RU2590704C2 - ГЕН PDGF-Bopt ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
ГЕН PDGF-Bopt ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2590704C2 RU2590704C2 RU2014134753/10A RU2014134753A RU2590704C2 RU 2590704 C2 RU2590704 C2 RU 2590704C2 RU 2014134753/10 A RU2014134753/10 A RU 2014134753/10A RU 2014134753 A RU2014134753 A RU 2014134753A RU 2590704 C2 RU2590704 C2 RU 2590704C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pdgf
- growth factor
- gene
- bopt
- platelet growth
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к технологии получения генно-инженерных конструкций для экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих, и может быть использовано для рекомбинантной продукции тромбоцитарного фактора роста человека. Для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих оптимизирован ген тромбоцитарного фактора роста человека (PDGF-B), последовательность нуклеотидов которого представлена на фиг. 1. 3 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, технологии получения генно-инженерных конструкций для экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих in vitro и in vivo с целью их применения в клеточной инженерии и в генной терапии. Изобретение представляет собой модифицированную последовательность гена В-полипептидной цепи тромбоцитарного фактора роста (PDGF-B) человека, включаемого в состав генно-инженерных векторов в качестве одного из фрагментов.
Тромбоцитарные факторы роста представляют собой группу ростовых факторов, играющих важную роль в эмбриогенезе, а также в процессах репарации и регенерации поврежденных тканей. Они стимулируют пролиферативную и миграционную активность мезенхимальных клеток, являются кофактором других ростовых факторов, стимулируют секреторную активность клеток, продукцию ими белков внеклеточного матрикса, таких как фибронектин, коллаген, протеогликаны. Эти свойства делают тромбоцитарные факторы роста привлекательными для использования в различных биотехнологиях, в том числе генной и клеточной терапии, при производстве биотрансплантатов.
Тромбоцитарные факторы роста являются димерами, состоящими из полипептидных цепей, связанных дисульфидными связями. Существуют четыре гена PDGF, кодирующие PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C и PDGF-D полипептидные цепи (Linda Fredriksson, Hong Li, Ulf Eriksson. Cytokine & Growth Factor Reviews 15 (2004) 197-204). PDGF-B экспрессируется в эндотелиальных клетках, мегакариоцитах и нейронах (Hellström M, Kalén M, Lindahl Ρ, Abramsson A, Betsholtz С. Development 1999; 126:3047-55). Он является одним из важнейших факторов ангиогенеза. PDGF-BB стимулирует миграцию перицитов и гладкомышечных клеток в места образования новых сосудов и тем самым способствует стабилизации вновь сформированных капилляров (Banfi A. von Degenfeld G. Gianni-Barrera R. Rednato S. Merchant MJ. McDonald DM. Blau HM. FASEB J. 2012 Jun; 26(6):2486-97; Gaengel K., Genové G., Armulik Α., Betsholtz С. (2009) Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 29, 630-638).
Перспективы генной терапии в лечении заболеваний, связанных с нарушением кровоснабжения, продемонстрированы как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях (Ylä-Herttuala S., Rissanen Т.Т., Vajanto I., Hartikainen J.J. Am. Coll. Cardiol., 2007, vol. 49, pp. 1015-1026; Banfi A. von Degenfeld G. Gianni-Barrera R. Reeinato S. Merchant MJ, McDonald DM. Blau HM. FASEB J. 2012 Jun; 26(6):2486-97).
Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является создание модифицированной последовательности гена PDGF-B, которая при ее включении в состав генно-инженерного вектора позволяла бы достичь более высокого уровня экспрессии соответствующего белка в клетках, трансфицированных данным вектором.
Технический результат достигался модификацией природной последовательности гена PDGF-B, в основе которой лежала вырожденность генетического кода. Последовательность модифицировали таким образом, чтобы триплеты нуклеотидов, кодирующие некоторые из аминокислот белковой последовательности тромбоцитарного фактора роста, встречались в генах человека наиболее часто. При этом использовали опубликованные в открытых источниках данные по частотам встречаемости кодонов (http://www.kazusa.or.jp/codon/).
На Фиг. 1 представлена последовательность нуклеотидов гена PDGF-Bopt (средние строки) в сравнении с последовательностью нуклеотидов природного гена PDGF-B (верхние строки). Показана также последовательность аминокислот кодируемого белкового продукта - тромбоцитарного фактора роста человека (нижние строки). Серым фоном в последовательности гена PDGF-Bopt выделены триплеты нуклеотидов, отличные от таковых в природной последовательности.
На Фиг. 2 приведена функциональная карта плазмиды pVAX1-PDGF-Bopt.
На Фиг. 3 представлены результаты количественного определения белка PDGF-BB человека в среде культивирования клеток линии НЕК293-Т, трансфицированных плазмидами pVAX1, pVAX1-PDGF-B, pVAX1-PDGF-Bopt.
Синтез оптимизированного гена PDGF-Bopt и конструирование плазмиды осуществляли с помощью стандартной технологии и оборудования, применяемых для решения подобных задач в генной инженерии (Watson J.D., Gilman M., Witkowski J., Zoller M. - Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992).
Дизайн оптимизированной последовательности нуклеотидов, кодирующей тромбоцитарный фактор роста человека, проводили на основе базы данных частоты встречаемости кодонов у разных организмов, доступной на вэб-сайте http://www.kazusa.or.jp/codon/. Среди триплетов нуклеотидов, кодирующих аминокислоты белковой последовательности природного гена PDGF-B, выявляли такие, которые редко встречаются в генах человека. Выявленные редкие триплеты, а также соседние с ними триплеты заменяли на триплеты, кодирующие ту же аминокислоту, но при этом встречающиеся в генах человека наиболее часто. Благодаря вырожденности генетического кода все аминокислоты природного гена тромбоцитарного фактора роста человека остались неизмененными. Полученная последовательность нуклеотидов представлена на Фиг. 1.
Плазмиду, несущую оптимизированный ген PDGF-Bopt, получали методом генно-инженерного конструирования, как описано ниже на примере плазмиды pVAX1-PDGF-Bopt.
Химически синтезировали следующие олигонуклеотиды:
Смешивали их (по 2 мкМ каждого) в лигазном буфере и кинировали. После инактивации киназы полученную смесь (смесь 1) смешивали с равным объемом смеси 2, представляющей собой следующие синтезированные олигонуклеотиды (также по 2 мкМ) в лигазном буфере:
Прогревали на 95°С в течение 1 мин и давали медленно остыть до комнатной температуры для медленного отжига олигонуклеотидов. Далее полученную смесь разводили в 5 раз 1х лигазным буфером и ставили реакцию лигирования на ночь. На следующий день лигазную смесь разводили в 5 раз и подвергали ее ПЦР со следующими концевыми праймерами:
Разделение и идентификацию продуктов реакции осуществляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Далее вырезали из геля основную полосу, соответствующую целевому продукту реакции, проводили экстракцию ДНК и клонировали ее в коммерчески доступную плазмиду pVAX1, расщепленную рестриктазами EcoR1 и EcoRV, с получением плазмиды pVAX1-PDGF-Bopt. Встраивание последовательности оптимизированного PDGF-B и ее идентичность подтверждали рестриктным анализом и секвенированием.
Эффективность заявляемого изобретения иллюстрируется следующим примером.
Пример. Клетки НЕК293Т, культивируемые в 6-луночной плашке в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали плазмидой pVAX1-PDGF-Bopt, несущей оптимизированный ген тромбоцитарного фактора роста человека (PDGF-Bopt), или контрольными плазмидами pVAX1-PDGF-B (кодирует природный ген тромбоцитарного фактора роста человека) и pVAX1 (пустая плазмида). Для трансфекции клеток в одной лунке плашки брали 2,5 мкг ДНК и 7,5 мкл реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen), процедуру проводили в соответствии с протоколом производителя. Через 24 ч после трансфекции культуральную среду заменяли на свежую и инкубировали клетки в течение 48 часов. Концентрацию гомодимера тромбоцитарного фактора роста человека В (PDGF-BB) в среде культивирования клеток определяли методом иммуноферментного анализа с использованием набора реагентов Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) в соответствии с протоколом производителя.
Результаты измерений представлены на Фиг. 3, где отражена средняя концентрация гомодимера тромбоцитарного фактора роста ВВ (PDGF-BB) в среде культивирования клеток линии НЕК293Т, трансфицированных плазмидой pVAX1, pVAX1-PDGF-B или плазмидой pVAX1-PDGF-Bopt.
Иммуноферментный анализ показал, что в условиях эксперимента концентрация PDGF-BB в среде культивирования клеток, трансфицированных вектором с оптимизированной последовательностью гена PDGF, составляла 1129±233,3 нг/мл, что в 4,01 раза выше, чем в группе «pVAX1-PDGF-B» (281,4±34,8 нг/мл). Концентрация белка в группе «pVAX1» была ниже порога чувствительности метода.
Claims (1)
- Ген тромбоцитарного фактора роста человека, оптимизированный для экспрессии в клетках млекопитающих, который представлен последовательностью нуклеотидов, приведенной на Фиг. 1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014134753/10A RU2590704C2 (ru) | 2014-08-26 | 2014-08-26 | ГЕН PDGF-Bopt ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014134753/10A RU2590704C2 (ru) | 2014-08-26 | 2014-08-26 | ГЕН PDGF-Bopt ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014134753A RU2014134753A (ru) | 2016-03-20 |
RU2590704C2 true RU2590704C2 (ru) | 2016-07-10 |
Family
ID=55530702
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014134753/10A RU2590704C2 (ru) | 2014-08-26 | 2014-08-26 | ГЕН PDGF-Bopt ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2590704C2 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2290434C1 (ru) * | 2005-06-02 | 2006-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" | Штамм дрожжей pichia pastoris 2-2 - продуцент тромбоцитарного фактора роста человека (pdgf-bb) и способ получения тромбоцитарного фактора роста человека |
-
2014
- 2014-08-26 RU RU2014134753/10A patent/RU2590704C2/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2290434C1 (ru) * | 2005-06-02 | 2006-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" | Штамм дрожжей pichia pastoris 2-2 - продуцент тромбоцитарного фактора роста человека (pdgf-bb) и способ получения тромбоцитарного фактора роста человека |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
База данных Dbfetch последовательность AAX41514, размещена 24.03.2005. PLEMONS J.M. ET AL., PDGF-B producing cells and PDGF-B gene expression in normal gingival and cyclosporine A-induced gingival overgrowth, J. Periodontol., 1996, v.67, n.3, p.264-270. . * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2014134753A (ru) | 2016-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7022878B2 (ja) | 細胞リプログラミング | |
PH12020551039A1 (en) | Non-viral dna vectors and uses thereof for antibody and fusion protein production | |
PT101031B (pt) | Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica | |
ES2824479T3 (es) | Polipéptido FGF2 termoestable, utilización del mismo | |
JPWO2018110471A1 (ja) | 転写調節融合ポリペプチド | |
RU2009130108A (ru) | Секретируемая люцифераза mluc7 и ее применение | |
Beutler et al. | Hybridization of glucose-6-phosphate dehydrogenase from rat and human erythrocytes | |
Gong et al. | Stable transfection into rat bone marrow mesenchymal stem cells by lentivirus‑mediated NT‑3 | |
Voß et al. | Production of supercoiled multimeric plasmid DNA for biopharmaceutical application | |
KR102428606B1 (ko) | 향상된 유전자 전달 방법 | |
CN110121555B (zh) | 包含工程化内皮细胞的血脑屏障 | |
KR101928488B1 (ko) | 페록시다신을 포함하는 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 이의 이용 | |
RU2590704C2 (ru) | ГЕН PDGF-Bopt ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА | |
CA2659418C (en) | Identification and selection of stem cells being committed to differentiate to a specific type for obtaining a homogeneous population of stem cells | |
RU2606014C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Escherichia coli, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток | |
CN115287289A (zh) | 一种新型冠状病毒s蛋白受体结合域蛋白的真核表达方法 | |
US20230414665A1 (en) | Method for producing modified mesenchymal stromal stem cells with improved properties, modified cells obtained by this method, composition including such cells | |
Kamensek et al. | Maintenance and gene electrotransfer efficiency of antibiotic resistance gene-free plasmids encoding mouse, canine and human interleukin-12 orthologues | |
CA2752947A1 (en) | Foxp1 splice variants and methods and uses thereof | |
KR20180007918A (ko) | 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 | |
CN105859892A (zh) | 一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法 | |
Shcheglovitova et al. | Cow milk angiogenin induces cytokine production in human blood leukocytes | |
KR20130055313A (ko) | 고밀도 배양을 이용한 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법 | |
KR102147780B1 (ko) | Fgf-17을 유효 성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 증식 촉진 방법 | |
Deepa et al. | Transgenic expression and functional characterization of human platelet derived growth factor BB (hPDGF-BB) in tobacco (Nicotiana tabacum L.) |