 (0.1 μg), the PCR duplex described in Example G (0.5 μg), ATP (1 mM) and T4 DNA ligase (10 units act .) in E. coli JM109 competent cells were transformed in buffer L after incubation at room temperature (2 h). Clones were selected whose plasmid DNA (3795 bp) was digested with restriction enzyme Eco91l into fragments of 1895 and 1900 bp. The orientation of the insert was checked by PCR using p26ao and 29rau oligonucleotides as primers. The primary structure of the obtained plasmid pB3 was confirmed by sequencing with the Sanger dideoxymethod.
К. 4. Реакционную смесь (50 мкл) плазмиды рВ3 (0,5 мкг) с эндонуклеазой рестрикции Хhоl (10 ед.акт.) в буфере Р инкубировали 1 ч при 37oС, экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, и растворяли в буфере ТЕ. Реакционной смесью (10 мкл), содержащей расщепленную эндонуклеазой рестрикции Хhol плазмиду рВ3 (0,1 мкг), ПЦР-дуплекс, описанный в примере Е (0,5 мкг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед.акт. ) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки Е.Coli JM109. Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (6016 н.п.) рестриктазой Хhol расщеплялась на фрагменты величиной 2221 и 3795 н. п. Ориентацию вставки проверяли методом ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды 24ral и р18rao. Первичную структуру полученной плазмиды рВ4 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.K. 4. The reaction mixture (50 μl) of plasmid pB3 (0.5 μg) with Xhol restriction endonuclease (10 units) was incubated in buffer P for 1 h at 37 ° C, extracted with an equal volume of phenol / chloroform mixture (1: 1), then with an equal volume of a mixture of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, and dissolved in TE buffer. The reaction mixture (10 μl) containing the xhol restriction endonuclease digested plasmid pB3 (0.1 μg), the PCR duplex described in Example E (0.5 μg), ATP (1 mM) and T4 DNA ligase (10 units) .act.) in E. coli JM109 competent cells were transformed in buffer L after incubation at room temperature (2 h). Clones were selected whose plasmid DNA (6016 n.p.) was digested with restriction enzyme Xhol into fragments of 2221 and 3795 N. n. The orientation of the insert was checked by PCR using 24ral and p18rao oligonucleotides as primers. The primary structure of the obtained plasmid pB4 was confirmed by sequencing with the Sanger dideoxymethod.
К. 5. Реакционную смесь (50 мкл) плазмиды рВ4 (0,5 мкг) с эндонуклеазой рестрикции ВamНl (10 ед.акт.) в буфере Р инкубировали 1 ч при 37oС, экстрагировали равным объемом смеси фенол/хлороформ (1:1), затем равным объемом смеси хлороформ/ изоамиловый спирт (24:1) и осаждали содержащуюся в ней ДНК двумя объемами этанола. Осадок промывали 80%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, и растворяли в буфере ТЕ. Реакционной смесью (10 мкл), содержащей расщепленную эндонуклеазой рестрикции BamHl плазмиду рВ4 (0,1 мкг), ПЦР-дуплекс, описанный в примере (0,5 мкг), АТР (1 мМ) и Т4-ДНК-лигазу (10 ед. акт.) в буфере L после инкубации при комнатной температуре (2 ч) трансформировали компетентные клетки E. coli JM109. Отбирали клоны, плазмидная ДНК которых (7067 н.п.) рестриктазой ВamHl расщеплялась на фрагменты величиной 1051 и 6016 н.п. Ориентацию вставки проверяли методом ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды 22ар и 24 rat. Первичную структуру полученной плазмиды рDES20 подтверждали секвенированием дидезоксиметодом Сэнгера.K. 5. The reaction mixture (50 μl) of plasmid pB4 (0.5 μg) with BamHl restriction endonuclease (10 units) was incubated in buffer P for 1 h at 37 ° C, extracted with an equal volume of phenol / chloroform mixture (1: 1), then with an equal volume of a mixture of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) and the DNA contained in it was precipitated with two volumes of ethanol. The precipitate was washed with 80% ethanol, dried in air, and dissolved in TE buffer. The reaction mixture (10 μl) containing the BamHl restriction endonuclease digested plasmid pB4 (0.1 μg), the PCR duplex described in the example (0.5 μg), ATP (1 mmol) and T4 DNA ligase (10 units). act.) in buffer L, after incubation at room temperature (2 h), competent E. coli JM109 cells were transformed. Clones were selected whose plasmid DNA (7067 bp) was digested with restriction enzyme BamHl into fragments of 1051 and 6016 bp. The orientation of the insert was checked by PCR using oligonucleotides 22ap and 24 rat as primers. The primary structure of the obtained plasmid pDES20 was confirmed by sequencing with the Sanger dideoxymethod.
Пример 2. Получение штамма S.cerevisiae ДАН-041/рDES20 продуцента искусственного полипептида НВsAg/ayw. Example 2. Obtaining a strain of S. cerevisiae DAN-041 / pDES20 producer of the artificial HBsAg / ayw polypeptide.
Для получения продуцента полипептида НBsAg/mayw плазмидой рDES20 трансформировали дрожжи S. cerevisiae штамма YPH501 (Stratagene). Клетки свежей культуры S.cerevisiae YPH501 (100 мл, А600 0,4) дважды центрифугировали при 2500g с ресуспендированием в буфере ТЕ, суспендировали клетки в 1,5 мл буфера ТЕ с 0,1 М LiCl и выдерживали полученную суспензию 3 ч при 4oС. К 0,2 мл выдержанной суспензии добавляли 6 мкл буфера ТЕ, содержащего 15 мкг ДНК плазмиды рDES20, выдерживали смесь при комнатной температуре 30 мин, добавляли при тщательном перемешивании 1,5 мл стерильного 40%-ного раствора ПЭГ4000 в буфере ТЕ, выдерживали смесь при комнатной температуре еще 1 ч, прогревали суспензию 5 мин при 42oС, отделяли клетки центрифугированием (2500g), дважды промывали осадок стерильной водой (суспендирование пипетированием + центрифугирование), ресуспендировали трансформированные клетки в 100 мкл стерильной воды и высевали их на (leu-) агар. Клоны с (leu-)-агара тестировали на способность продуцировать полипептид НВsAg/mayw с помощью стандартных РПГ- и ИФ-анализов.To obtain the producer of the HBsAg / mayw polypeptide, the yeast S. cerevisiae strain YPH501 (Stratagene) was transformed with plasmid pDES20. Fresh S.cerevisiae YPH501 culture cells (100 ml, A 600 0.4) were centrifuged twice at 2500 g with resuspension in TE buffer, cells were suspended in 1.5 ml TE buffer with 0.1 M LiCl, and the resulting suspension was kept for 3 hours at 4 o C. To 0.2 ml of aged suspension was added 6 μl of TE buffer containing 15 μg of DNA of plasmid pDES20, the mixture was kept at room temperature for 30 minutes, 1.5 ml of a sterile 40% PEG4000 solution in TE buffer was added with thorough stirring, the mixture was kept at room temperature for another 1 h, the suspension was heated for 5 min at 42 o C, the cells were separated by centrifugation (2500g), the pellet was washed twice with sterile water (suspension by pipetting + centrifugation), the transformed cells were resuspended in 100 μl of sterile water, and they were seeded on (leu - ) agar. Clones with (leu - ) agar were tested for their ability to produce HBsAg / mayw polypeptide using standard RPG and IF assays.
Пример 3. Микробиологическое получение полипептида HBsAg/ayw. Свежую культуру (1 л) штамма S.cerevisiae ДАН-041/рDES20, выращенную на минимальной среде до титра 4х107 клеток/мл, соблюдая стерильность, вносят в ферментер с 9 л стерильной богатой питательной среды, содержащей, мас. пептон из кислого гидролизата казеина (неорганический фосфор 0,5-0,6 мг/г) 3,0; дрожжевой экстракт (неорганический фосфор 2,0-2,5 мг/г) 1,0; глюкоза 2,0; КСl 0,1; NaCl 0,01; СаСl2 (безводный) 0,02; MgSO4•7H2O 0,1; (NH4)2SO4 0,5; раствор микроэлементов (Кl 20 мг% Н3ВО3 2 мг% MnSO4 2 мг% (NH4)2MoO4 2 мг% FeSO4 10 мг%) 0,50 мл/л; раствор витаминов (тиамин хлорид 20 мг% пиридоксин 20 мг% рибофлавин (мононуклеотид) 20 мг% пантотенат кальция 20 мг% никотиновая кислота 20 мг% п-аминобензойная кислота 20 мг% биотин 0,2 мг% инозитол 1000 мг%) 1 мл/л; дистиллированная вода остальное; рН 5,8-6,0 с содержанием неорганического фосфора 40-42 мг/л и культивируют 20 ч при 30oС.Example 3. Microbiological preparation of the HBsAg / ayw polypeptide. Fresh culture (1 l) of strain S.cerevisiae DAN-041 / pDES20, grown on minimal medium to a titer of 4x10 7 cells / ml, observing sterility, is introduced into the fermenter with 9 l of sterile rich nutrient medium containing, by weight. peptone from acidic casein hydrolyzate (inorganic phosphorus 0.5-0.6 mg / g) 3.0; yeast extract (inorganic phosphorus 2.0-2.5 mg / g) 1.0; glucose 2.0; KCl 0.1; NaCl 0.01; CaCl 2 (anhydrous) 0.02; MgSO 4 • 7H 2 O 0.1; (NH 4 ) 2 SO 4 0.5; trace element solution (Cl 20 mg% H 3 BO 3 2 mg% MnSO 4 2 mg% (NH 4 ) 2 MoO 4 2 mg% FeSO 4 10 mg%) 0.50 ml / l; vitamin solution (thiamine chloride 20 mg% pyridoxine 20 mg% riboflavin (mononucleotide) 20 mg% calcium pantothenate 20 mg% nicotinic acid 20 mg% p-aminobenzoic acid 20 mg% biotin 0.2 mg% inositol 1000 mg%) 1 ml / l; distilled water the rest; pH 5.8-6.0 with an inorganic phosphorus content of 40-42 mg / l and cultivated for 20 hours at 30 o C.
Полученную накопительную культуру (10 л) с титром 2х108 клеток/мл, соблюдая стерильность,переносят в ферментер с 90 л новой стерильной питательной среды, cодержащей, мас. пептон из кислого гидролизата казеина (неорганический фосфор 0,5-0,6 мг/г) 1,5; дрожжевой экстракт (неорганический фосфор 2,0-2,5 мг/г) 0,1; глюкоза 2,0; КСl 0,1; NaCL 0,01; СаСL2 (безводный) 0,02; MgSO4•7H2O 0,1; (NH4)2SO4 0,5; раствор микроэлементов (Кl 20 мг% H3BO3 2 мг% MnSO4 2 мг% (NH4)2MoO4 2 мг% FeSO4 10 мг%) 0,50 мл/л; раствор витаминов тиамин хлорид 20 мг% пиридоксин 20 мг% рибофлавин (мононуклеотид) 20 мг% пантотенат кальция 20 мг% никотиновая кислота 20 мг% п-амино-бензойная кислота 20 мг% биотин 0,2 мг% инозитол 1000 мг%) 1 мл/л; дистиллированная вода остальное; рН 5,8-6,0 с содержанием неорганического фосфора 5,0-6,0 мг/л и культивируют 22 ч при 30oС.The resulting accumulative culture (10 L) with a titer of 2x10 8 cells / ml, observing sterility, is transferred to the fermenter with 90 L of a new sterile nutrient medium containing, by weight. peptone from acidic casein hydrolyzate (inorganic phosphorus 0.5-0.6 mg / g) 1.5; yeast extract (inorganic phosphorus 2.0-2.5 mg / g) 0.1; glucose 2.0; KCl 0.1; NaCL 0.01; CaCl 2 (anhydrous) 0.02; MgSO 4 • 7H 2 O 0.1; (NH 4 ) 2 SO 4 0.5; trace element solution (Cl 20 mg% H 3 BO 3 2 mg% MnSO 4 2 mg% (NH 4 ) 2 MoO 4 2 mg% FeSO 4 10 mg%) 0.50 ml / l; vitamin solution thiamine chloride 20 mg% pyridoxine 20 mg% riboflavin (mononucleotide) 20 mg% calcium pantothenate 20 mg% nicotinic acid 20 mg% p-amino benzoic acid 20 mg% biotin 0.2 mg% inositol 1000 mg%) 1 ml / l; distilled water the rest; pH 5.8-6.0 with an inorganic phosphorus content of 5.0-6.0 mg / l and cultivated for 22 hours at 30 o C.
Клеточную массу отделяют центрифугированием на препаративном проточном роторе (Beckman) и освобождают от остатков культуральной жидкости трехкратной промывкой буфером К (0,05 M Na2CO3/NaHCO3 (рН 9,0), 0,15 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторид, 0,3 мас. твин-20) с последующим центрифугированием. Подготовленные таким образом 1,2 кг биомассы суспендируют в 10 л буфера К и разрушают дрожжевые клетки на гомогенизаторе Gaulin APV (или аналогичном) при давлении 600-700 атм. (3 цикла), получая 15 л осветленного гомогенизата.The cell mass is separated by centrifugation on a preparative flow rotor (Beckman) and freed from the residues of the culture fluid by washing three times with buffer K (0.05 M Na 2 CO 3 / NaHCO 3 (pH 9.0), 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.3 wt. Tween-20), followed by centrifugation. Thus prepared 1.2 kg of biomass are suspended in 10 l of buffer K and destroy the yeast cells on a Gaulin APV homogenizer (or the like) at a pressure of 600-700 atm. (3 cycles), obtaining 15 L of clarified homogenizate.
Содержание в гомогенизате целевого полипептида НВsAg/ayw определяют стандартным ИФ-анализом, с помощью любых коммерчески доступных наборов для ИФ-анализа на НВsAg вируса гепатита В. The content in the homogenizate of the target HBsAg / ayw polypeptide is determined by standard IF analysis using any commercially available hepatitis B virus IF analysis kits for HBsAg.
Титр полипептида НВsAg/ayw в осветленном гомогенизате 34 мкг/мл, выход - 510 мг или 5,1 мг с одного литра культуральной жидкости. The titer of the HBsAg / ayw polypeptide in the clarified homogenizate is 34 μg / ml, the yield is 510 mg or 5.1 mg per liter of culture fluid.
Антигенную активность измеряют в мкг/мл, используя в качестве стандарта отраслевой стандартный образец активности НВsAg (ОСО 42-28-153-88), выпускаемый ГИСК им Л.А.Тарасевича и откалиброванный по международному стандарту активности. Antigenic activity is measured in μg / ml using the industry standard HBsAg activity standard (OSO 42-28-153-88), manufactured by GISK named after L.A. Tarasevich and calibrated according to the international activity standard.
На электрофореграммах в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях рекомбинантный антиген представлен в виде полосы мономера 24 кD. Иммуноспецифичность этой полосы показана методом иммуноблоттинга с использованием коммерческих анти-НВs, меченых йодом 125. On electrophoregrams in a polyacrylamide gel under reducing conditions, the recombinant antigen is presented as a 24 kD monomer band. The immunospecificity of this band is shown by immunoblotting using commercial anti-HBs labeled with iodine 125.
Пример 4. Получение вакцины против гепатита В. Example 4. Obtaining a vaccine against hepatitis B.
Рекомбинантный поверхностный антиген НВsAg/ayw, полученный по примеру 3, очищают способом, описанным в авторском свидетельстве SU, 1389060, A 61 K 39/29. The recombinant surface antigen HBsAg / ayw obtained in example 3 is purified by the method described in the copyright certificate SU, 1389060, A 61 K 39/29.
Из очищенного полипептида НВsAg/ayw готовят композицию, содержащую в 1 мл (одна прививочная доза) 20 мкг НВsAg, 0,5 мг геля гидроокиси алюминия (в пересчете на Аl ) в буфере ПБС (50 mM Na-фосфатный буфер, рН 6,8 + 0,13 М NaCl) с 0,005%-ным мертиолятом натрия. From the purified HBsAg / ayw polypeptide, a composition is prepared containing in 1 ml (one inoculation dose) 20 μg HBsAg, 0.5 mg of aluminum hydroxide gel (in terms of Al) in PBS buffer (50 mM Na-phosphate buffer, pH 6.8 + 0.13 M NaCl) with 0.005% sodium merthiolate.
Иммуногенность вакцины в тесте на мышах линии Ваlb/c c массой 12-14 г составляет 0,2-0,25 мкг в расчете на ЕD 50 (доза вакцины, вызывающая сероконверсию у 50% мышей). The immunogenicity of the vaccine in the test on Balb / c mice weighing 12-14 g is 0.2-0.25 μg per ED 50 (the dose of the vaccine that causes seroconversion in 50% of mice).
В испытаниях на волонтерах полученная вакцина по сравнению с известными обнаруживает наиболее высокие иммуногенные свойства на фоне самого низкого побочного реактогенного эффекта. In tests on volunteers, the vaccine obtained in comparison with the known ones shows the highest immunogenic properties against the background of the lowest side reactogenic effect.
Claims (3)
при этом область стыковки РН05-промотора и гена полипептида HBsAg/ayw имеет первичную структуру
AAAAAAAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGAGATTACCA,
а область стыковки гена полипептида HBsAg/ayw и РН05-терминатора имеет первичную структуру
TAATGATAGCTAAGTAGGATCC.1. Recombinant plasmid DNA pDES 20 encoding the surface antigen of hepatitis B virus (HBsAg / ayw), mol. m. 4.53 MDa and a size of 7067 n.p. containing the following structural elements: CoLEI bacterial origin of replication, size 0.62 so-called the bacterial operon of β-lactamase 1.05 t.p. a fragment of natural yeast 2μ-plasmid, providing autonomous replication of pDES20 in Saccharomyces cerevisiae, size 1.89 so-called Leu 2 yeast operon 2.21 tp HBsAg / ayw yeast operon with a promoter of 0.35 bp terminator with a size of 0.18 t.p. the yeast gene PH05 and the synthetic gene of the HBsAg / ayw polypeptide, the primary structure of which is made taking into account the frequency of codon use in S. cerevisiae:
the docking region of the PH05 promoter and the HBsAg / ayw polypeptide gene has a primary structure
AAAAAAAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGAGATTACCA,
and the docking area of the HBsAg / ayw polypeptide gene and the PH05 terminator has a primary structure
TAATGATAGCTAAGTAGGATCC.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96101565A RU2088664C1 (en) | 1996-01-26 | 1996-01-26 | Recombinant plasmid dna pdes 20 encoding the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw), the yeast strain saccharomyces cerevisiae containing the recombinant plasmid dna pdes 20 - a producer of the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96101565A RU2088664C1 (en) | 1996-01-26 | 1996-01-26 | Recombinant plasmid dna pdes 20 encoding the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw), the yeast strain saccharomyces cerevisiae containing the recombinant plasmid dna pdes 20 - a producer of the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2088664C1 true RU2088664C1 (en) | 1997-08-27 |
| RU96101565A RU96101565A (en) | 1998-01-10 |
Family
ID=20176195
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96101565A RU2088664C1 (en) | 1996-01-26 | 1996-01-26 | Recombinant plasmid dna pdes 20 encoding the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw), the yeast strain saccharomyces cerevisiae containing the recombinant plasmid dna pdes 20 - a producer of the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2088664C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000007623A1 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-17 | Aktsionernoe Obschestvo Zakrytogo Tipa Nauchno-Proizvodstvennaya Kompaniya 'combiotech Ltd.' | Combined vaccine for immunoprophylaxis against viral hepatitis b and d, tetanus, diphtheria and pertussis |
| RU2442825C2 (en) * | 2005-04-18 | 2012-02-20 | Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Инк. | Immunogenic compositions, methods for their production and plasmid included in such compositions |
| RU2586511C1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-06-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN SEROTYPE "ayw" |
-
1996
- 1996-01-26 RU RU96101565A patent/RU2088664C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Патент США N 4778761, кл. C 12 N 15/00, 1988. 2. Заявка РСТ N 9312815, кл. A 61 K 39/29, 1993. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000007623A1 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-17 | Aktsionernoe Obschestvo Zakrytogo Tipa Nauchno-Proizvodstvennaya Kompaniya 'combiotech Ltd.' | Combined vaccine for immunoprophylaxis against viral hepatitis b and d, tetanus, diphtheria and pertussis |
| RU2442825C2 (en) * | 2005-04-18 | 2012-02-20 | Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Инк. | Immunogenic compositions, methods for their production and plasmid included in such compositions |
| RU2586511C1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-06-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | RECOMBINANT Hansenula polymorpha YEAST STRAIN - PRODUCER OF HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN SEROTYPE "ayw" |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0013828B1 (en) | Recombinant DNA, hosts transformed with it and processes for the preparation of polypeptides | |
| DK2670846T3 (en) | METHODS FOR THE DEVELOPMENT OF TERPEN SYNTHASE VARIETIES | |
| JPH07108221B2 (en) | Rennin production method | |
| CN86102277A (en) | Cloning restriction gene and modification property gene | |
| JP2004500839A (en) | Nutritional conversion of obligate phototrophic algae through metabolic genetic manipulation | |
| KR20220097391A (en) | Development of a novel live attenuated African swine fever vaccine based on the deletion of gene I177L | |
| JPH07163354A (en) | Dna fragment containing function gene | |
| SU1387878A3 (en) | Method of producing protein of surface antigen of hepatitis b virus | |
| KR20230111189A (en) | Reprogrammable ISCB nuclease and uses thereof | |
| CN113388587B (en) | Recombinant bovine nodavirus expressing bovine viral diarrhea E2 gene and application thereof | |
| MXPA01010273A (en) | Novel recombinant and mutant herpesviruses. | |
| EP0182442B1 (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
| JPH0787788B2 (en) | DNA compound encoding isopenicillin N synthase and recombinant DNA expression vector | |
| RU2088664C1 (en) | Recombinant plasmid dna pdes 20 encoding the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw), the yeast strain saccharomyces cerevisiae containing the recombinant plasmid dna pdes 20 - a producer of the surface antigen of hepatitis b virus (hbsag/ayw) | |
| CN110938614A (en) | High-activity β -galactosidase, plasmid for high-throughput screening of same and preparation method thereof | |
| CN114672447B (en) | Bacterial strain with self-flocculation capability and preparation method and application thereof | |
| CN112522125A (en) | Hyaluronidase engineering bacterium and construction method and application thereof | |
| US4859465A (en) | Vaccine capable of eliciting multivalent antibodies | |
| CN1882692B (en) | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker | |
| CN105755035B (en) | A kind of building of Hansenula yeast specific expression vector and hepatitis B virus surface antigen is being improved in the method for expressed by Hansenula yeast amount | |
| CN107012170A (en) | The structure and rescue method of a kind of Muscovy duck parvovirus infection clones | |
| CN116670153A (en) | Genomic deletion of african swine fever vaccines allowing efficient growth in stable cell lines | |
| US6297355B1 (en) | Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity | |
| EP0251460B1 (en) | Method for producing hepatitis b virus core antigen (hbcag) in yeast | |
| RU2207374C1 (en) | Recombinant plasmid encoding hepatitis b virus surface antigen (hbsag), its preparing and yeast strain hansenula polymorpha as producer of hepatitis b virus surface antigen (hbsag) |