RU2563540C2 - Method for obtaining recombinant protein sav-rgd, specifically recognising melanoma cells - Google Patents
Method for obtaining recombinant protein sav-rgd, specifically recognising melanoma cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2563540C2 RU2563540C2 RU2013142555/10A RU2013142555A RU2563540C2 RU 2563540 C2 RU2563540 C2 RU 2563540C2 RU 2013142555/10 A RU2013142555/10 A RU 2013142555/10A RU 2013142555 A RU2013142555 A RU 2013142555A RU 2563540 C2 RU2563540 C2 RU 2563540C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rgd
- sav
- protein
- recombinant protein
- cells
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техники.The field of technology.
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности и медицинской биотехнологии, и представляет собой способ препаративного получения рекомбинантного белка SAV-RGD, специфически узнающего клетки меланомы, с использованием штамма, принадлежащего к роду Escherichia.The present invention relates to the microbiological industry and medical biotechnology, and is a method for preparative production of recombinant protein SAV-RGD, specifically recognizing melanoma cells, using a strain belonging to the genus Escherichia.
Предшествующий уровень техники.The prior art.
Известно, что RGD-содержащие пептиды способны оказывать токсический эффект на клетки - связываясь с интегриновыми рецепторами на поверхности опухолевых клеток, они запускают внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к остановке роста, снижению пролиферации, и, как следствие, гибели клеток. Данный принцип положен в основу действия препарата Cilengitide производства Merck KGaA (Германия), представляющего собой циклический пептид RGDfV (Arg-Gly-Asp-(D-Phe)-Val). [Mas-Moruno С., Rechenmacher F., Kessler H. (2010) Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 10, 753-768.] Тем не менее, использование малых концентраций таких пептидов имеет обратный эффект, обусловленный кластеризацией рецепторов интегрина и активацией другого сигнального пути. Это создает дополнительные сложности при использовании препаратов, в состав которых входят RGD-содержащие пептиды, не несущий токсической части. Для устранения вышеописанного эффекта такие пептиды конъюгируют с токсическими агентами, либо располагают на поверхности нагруженных токсическим агентом наноструктур или липосом [Pattillo C.B. et al. (2005) Pharm. Res., 22, 1117-1120.; Dubey P.K. Mishra V., Jain S., Mahor S., Vyas S.P. (2004) J. Drug Target, 12, 257-264.], что является достаточно трудоемкой процедурой.It is known that RGD-containing peptides can have a toxic effect on cells - by binding to integrin receptors on the surface of tumor cells, they trigger intracellular signaling cascades leading to stunted growth, decreased proliferation, and, as a result, cell death. This principle underlies the action of the Cilengitide preparation manufactured by Merck KGaA (Germany), which is a cyclic peptide RGDfV (Arg-Gly-Asp- (D-Phe) -Val). [Mas-Moruno C., Rechenmacher F., Kessler H. (2010) Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 10, 753-768.] However, the use of low concentrations of such peptides has the opposite effect due to clustering of integrin and activation of another signaling pathway. This creates additional difficulties when using drugs that include RGD-containing peptides that do not carry the toxic part. To eliminate the above effect, such peptides are conjugated with toxic agents, or are located on the surface of nanostructures or liposomes loaded with a toxic agent [Pattillo C.B. et al. (2005) Pharm. Res., 22, 1117-1120 .; Dubey P.K. Mishra V., Jain S., Mahor S., Vyas S.P. (2004) J. Drug Target, 12, 257-264.], Which is a rather time-consuming procedure.
Для эффективного связывания с интегриновыми рецепторами на поверхности ме-ланомных клеток, белок должен содержать трипептид Arg-Gly-Asp (RGD) [Pierschbacher M.D. and Ruoslahti E. (1984) Nature, 309, 30-33.]. Однако связывать RGD-мотив способны несколько интегриновых рецепторов (это группа интегринов, содержащие субчастицу αv, а также интегрины α5β1, α8β1 αIIbβ3). Для обеспечения селективности важно окружение RGD-мотива. Варьируя последовательность аминокислотных остатков, окружающих RGD-мотив, была создана панель RGD-содержащих олигопептидов с различной тканевой специфичностью, обусловленной селективным взаимодействием с различными интегриновыми рецепторами. В ряду прочих, были получены RGD-содержащие олигопептиды, обладающие способностью селективно связываться с рецепторами на поверхности меланомных клеток и клеток эндотелия опухолевых сосудов человека и мыши (RGD10, RGD13, RGD15) [Holig P., Bach M., Volkel Т., Nahde Т., Hoffmann S., Muller R. and Kontermann R.E. (2004) Protein Eng. Des. Sel., 17, 433-441].For effective binding to integrin receptors on the surface of melanoma cells, the protein must contain the Arg-Gly-Asp tripeptide (RGD) [Pierschbacher M.D. and Ruoslahti E. (1984) Nature, 309, 30-33.]. However, several integrin receptors are capable of binding the RGD motif (this is a group of integrins containing the αv subparticle, as well as the integrins α5β1, α8β1 αIIbβ3). To ensure selectivity, the environment of the RGD motif is important. By varying the sequence of amino acid residues surrounding the RGD motif, a panel of RGD-containing oligopeptides was created with different tissue specificity due to selective interaction with various integrin receptors. Among other things, RGD-containing oligopeptides were obtained that have the ability to selectively bind to receptors on the surface of melanoma cells and endothelial cells of human and mouse tumor vessels (RGD10, RGD13, RGD15) [Holig P., Bach M., T. Volkel, Nahde T., Hoffmann S., Muller R. and Kontermann RE (2004) Protein Eng. Des. Sel., 17, 433-441].
Следует отметить, что, для эффективного связывания с рецептором трипептид RGD должен принимать изогнутую конформацию, которую стабилизируют либо посредством циклизации пептидной цепочки [Aumailey M., Gurrath M., Muller G., Calvete J., Timple R., Kessler H. (1991) FEBS Lett., 291, 50-54.; Gurrath M., Muller G., Kessler H., Aumailey M. Timple R. (1992) Eur. J. Biochem., 210, 911-921], либо путем образования дисульфидной связи между фланкирующими RGD-мотив остатками цистеина [Pierschbacher M.D. and Ruoslahti E. (1987) J. Biol. Chem., 262, 17924-17928.; Holig P., Bach M., Volkel Т., Nahde Т., Hoffmann S., Muller R. and Kontermann R.E. (2004) Protein Eng. Des. Sel., 17, 433-441].It should be noted that, for effective binding to the receptor, the RGD tripeptide must take a curved conformation, which is stabilized either by cyclization of the peptide chain [Aumailey M., Gurrath M., Muller G., Calvete J., Timple R., Kessler H. (1991 ) FEBS Lett., 291, 50-54 .; Gurrath M., Muller G., Kessler H., Aumailey M. Timple R. (1992) Eur. J. Biochem., 210, 911-921], or by the formation of a disulfide bond between flanking RGD motif cysteine residues [Pierschbacher M.D. and Ruoslahti E. (1987) J. Biol. Chem., 262, 17924-17928 .; Holig P., Bach M., Volkel T., Nahde T., Hoffmann S., Muller R. and Kontermann R.E. (2004) Protein Eng. Des. Sel., 17, 433-441].
Короткие пептиды, как правило, получают методом химического синтеза. Однако, при реализации данного способа возможна рацемизация аминокислотных остатков. Замена L-формы аминокислот на D-форму может приводить к образованию нефункциональных пептидов, в данном, случае - со сниженной аффинностью к рецептору [Han Y., Albericio F., Barany G. (1997), J Org Chem, 62, 4307-4312; Palasek S.A., Cox Z.J., Collins J.M. (2007) J. Peptide Sci, 13, 143-148].Short peptides are usually obtained by chemical synthesis. However, when implementing this method, racemization of amino acid residues is possible. Replacing the L-form of amino acids with the D-form can lead to the formation of non-functional peptides, in this case, with reduced affinity for the receptor [Han Y., Albericio F., Barany G. (1997), J Org Chem, 62, 4307- 4,312; Palasek S.A., Cox Z.J., Collins J.M. (2007) J. Peptide Sci, 13, 143-148].
Короткие RGD-пептиды имеют и другие недостатки помимо вышеперечисленных.Short RGD peptides have other disadvantages in addition to the above.
Изогнутая конформация трипептида RGD, обусловленная кольцевой структурой химически синтезируемых пептидов, подобных Cilengitide, может также поддерживаться за счет дисульфидной связи, образуемой между фланкирующими RGD-мотив остатками цистеина [Pierschbacher M.D. and Ruoslahti E. (1987) J. Biol. Chem., 262, 17924-17928.; Holig P., Bach M., Volkel Т., Nahde Т., Hoffmann S., Muller R. and Kontermann R.E. (2004) Protein Eng. Des. Sel., 17, 433-441]. Это предоставляет возможность для биотехнологического получения пептидов, исключающего саму возможность рацемизации. Тем не менее, основной проблемой, возникающей при наработке белков в клетках микроорганизмов, является деградация коротких молекул, осуществляемая протеолитическими ферментами в цитоплазме клетки. Небольшие пептиды, как правило, имеют малое время циркуляции в организме, что, наряду с пониженным сродством к рецептору, может вести к необходимости увеличения как количества применяемого препарата, так и частоты его введения. Эти процессы могут существенно снижать эффективность действия препарата.The bent conformation of the RGD tripeptide, due to the ring structure of chemically synthesized peptides like Cilengitide, can also be maintained by a disulfide bond formed between cysteine residues flanking the RGD motif [Pierschbacher M.D. and Ruoslahti E. (1987) J. Biol. Chem., 262, 17924-17928 .; Holig P., Bach M., Volkel T., Nahde T., Hoffmann S., Muller R. and Kontermann R.E. (2004) Protein Eng. Des. Sel., 17, 433-441]. This provides an opportunity for biotechnological production of peptides, eliminating the very possibility of racemization. However, the main problem that arises during the production of proteins in the cells of microorganisms is the degradation of short molecules by proteolytic enzymes in the cell cytoplasm. Small peptides, as a rule, have a short circulation time in the body, which, along with a reduced affinity for the receptor, can lead to the need to increase both the amount of the drug used and the frequency of its administration. These processes can significantly reduce the effectiveness of the drug.
Из уровня техники известна аминокислотная последовательность растворимого, экскретируемого в периплазму стрептавидина; нуклеотидная последовательность, кодирующая данный белок; создан вектор, в состав которого входит вышеупомянутая нуклеотидная последовательность, находящаяся под контролем сильного конститутивного промотора или промотора уридинфосфорилазы Е.coli (Rudp); штамм Е.coli, содержащий упомянутый вектор и являющийся продуцентом стрептавидина; а также способ получения данного полипептида в бактериальных клетках с использованием хроматографической очистки [патент РФ 2153535].In the prior art, the amino acid sequence of soluble streptavidin excreted in the periplasm is known; the nucleotide sequence encoding this protein; a vector has been created that includes the aforementioned nucleotide sequence under the control of a strong constitutive promoter or promoter of the E. coli uridine phosphorylase (Rudp); E. coli strain containing said vector and being a producer of streptavidin; and also a method for producing this polypeptide in bacterial cells using chromatographic purification [RF patent 2153535].
Кроме того, известна аминокислотная последовательность меланома-адресующих олигопептидов R10, R13 и R15 (упоминающихся в литературном источнике как RGD10, RGD13 и RGD15) [Holig P., Bach M., Volkel Т., Nahde Т., Hoffmann S., Muller R. and Kontermann R.E. (2004) Protein Eng. Des. Sel., 17, 433-441].In addition, the amino acid sequence of the melanoma-addressing oligopeptides R10, R13 and R15 (referred to in the literature as RGD10, RGD13 and RGD15) is known [Holig P., Bach M., Volkel T., Nahde T., Hoffmann S., Muller R . and Kontermann RE (2004) Protein Eng. Des. Sel., 17, 433-441].
Наконец, подробно описан и охарактеризован RGD-содержащий циклический пептид RGDfV, выпускаемый под торговой маркой Cilengitide компанией Merck KgaA (Германия) [Mas-Moruno С., Rechenmacher F., Kessler H. (2010) Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 10, 753-768].Finally, the RGD-containing cyclic peptide RGDfV described under the trademark Cilengitide by Merck KgaA (Germany) [Mas-Moruno C., Rechenmacher F., Kessler H. (2010) Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 10, is described and characterized in detail. , 753-768].
Включение олигопептида в состав тетрамеризующегося белка-носителя, стрептавидина, приводит к тому, что рекомбинантный слитый белок будет содержать в своем составе четыре интегрин-адресующих олигопептида. В результате взаимодействия такой структуры с рецептором на поверхности клетки происходит увеличение локальной концентрации RGD-мотивов вблизи данного рецептора, что повышает эффективность связывания. Литературные данные подтверждают повышенную эффективность связывания таких поливалентных структур по сравнению с моновалентными [патент РФ 2153535].The inclusion of an oligopeptide in the tetramerizing carrier protein streptavidin leads to the fact that the recombinant fusion protein will contain four integrin-addressing oligopeptides. As a result of the interaction of such a structure with a receptor on the cell surface, an increase in the local concentration of RGD motifs near this receptor occurs, which increases the binding efficiency. Literature data confirm the increased binding efficiency of such polyvalent structures as compared to monovalent ones [RF patent 2153535].
Помимо этого, стрептавидин способен с высоким сродством связывать остаток d-биотина (Kd=10-15). Учитывая тот факт, что каждая субъединица стрептавидина связывает 1 молекулу биотина, тетрамер способен связать 4 молекулы биотина, что может приводить к амплификации сигнала при использовании биотинилированного диагностического агента или усилению токсического эффекта при использовании биотинилированного терапевтического агента [Xia N., Liu L., Harrington M.G., Zhou F. (2010), Anal. Chem., 82, 10151-10157].In addition, streptavidin is able to bind the d-biotin residue with high affinity (Kd = 10-15). Given the fact that each streptavidin subunit binds 1 biotin molecule, the tetramer is able to bind 4 biotin molecules, which can lead to amplification of the signal when using a biotinylated diagnostic agent or to enhance the toxic effect when using a biotinylated therapeutic agent [Xia N., Liu L., Harrington MG, Zhou F. (2010), Anal. Chem., 82, 10151-10157].
Использование запатентованной экспрессионной системы, позволяющей в препаративных количествах нарабатывать рекомбинантный стрептавидин в периплазме Е.coli [патент РФ 2153535], обеспечивает локализацию химерного белка на основе стрептавидина в периплазматическом пространстве клетки, что позволяет не только ограничить его расщепление протеолитическими ферментами, присутствующими в цитоплазме, но и существенно упростить стадию выделения с использованием аффинной хроматографии.The use of a patented expression system that allows producing preparative quantities of recombinant streptavidin in the periplasm of E. coli [RF patent 2153535] provides localization of the chimeric protein based on streptavidin in the periplasmic space of the cell, which allows not only to limit its cleavage by proteolytic enzymes present in the cytoplasm, but and substantially simplify the isolation step using affinity chromatography.
Ранее авторы настоящего изобретения создали систему для экспрессии рекомбинантных слитых белков SAV-RGD, специфически узнающих меланомные клетки, в состав которых входит стрептавидин (S) и меланома-адресующий олигопептид (R), соединенный со стрептавидином посредством пептидного линкера, содержащего сайт расщепления энтеропептидазой; конструировали рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие гетерологичную экспрессию указанных слитых белков; а также получили штаммы бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, - продуценты указанных слитых белков. Указанные плазмидные ДНК обеспечивают экспрессию пробелка, содержащего лидерный пептид, обеспечивающий его секрецию в периплазматическое пространство клеток бактерий, где происходит отщепление лидерного пептида, и указанный белок SAV-RGD локализуется в биологически активном растворимом состоянии [Syrkina MS и др. Preparation and functional evaluation of RGD-modified streptavidin targeting to integrin-expressing melanoma cells. Protein Eng Des Sel. 2013 Feb; 26(2):143-50].Previously, the inventors of the present invention created a system for the expression of recombinant SAV-RGD fusion proteins that specifically recognize melanoma cells, which include streptavidin (S) and melanoma-addressing oligopeptide (R) linked to streptavidin via a peptide linker containing an enteropeptidase cleavage site; designed recombinant plasmid DNA, providing heterologous expression of these fusion proteins; and also received strains of bacteria belonging to the genus Escherichia, producers of these fusion proteins. These plasmid DNAs provide expression of a protein containing a leader peptide, which secrets it into the periplasmic space of bacterial cells where the leader peptide is cleaved, and the indicated SAV-RGD protein is localized in a biologically active soluble state [Syrkina MS et al. Preparation and functional evaluation of RGD -modified streptavidin targeting to integrin-expressing melanoma cells. Protein Eng Des Sel. 2013 Feb; 26 (2): 143-50].
Краткое описание настоящего изобретенияA brief description of the present invention
Целью настоящего изобретения является создание высокоэффективного и экономичного способа препаративного получения рекомбинантного белка SAV-RGD, специфически узнающего клетки меланомы, в качестве препарата для производства лекарственных препаратов для лечения миеломы человека.The aim of the present invention is to provide a highly efficient and economical method for the preparative production of recombinant protein SAV-RGD, specifically recognizing melanoma cells, as a drug for the production of drugs for the treatment of human myeloma.
Данная цель была достигнута за счет разработки и оптимизации способа препаративного получения рекомбинантного белка SAV-RGD с использованием штамма, принадлежащего к роду Escherichia.This goal was achieved through the development and optimization of a method for preparative production of recombinant protein SAV-RGD using a strain belonging to the genus Escherichia.
Настоящее изобретение предоставляет способ препаративного получения рекомбинантного белка SAV-RGD, включающий следующие стадии:The present invention provides a method for preparative production of recombinant SAV-RGD protein, comprising the following steps:
- культивирование в питательной среде штамма бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, - продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD, представленного в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, при этом культивирование ведут в питательной среде с рН-статированием в диапазоне рН 7.5-7.8, сниженной аэрацией за счет перемешивания со скоростью предпочтительно 450 об/мин, подпиткой источником углерода в течение первой половины культивирования и источником аминокислот в течение второй половины культивирования;- culturing in a nutrient medium a strain of a bacterium belonging to the genus Escherichia, a producer of the recombinant protein SAV-RGD, presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2, while the cultivation is carried out in a nutrient medium with pH-statization in the range of pH 7.5-7.8 reduced aeration due to mixing at a speed of preferably 450 rpm, replenishment with a carbon source during the first half of cultivation and a source of amino acids during the second half of cultivation;
- получение периплазматической фракции клеток указанного штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD;- obtaining periplasmic fraction of cells of the specified producer strain of the recombinant protein SAV-RGD;
- очистку рекомбинантного белка SAV-RGD методом ионообменной хроматографии с последующей ультрафильтрацией; и- purification of recombinant protein SAV-RGD by ion exchange chromatography followed by ultrafiltration; and
- лиофилизацию очищенного рекомбинантного белка SAV-RGD с получением препарата на основе самособирающегося слитого белка, содержащего меланома-узнающие пептиды и адапторную часть для присоединения токсического агента.- lyophilization of the purified recombinant protein SAV-RGD to obtain a preparation based on a self-assembled fusion protein containing melanoma-recognizing peptides and an adapter part for attaching a toxic agent.
В указанном способе условия культивирования оптимизированы для наиболее эффективного получения белка SAV-RGD, очистка целевого рекомбинантного белка SAV-RGD методом ионообменной хроматографии позволяет существенно снизить издержки процесса на стадии очистки по сравнению с использованием аффинной хроматографии на 2-иминобиотин-агарозе при сопоставимых выходах по целевому белку и степени его чистоты.In this method, the cultivation conditions are optimized for the most efficient production of SAV-RGD protein, purification of the target recombinant protein SAV-RGD by ion exchange chromatography can significantly reduce the costs of the process at the stage of purification compared with the use of affinity chromatography on 2-iminobiotin agarose with comparable yields for the target protein and its degree of purity.
Настоящее изобретение более детально описано ниже.The present invention is described in more detail below.
Подробное описание настоящего изобретения.Detailed description of the present invention.
Способом согласно настоящему изобретению является способ препаративного получения рекомбинантного белка SAV-RGD формулы S-L-R, где S - мономер стрептавидина, L - линкер, R - меланома-адресующий олигопептид, представленного в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, с использованием штамма, принадлежащего к роду Escherichia.The method according to the present invention is a method for preparative production of a recombinant protein SAV-RGD of the formula SLR, where S is the streptavidin monomer, L is the linker, R is the melanoma-addressing oligopeptide represented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2 using a strain belonging to to the genus Escherichia.
Указанный способ включает следующие стадии:The specified method includes the following stages:
- культивирование в питательной среде штамма бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, - продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD, представленного в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, при этом культивирование ведут в питательной среде с рН-статированием в диапазоне рН 7,5-7,8, сниженной аэрацией за счет перемешивания со скоростью предпочтительно 450 об/мин, подпиткой источником углерода в течение первой половины культивирования и источником аминокислот в течение второй половины культивирования;- culturing in a nutrient medium a strain of a bacterium belonging to the genus Escherichia, a producer of the recombinant protein SAV-RGD, presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2, while the cultivation is carried out in a nutrient medium with pH-statization in the pH range 7.5 -7.8, reduced aeration due to mixing at a speed of preferably 450 rpm, replenishment with a carbon source during the first half of cultivation and a source of amino acids during the second half of cultivation;
- получение периплазматической фракции клеток указанного штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD;- obtaining periplasmic fraction of cells of the specified producer strain of the recombinant protein SAV-RGD;
- очистку рекомбинантного белка SAV-RGD методом ионообменной хроматографии с последующей ультрафильтрацией; и- purification of recombinant protein SAV-RGD by ion exchange chromatography followed by ultrafiltration; and
- лиофилизацию очищенного рекомбинантного белка SAV-RGD с получением препарата на основе самособирающегося слитого белка, содержащего меланома-узнающие пептиды и адапторную часть для присоединения токсического агента с получением препарата на основе самособирающегося слитого белка, содержащего меланома-узнающие пептиды и адапторную часть для присоединения токсического агента.- lyophilization of the purified recombinant protein SAV-RGD to obtain a preparation based on a self-assembled fusion protein containing melanoma-recognizing peptides and an adapter part for attaching a toxic agent to obtain a preparation based on a self-assembled fusion protein containing melanoma-recognizing peptides and an adapter part for attaching a toxic agent .
Рекомбинантным белком SAV-RGD, получаемым способом согласно настоящему изобретению, является белок формулы S-L-R, где S - мономер стрептавидина, L - линкер, R - меланома-адресующий олигопептид, аминокислотная последовательность которого представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2. В указанном белке мономер стрептавидина представлен аминокислотами с 1 по 183, линкер представлен аминокислотами с 184 по 188, меланома-адресующий олигопептид представлен аминокислотами с 189 по 201.The recombinant SAV-RGD protein obtained by the method according to the present invention is a protein of the formula S-L-R, where S is the streptavidin monomer, L is the linker, R is the melanoma-addressing oligopeptide, the amino acid sequence of which is shown in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2. In this protein, the streptavidin monomer is represented by
Примером рекомбинантной плазмиды, экспрессирующей указанный рекомбинантный белок SAV-RGD, содержащий лидерный пептид, обеспечивающий секрецию пробелка в периплазматическое пространство клеток Е.coli, где происходит отщепление лидерного пептида и стрептавидин локализуется в биологически активном растворимом состоянии, является плазмида pSAV-RGD на базе вектора pUC18, включающие последовательность, кодирующую слитой пробелок под контролем промотора уридинфосфорилазы Е.coli. Схематическое изображение плазмиды pSAV-RGD представлено на Фиг.1. Следует понимать, что круг плазмид, которые возможно использовать в настоящем способе не ограничивается только указанной плазмидой.An example of a recombinant plasmid expressing the indicated recombinant SAV-RGD protein containing a leader peptide that secures a gap in the periplasmic space of E. coli cells, where the leader peptide is cleaved and streptavidin is localized in a biologically active soluble state, is the pUC-RG18 plasmid based on the vector pUC comprising a sequence encoding a fused gap under the control of the E. coli uridine phosphorylase promoter. A schematic representation of the plasmid pSAV-RGD is presented in Figure 1. It should be understood that the circle of plasmids that can be used in the present method is not limited to only the specified plasmid.
Бактерией, используемой в способе согласно настоящему изобретению, является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia - продуцент рекомбинантного белка SAV-RGD.The bacterium used in the method according to the present invention is a bacterium belonging to the genus Escherichia - producer of the recombinant protein SAV-RGD.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Среди примеров бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но не ограничивающихся ими, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. Among examples of bacteria belonging to the genus Escherichia, but not limited to, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia that can be used in the present invention is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), can be included in the number of bacteria according to the present invention.
Согласно настоящему изобретению, термин «бактерия-продуцент рекомбинантного белка SAV-RGD» означает бактерию, способную производить и накапливать рекомбинантный белок SAV-RGD, предпочтительно в периплазме указанной бактерии, когда такая бактерия культивируется в питательной среде. Термин «бактерия-продуцент рекомбинантного белка SAV-RGD» означает, что микроорганизм способен производить и накапливать рекомбинантный белок SAV-RGD в количестве не меньше, чем 0,05 г на 1 л культуральной жидкости, и, более предпочтительно, не меньше, чем 0,1 г на 1 л культуральной жидкости после выращивания в течение предпочтительно 18 часов.According to the present invention, the term “producer bacterium of a recombinant SAV-RGD protein” means a bacterium capable of producing and accumulating a recombinant protein SAV-RGD, preferably in the periplasm of said bacterium, when such a bacterium is cultured in a nutrient medium. The term “bacterium-producer of recombinant protein SAV-RGD” means that the microorganism is capable of producing and accumulating recombinant protein SAV-RGD in an amount of not less than 0.05 g per 1 liter of culture fluid, and, more preferably, not less than 0 , 1 g per 1 liter of culture fluid after growing for preferably 18 hours.
Примерами бактериальных штаммов, принадлежащих к роду Escherichia, - продуцентов рекомбинантного белка SAV-RGD, являются штаммы Escherichia coli MG1655, трансформированные одной из указанной выше плазмидой, например, штамм Escherichia coli MG1655/pSAV-RGD, но не ограничивается им. Указанный штамм хранится в коллекции биологического факультета МГУ.Examples of bacterial strains belonging to the genus Escherichia, producers of the recombinant SAV-RGD protein, are Escherichia coli MG1655 strains transformed with one of the above plasmids, for example, but not limited to the Escherichia coli strain MG1655 / pSAV-RGD. The specified strain is stored in the collection of the Faculty of Biology of Moscow State University.
Согласно настоящему изобретению, выращивание бактерии-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD, осуществляют в подходящей питательной среде. Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что она содержит источники углерода, азота, минеральные соединения и, если необходимо, питательные добавки в количестве, необходимом для роста бактерии. Источники углерода включают в себя различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от способа ассимиляции используемых бактерий, могут быть использованы спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источников азота используются аммиак, различные соли аммония, такие как сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и микробный ферментолизат. В качестве минеральных соединений используются однозамещенный фосфат калия, хлорид натрия, хлорид кальция, соли магния, соли железа, соли марганца и подобные им. В качестве витаминов используются тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им.According to the present invention, the cultivation of the bacteria producing the recombinant protein SAV-RGD is carried out in a suitable nutrient medium. The growth medium can be either synthetic or natural, provided that it contains sources of carbon, nitrogen, mineral compounds and, if necessary, nutritional supplements in the amount necessary for the growth of bacteria. Carbon sources include various carbohydrates, such as glucose and sucrose, and various organic acids. Depending on the method of assimilation of the bacteria used, alcohols such as ethanol and glycerin may be used. Ammonia, various ammonium salts such as ammonium sulfate, other nitrogen compounds such as amines, natural nitrogen sources such as peptone, soybean hydrolyzate, and microbial fermentolizate are used as nitrogen sources. As mineral compounds, monosubstituted potassium phosphate, sodium chloride, calcium chloride, magnesium salts, iron salts, manganese salts and the like are used. As vitamins, thiamine, yeast extract and the like are used.
Выращивание проводят предпочтительно в аэробных условиях, таких как взбалтывание и аэрация с перемешиванием, при температуре от 20°С до 40°С, предпочтительно от 30°С до 38°С, наиболее предпочтительно при 37°С. Значение рН обычно варьирует в пределах от 5 до 9, предпочтительно в пределах от 7,0 до 8,0, наиболее предпочтительно при рН 7,5-7,8. рН среды может быть скорректирован аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно, выращивание в течение 18 часов приводит к накоплению биомассы бактерий, содержащих целевой белок в периплазматическом пространстве.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as shaking and aeration with stirring, at a temperature of from 20 ° C to 40 ° C, preferably from 30 ° C to 38 ° C, most preferably at 37 ° C. The pH usually ranges from 5 to 9, preferably from 7.0 to 8.0, most preferably from pH 7.5 to 7.8. The pH of the medium can be adjusted with ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffers. Usually, growing for 18 hours leads to the accumulation of biomass of bacteria containing the target protein in the periplasmic space.
В ходе оптимизации условий культивирования штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD установлено, что наиболее оптимальным является рН питательной среды 7.5.During the optimization of the cultivation conditions of the producer strain of the recombinant protein SAV-RGD, it was found that the pH of the nutrient medium is the most optimal 7.5.
Также в ходе оптимизации условий культивирования штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD установлено, что снижение аэрации, за счет перемешивания со скоростью предпочтительно 450 об/мин, ведет к увеличению выхода целевого рекомбинантного белка SAV-RGD Принудительную аэрацию проводят путем подачи 1 объема воздуха на 1 объем питательной среды.Also, during optimization of the cultivation conditions of the producer strain of the recombinant SAV-RGD protein, it was found that reducing aeration due to stirring at a speed of preferably 450 rpm leads to an increase in the yield of the target recombinant SAV-RGD protein. Forced aeration is carried out by supplying 1 volume of air to 1 volume of culture medium.
Также в ходе оптимизации условий культивирования штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD установлено, что наиболее оптимальным является двухступенчатое культивирование штамма. В первой части культивирования осуществляют наращивание популяции клеток штамма-продуцента путем подпитки источником углерода, в частности глюкозой, при этом предпочтительно контролировать скорость подпитки таким образом, чтобы конечная концентрация глюкозы в питательной среде не превышала 1-2 г/л. Во второй части культивирования осуществляют подпитку аминокислотами для эффективного биосинтеза рекомбинантного белка SAV-RGD. В качестве источников аминокислотами используют пептон и/или дрожжевой экстракт.Also, during the optimization of the cultivation conditions of the producer strain of the recombinant SAV-RGD protein, it was found that the two-stage cultivation of the strain is the most optimal. In the first part of the cultivation, the population of the producer strain cells is increased by feeding with a carbon source, in particular glucose, while it is preferable to control the feeding rate so that the final concentration of glucose in the nutrient medium does not exceed 1-2 g / l. In the second part of the cultivation, amino acids are fed for the effective biosynthesis of the recombinant SAV-RGD protein. Peptone and / or yeast extract are used as sources of amino acids.
После выращивания получают периплазматическую фракцию указанных клеток. Для этого осаждают клетки центрифугированием, предпочтительно при 5000 об/мин при температуре 4°С в течение предпочтительно 10 минут. Культуральную жидкость удаляют, а полученную биомассу ресуспендируют в лизирующем буферном растворе, после чего центрифугированием при предпочтительно 12500 об/мин при 4°С в течение предпочтительно 20 минут получают супернатант, представляющий собой суммарную фракцию периплазматических белков Е.coli. Варианты указанного процесса подробно описаны в Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) [Cold Spring Harbor Laboratory Press].After growing receive periplasmic fraction of these cells. For this, cells are pelleted by centrifugation, preferably at 5000 rpm at a temperature of 4 ° C. for preferably 10 minutes. The culture fluid is removed and the resulting biomass resuspended in a lysis buffer solution, after which centrifugation at preferably 12,500 rpm at 4 ° C for preferably 20 minutes gives the supernatant, which is the total fraction of E. coli periplasmic proteins. Variants of this process are described in detail in Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) [Cold Spring Harbor Laboratory Press].
В ходе оптимизации условий получения периплазматической фракции бактериальных клеток установлено, что экономически целесообразным является использование лизирующего буфера, содержащего лизоцим в концентрации 1 г/л, в соотношении объемов 1:20 к объему биомассы клеток.In the course of optimizing the conditions for obtaining the periplasmic fraction of bacterial cells, it was found that it is economically feasible to use a lysis buffer containing lysozyme at a concentration of 1 g / l in a ratio of volumes of 1:20 to the volume of cell biomass.
Выделение целевого рекомбинантного белка SAV-RGD из фракции периплазматических белков осуществляют методом ионообменной хроматографии. В ходе оптимизации условий очистки установлено, что в качестве носителя в методе ионообменной хроматографии экономически целесообразным является использование SP-сефарозы (гранулированная агароза, модифицированная сульфопропильными группами) вместо 2-иминобиотинагарозы. К тому же SP-сефароза в качестве носителя достаточно стабильна и выдерживает многократные циклы очистки белка. Выходы целевого белка и его чистота при использовании SP-сефарозы и 2-иминобиотинагарозы сопоставимы.The selection of the target recombinant protein SAV-RGD from the fraction of periplasmic proteins is carried out by ion exchange chromatography. In the course of optimizing the cleaning conditions, it was found that the use of SP-sepharose (granular agarose modified with sulfopropyl groups) instead of 2-iminobiotinagarose is economically feasible as a carrier in the method of ion exchange chromatography. In addition, SP-Sepharose as a carrier is quite stable and can withstand multiple cycles of protein purification. The yields of the target protein and its purity are comparable when using SP-Sepharose and 2-iminobiotinagarose.
После проведения хроматографии целевые рекомбинантные белки подвергают очистке методом ультрафильтрации через мембрану, позволяющую фильтровать белки размером свыше предпочтительно 30 кДа, для концентрирования и перевода в раствор. Для ультрафильтрации предпочтительно использование мембраны YM-30 (Amicon, США). Предпочтительно использовать разведение 1:20 с не менее чем пятикратной сменой буфера. Ультрафильтрацию осуществляют под давлением инертного газа (аргон, гелий с давлением не менее 4,7 атм).After chromatography, the target recombinant proteins are purified by ultrafiltration through a membrane, which allows the filtering of proteins larger than preferably 30 kDa for concentration and translation. For ultrafiltration, it is preferable to use a YM-30 membrane (Amicon, USA). It is preferable to use a 1:20 dilution with at least five-fold buffer changes. Ultrafiltration is carried out under inert gas pressure (argon, helium with a pressure of at least 4.7 atm).
В результате вышеописанных процедур получают очищенные препараты рекомбинантных белков SAV-RGD. Структуры полученных гибридных белков подтверждают методом масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Гомогенность рекомбинантных белков подтверждают электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле. Чистота полученного препарата рекомбинантных белков SAV-RGD, полученного указанным способом, составляла не менее 97%.As a result of the above procedures, purified preparations of recombinant SAV-RGD proteins are obtained. The structures of the obtained fusion proteins are confirmed by mass spectrometry (MALDI-TOF MS). The homogeneity of the recombinant proteins is confirmed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. The purity of the obtained preparation of recombinant proteins SAV-RGD obtained by this method was not less than 97%.
Для получения препарата для приготовления лекарственного средства для лечения меланомы человека, полученный раствор очищенного рекомбинантного белка SAV-RGD лиофилизуют. Лиофилизацию осуществляют, разливая раствор во флаконы, замораживают раствор при температуре предпочтительно -70°С и помещают в лиофильную сушку. Процесс лиофильного высушивания проводят в течение 10-16 часов в вакууме. По окончании высушивания флаконы запаковывают. Хранение лиофилизированного препарата осуществляют при температуре 4°С.To obtain a drug for the preparation of a medicament for the treatment of human melanoma, the resulting solution of purified recombinant SAV-RGD protein is lyophilized. Lyophilization is carried out by pouring the solution into vials, the solution is frozen at a temperature of preferably -70 ° C and placed in a freeze dryer. The freeze drying process is carried out for 10-16 hours in vacuum. At the end of drying, the vials are packed. Storage of the lyophilized preparation is carried out at a temperature of 4 ° C.
Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings
На Фиг.1 приведено схематическое изображение плазмиды pSAV- RGD, содержащей гибридный ген pro-sav-rgd. Pudp - промотор гена уридинфосфорилазы из Е.coli, pro-sav - ген предшественника стрептавидина (про-стрептавидин) из Streptomyces avidinii, rgd - искусственный ген меланома-адресующего пептида, APr - ген устойчивости к ампициллину (бета-лактамаза).Figure 1 shows a schematic representation of the plasmid pSAV-RGD containing the pro-sav-rgd fusion gene. Pudp is the promoter of the uridine phosphorylase gene from E. coli, pro-sav is the streptavidin precursor gene (prostreptavidin) from Streptomyces avidinii, rgd is the artificial gene for the melanoma-addressing peptide, AP r is the ampicillin (beta-lactamase) resistance gene.
На Фиг.2 показана динамика роста штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD (контрольная ферментация). Glu - содержание глюкозы в среде культивирования (г/л); OD - оптическая плотность суспензии клеток при 600 нм; рН - значение рН среды культивирования.Figure 2 shows the growth dynamics of the producer strain of the recombinant protein SAV-RGD (control fermentation). Glu - glucose content in the culture medium (g / l); OD is the optical density of the cell suspension at 600 nm; pH is the pH of the culture medium.
На Фиг.3 показана кинетика накопления целевого продукта - рекомбинантного белка SAV-RGD (мг/л) в условиях контрольной ферментации.Figure 3 shows the kinetics of accumulation of the target product is a recombinant protein SAV-RGD (mg / l) under conditions of control fermentation.
На Фиг.4 показано содержание рекомбинантного белка SAV-RGD мг в пересчете на единицу биомассы в условиях контрольной ферментации.Figure 4 shows the content of recombinant protein SAV-RGD mg in terms of unit biomass in the control fermentation.
На Фиг.5 показана динамика роста штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD в 1,5 литровом ферментере при рН-статировании. Glu - содержание глюкозы в среде культивирования (г/л); OD - оптическая плотность суспензии клеток при 600 нм; рН - значение рН среды культивирования.Figure 5 shows the growth dynamics of the producer strain of the recombinant protein SAV-RGD in a 1.5 liter fermenter at pH-statirovanie. Glu - glucose content in the culture medium (g / l); OD is the optical density of the cell suspension at 600 nm; pH is the pH of the culture medium.
На Фиг.6 показана кинетика накопления целевого продукта - рекомбинантного белка SAV-RGD (мг/л) в 1,5 литровом ферментере при рН-статировании.Figure 6 shows the kinetics of accumulation of the target product - recombinant protein SAV-RGD (mg / l) in a 1.5 liter fermenter at pH-statirovanie.
На Фиг.7 показано содержание рекомбинантного белка SAV-RGD мг в пересчете на единицу биомассы в 1,5 литровом ферментере при рН-статировании.Figure 7 shows the content of recombinant protein SAV-RGD mg in terms of unit biomass in a 1.5 liter fermenter at pH-statirovanie.
На Фиг.8 показана динамика роста штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD в 1,5 литровом ферментере при сниженном уровне аэрации. Glu - содержание глюкозы в среде культивирования (г/л); OD - оптическая плотность суспензии клеток при 600 нм; рН - значение рН среды культивирования.On Fig shows the growth dynamics of the producer strain of the recombinant protein SAV-RGD in a 1.5 liter fermenter with a reduced level of aeration. Glu - glucose content in the culture medium (g / l); OD is the optical density of the cell suspension at 600 nm; pH is the pH of the culture medium.
На Фиг.9 показана кинетика накопления целевого продукта - рекомбинантного белка SAV-RGD (мг/л) в 1,5 литровом ферментере при сниженном уровне аэрации.Figure 9 shows the kinetics of accumulation of the target product - recombinant protein SAV-RGD (mg / l) in a 1.5 liter fermenter with a reduced level of aeration.
На Фиг.10 показано содержание рекомбинантного белка SAV-RGD мг в пересчете на единицу биомассы в 1,5 литровом ферментере при сниженном уровне аэрации.Figure 10 shows the content of recombinant protein SAV-RGD mg in terms of unit biomass in a 1.5 liter fermenter with a reduced level of aeration.
На Фиг.11 показана динамика роста штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD в 1,5 литровом ферментере в условиях подпитки источниками углерода и аминокислот. Glu - содержание глюкозы в среде культивирования (г/л); OD - оптическая плотность суспензии клеток при 600 нм; рН - значение рН среды культивирования.Figure 11 shows the growth dynamics of the producer strain of the recombinant protein SAV-RGD in a 1.5 liter fermenter under conditions of feeding with carbon and amino acid sources. Glu - glucose content in the culture medium (g / l); OD is the optical density of the cell suspension at 600 nm; pH is the pH of the culture medium.
На Фиг.12 показана кинетика накопления целевого продукта - рекомбинантного белка SAV-RGD (мг/л) в 1,5 литровом ферментере в условиях подпитки источниками углерода и аминокислот.On Fig shows the kinetics of accumulation of the target product is a recombinant protein SAV-RGD (mg / l) in a 1.5 liter fermenter in the conditions of feeding sources of carbon and amino acids.
На Фиг.13 показано содержание рекомбинантного белка SAV-RGD мг в пересчете на единицу биомассы в 1,5 литровом ферментере в условиях подпитки источниками углерода и аминокислот.On Fig shows the content of the recombinant protein SAV-RGD mg, calculated on the basis of a unit of biomass in a 1.5 liter fermenter under conditions of feeding sources of carbon and amino acids.
На Фиг.14 показана оценка чистоты рекомбинантного белка SAV-RGD, очищенного методом аффинной хроматографии (А) и ионообменной хроматографии (Б), с помощью ВЭЖХ.On Fig shows the assessment of the purity of the recombinant protein SAV-RGD, purified by affinity chromatography (A) and ion exchange chromatography (B) using HPLC.
На Фиг.15 показаны результаты эксперимента по оценке эффективности связывания рекомбинантного белка SAV-RGD клетками меланомы человека линии MeWo.On Fig shows the results of an experiment to evaluate the efficiency of binding of the recombinant protein SAV-RGD to human melanoma cells of the MeWo line.
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие никоим образом не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1. Подготовка стерильных питательных сред.Example 1. Preparation of sterile culture media.
Стерильная среда LBSterile medium LB
Стерильная среда имеет следующий состав (г/л):The sterile medium has the following composition (g / l):
Среду готовят в мерном стакане емкостью 1000 мл, в который наливают 900 мл дистиллированной воды, добавляют навеску бакто-триптона (10 г), бакто-дрожжевого экстракта (5 г), натрий хлористого (10 г), перемешивают. рН среды доводят 10 N водным раствором NaOH до значения 7,5. Приготовленный раствор переносят в колбу емкостью 2000 мл, закрывают ватно-марлевой пробкой и стерилизуют в течение 20 мин при 121°С в автоклаве (Sanyo MLS 2420 U, Япония). После стерилизации добавляют в асептических условиях стерильный ампициллин (Россия) до концентрации 150 мкг/мл. Среду хранят при комнатной температуре не более 3 месяцев.The medium is prepared in a 1000 ml measuring cup, into which 900 ml of distilled water is poured, a portion of bacto-tryptone (10 g), bacto-yeast extract (5 g), sodium chloride (10 g) are added, mixed. The pH of the medium was adjusted with 10 N aqueous NaOH to 7.5. The prepared solution was transferred into a 2000 ml flask, closed with a cotton-gauze plug and sterilized for 20 min at 121 ° C in an autoclave (Sanyo MLS 2420 U, Japan). After sterilization, sterile ampicillin (Russia) is added under aseptic conditions to a concentration of 150 μg / ml. The medium is stored at room temperature for no more than 3 months.
Стерильная среда М9++глюкозаSterile medium M9 + + glucose
Стерильная среда имеет следующий состав (г/л):The sterile medium has the following composition (g / l):
Среду готовят в мерном стакане емкостью 1000 мл, в который наливают 990 мл дистиллированной воды, добавляют навеску бакто-дрожжевого экстракта (2 г), аммоний сернокислый (4 г), натрий хлористого (0,6 г), калий фосфорнокислый 2-замещенный (2 г), магний сернокислый (0,4 г), железо сернокислое (0,02 г), марганец сернокислый (0,02 г), перемешивают. рН среды доводят Юн водным раствором NaOH до значения 7,0-7,2. Приготовленный раствор переносят в колбу емкостью 2000 мл, закрывают ватно-марлевой пробкой и стерилизуют в течение 20 мин при 121°С в автоклаве (Sanyo MLS 2420 U, Япония). После стерилизации добавляют в асептических условиях стерильный ампициллин (Россия) до концентрации 150 мкг/мл и стерильный тиамин до концентрации 0,04 г/л. Среду хранят при комнатной температуре не более 3 месяцев.The medium is prepared in a 1000 ml measuring cup, into which 990 ml of distilled water is poured, a portion of bacto-yeast extract (2 g), ammonium sulfate (4 g), sodium chloride (0.6 g), and potassium phosphate 2-substituted are added ( 2 g), magnesium sulfate (0.4 g), iron sulfate (0.02 g), manganese sulfate (0.02 g), stirred. The pH of the medium was adjusted with an aqueous NaOH solution to a value of 7.0-7.2. The prepared solution was transferred into a 2000 ml flask, closed with a cotton-gauze plug and sterilized for 20 min at 121 ° C in an autoclave (Sanyo MLS 2420 U, Japan). After sterilization, sterile ampicillin (Russia) is added under aseptic conditions to a concentration of 150 μg / ml and sterile thiamine to a concentration of 0.04 g / l. The medium is stored at room temperature for no more than 3 months.
Для приготовления 40% раствора глюкозы в 100 мл дистиллированной воды растворяют 40 г глюкозы и стерилизуют в течение 15 мин при 115°С в автоклаве (Sanyo MLS 2420 U, Япония). Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 месяцев.To prepare a 40% glucose solution in 100 ml of distilled water, 40 g of glucose is dissolved and sterilized for 15 min at 115 ° C in an autoclave (Sanyo MLS 2420 U, Japan). The solution is stored at room temperature for no more than 6 months.
Перед употреблением к стерильной среде добавляют в асептических условиях 10 мл стерильного 40% раствора глюкозы. Полученная среда с глюкозой не подлежит хранению.Before use, 10 ml of a sterile 40% glucose solution is added to the sterile medium under aseptic conditions. The resulting glucose medium cannot be stored.
Пример 2. Оптимизация процесса культивирования штамма-продуцента путем рН-статирования среды культивирования.Example 2. Optimization of the cultivation process of a producer strain by pH-statization of the culture medium.
При проведении культивирования (контрольное, моделирующее процесс на лабораторном уровне «колба-ферментер») использовали среду следующего состава: M9++глюкоза выбранную ранее как оптимальную для лабораторных экспериментов, которая содержала 2 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л глюкозы и 200 мкг/мл ампициллина. При внесении посевного материала контролировали оптическую плотность до достижения значения OD600 равного 0,09. Скорость мешалки поддерживали равной 750 об/мин. Принудительную аэрацию проводили путем подачи 1 V воздуха на V среды (1,5 л/мин). Следует отметить, что при таком режиме по показаниям датчика содержание растворенного кислорода снижалось в течение первых 5 часов (до мин. значения 15%), затем наблюдался подъем концентрации растворенного кислорода до 30-40%. рН-статирование отключали для оценки динамики рН при переходе к «крайним» условиям ферментации. Концентрацию глюкозы определяли на анализаторе глюкозы Biosen C-line (EKF Diagnostic). Результаты ферментации приведены на Фиг.2-4.During the cultivation (control, simulating the process at the laboratory level "bulb-fermenter") used the following composition: M9 + + glucose previously selected as optimal for laboratory experiments, which contained 2 g / l of yeast extract, 4 g / l of glucose and 200 μg / ml ampicillin. When seed was applied, optical density was monitored until an OD 600 value of 0.09 was reached. The stirrer speed was maintained at 750 rpm. Forced aeration was carried out by supplying 1 V air to V medium (1.5 l / min). It should be noted that in this mode, according to the sensor, the dissolved oxygen content decreased during the first 5 hours (to min. 15%), then there was a rise in the dissolved oxygen concentration to 30-40%. pH-stating was turned off to assess the dynamics of pH during the transition to “extreme” fermentation conditions. Glucose concentration was determined on a Biosen C-line glucose analyzer (EKF Diagnostic). The fermentation results are shown in Fig.2-4.
При переходе к культивированию в условиях рН-статирования использовали стандартную процедуру - титрование среды культивирования растворами 10% H2SO4 и 10% NH4OH, а рН поддерживали на уровне 7,5. При проведении ферментации с рН статирова-нием использовали среду следующего состава: M9++глюкоза выбранную ранее как оптимальную для лабораторных экспериментов, которая содержала 2 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л глюкозы и 200 мкг/мл ампициллина. При внесении посевного материала контролировали оптическую плотность до достижения значения OD600 равного 0,05. Скорость мешалки поддерживали равной 750 об/мин. Принудительную аэрацию проводили путем подачи 1 V воздуха на V среды (1,5 л/мин). Следует отметить, что при таком режиме по показаниям ДО содержание растворенного кислорода снижалось в течение первых 5 часов (до мин. значения 17%), затем наблюдался подъем концентрации растворенного кислорода до 35-40%. Концентрацию глюкозы определяли на анализаторе глюкозы Biosen C-line (EKF Diagnostic). Результаты культивирования приведены на Фиг.5-7.When switching to cultivation under conditions of pH-stating, the standard procedure was used - titration of the cultivation medium with solutions of 10% H 2 SO 4 and 10% NH 4 OH, and the pH was maintained at 7.5. When fermenting with pH statization, we used a medium of the following composition: M9 + + glucose, previously selected as optimal for laboratory experiments, which contained 2 g / l of yeast extract, 4 g / l of glucose, and 200 μg / ml of ampicillin. When the seed was applied, the optical density was monitored until an OD 600 value of 0.05 was reached. The stirrer speed was maintained at 750 rpm. Forced aeration was carried out by supplying 1 V air to V medium (1.5 l / min). It should be noted that in this mode, according to the testimony of BS, the content of dissolved oxygen decreased during the first 5 hours (to min. 17%), then there was a rise in the concentration of dissolved oxygen to 35-40%. Glucose concentration was determined on a Biosen C-line glucose analyzer (EKF Diagnostic). The results of the cultivation are shown in Fig.5-7.
Полученные данные показывают, что рН-статирование замедляет процесс автолиза клеток штамма-продуцента и поддерживает накопление биомассы на постоянном уровне (Фиг.5). Сравнительный анализ динамики роста культуры (OD600) и биосинтеза рекомбинантного белка SAV-RGD показывает, что скорость прироста содержания целевого продукта в клетках существенно выше скорости накопления биомассы: плотность культуры между 2 и 15 часом культивирования увеличилась в 3,7 раза, а количество синтезируемого целевого белка возросло в 10,8 раза Фиг.6 и 7). Соотнесение данных параметров, приведенное на Фиг.8, показывает, что клетки штамма-продуцента не только сохраняют свой биосинтетический потенциал, но и увеличивают его.The data obtained show that pH-statirovanie slows down the process of autolysis of cells of the producer strain and maintains biomass accumulation at a constant level (Figure 5). A comparative analysis of the growth dynamics of the culture (OD 600 ) and the biosynthesis of the recombinant protein SAV-RGD shows that the growth rate of the target product in the cells is significantly higher than the biomass accumulation rate: the density of the culture between 2 and 15 hours of cultivation increased by 3.7 times, and the amount of synthesized the target protein increased 10.8 times Fig.6 and 7). The correlation of these parameters shown in Fig. 8 shows that the cells of the producer strain not only retain their biosynthetic potential, but also increase it.
Таким образом, рН-статирование является одним из ключевых факторов данного процесса культивирования, что позволяет сделать вывод о необходимости поддержания рН 7,5 в оптимизированном процессе культивирования.Thus, pH-stating is one of the key factors of this cultivation process, which allows us to conclude that it is necessary to maintain a pH of 7.5 in an optimized cultivation process.
Пример 3. Изучение влияние аэрации на уровень продукции целевого белка.Example 3. The study of the effect of aeration on the level of production of the target protein.
Как уже отмечалось выше, при культивировании клеток Е.coli в присутствии глюкозы как источника углерода наблюдается активная наработка кислого продукта. Анализ научно-технической литературы показывает, что таким кислым продуктом может ацетат и/или формиат [Тао Н., С. Bausch, С. Richmond, F. R. Blattner, and T. Conway. 1999. Functional genomics: expression analysis of Escherichia coli growing on minimal and rich media. J. Bacteriol. V.181 P.6425-6440].As noted above, during the cultivation of E. coli cells in the presence of glucose as a carbon source, an active production of an acidic product is observed. An analysis of the scientific and technical literature shows that acetate and / or formate can be such an acid product [Tao N., C. Bausch, C. Richmond, F. R. Blattner, and T. Conway. 1999. Functional genomics: expression analysis of Escherichia coli growing on minimal and rich media. J. Bacteriol. V.181 P.6425-6440].
На данный процесс во многом влияет аэрация (степень насыщения среды культивирования кислородом). В связи с этим следующим этапом оптимизации было исследование влияния аэрации (скорости вращения мешалки лабораторного ферментера) на процесс культивирования клеток штамма-продуцента в лабораторном ферментере.This process is largely influenced by aeration (the degree of saturation of the culture medium with oxygen). In this regard, the next stage of optimization was the study of the effect of aeration (the rotation speed of a laboratory fermenter stirrer) on the cultivation of cells of a producer strain in a laboratory fermenter.
При проведении культивирования использовали среду следующего состава: M9++глюкоза выбранную ранее как оптимальную для лабораторных экспериментов, которая содержала 2 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л глюкозы и 200 мкг/мл ампициллина. Для рН-статирования использовали стандартную процедуру, описанную выше, а рН поддерживали на уровне 7,5. При внесении посевного материала контролировали оптическую плотность до достижения значения OD600 равного 0,06. Скорость мешалки поддерживали равной 450 об/мин, уменьшая, таким образом, уровень аэрации в объеме культуральной среды. Принудительную аэрацию проводили путем подачи 1 V воздуха на V среды (1,5 л/мин). Следует отметить, что при таком режиме по показаниям ДО содержание растворенного кислорода снижалось в течение первых 5 часов (до минимального значения 10%), затем наблюдался подъем концентрации растворенного кислорода до 20-25%. Концентрацию глюкозы определяли на анализаторе глюкозы Biosen C-line (EKF Diagnostic).During the cultivation, a medium of the following composition was used: M9 + + glucose previously selected as optimal for laboratory experiments, which contained 2 g / l of yeast extract, 4 g / l of glucose and 200 μg / ml of ampicillin. For pH-stating, the standard procedure described above was used, and the pH was maintained at 7.5. When the seed was applied, the optical density was monitored until an OD 600 value of 0.06 was reached. The stirrer speed was maintained at 450 rpm, thus reducing the level of aeration in the volume of the culture medium. Forced aeration was carried out by supplying 1 V air to V medium (1.5 l / min). It should be noted that in this mode, according to the testimony of BS, the content of dissolved oxygen decreased during the first 5 hours (to a minimum of 10%), then a rise in the concentration of dissolved oxygen to 20-25% was observed. Glucose concentration was determined on a Biosen C-line glucose analyzer (EKF Diagnostic).
Результаты культивирования при снижении уровня аэрации - снижении скорости вращения мешалки лабораторного ферментера приведены на Фиг.8-10. Из полученных экспериментальных данных следует, что снижение уровня аэрации до 450 оборотов мешалки в минуту, а следовательно и снижение насыщения питательной среды кислородом, приводило к увеличению биомассы и количества целевого белка (Фиг.8 и 9). Следует отметить, что содержание рекомбинантного белка SAV-RGD возрастало до 90-95 мг/л. Однако, выход целевого белка на единицу биомассы был ниже, чем в экспериментах при 750 оборотах/мин и составлял 5,6 мг/г биомассы (Фиг.10).The results of cultivation with a decrease in aeration level - a decrease in the rotation speed of a laboratory fermenter mixer are shown in Figs. From the obtained experimental data, it follows that a decrease in the aeration level to 450 revolutions of the stirrer per minute, and therefore a decrease in the saturation of the nutrient medium with oxygen, led to an increase in biomass and the amount of the target protein (Figs. 8 and 9). It should be noted that the content of the recombinant protein SAV-RGD increased to 90-95 mg / L. However, the yield of the target protein per unit of biomass was lower than in the experiments at 750 rpm and amounted to 5.6 mg / g of biomass (Figure 10).
Таким образом, полученные данные показывают, что снижение оборотов мешалки ферментера (насыщение кислородом среды культивирования), наряду с дополнительным автоматическим режимом рН-статирования оказывают существенное влияние на биосинтетический потенциал клеток штамма-продуцента, улучшая этот показатель в среднем на 15-18% по сравнению с ферментациями без рН-статирования и при высоких оборотах мешалки лабораторного ферментера.Thus, the data obtained show that a decrease in the speed of the fermenter stirrer (oxygen saturation of the culture medium), along with the additional automatic pH-stat mode, have a significant effect on the biosynthetic potential of the cells of the producer strain, improving this indicator by an average of 15-18% compared with fermentations without pH-stating and at high speeds stirrers laboratory fermenter.
Пример 4. Изучение влияние подпитки глюкозой и аминокислотами на уровень продукции целевого белка.Example 4. The study of the effect of glucose and amino acid supplementation on the level of production of the target protein.
Известно, что одним из параметров, лимитирующих стадию биосинтеза, является быстрое истощение основных компонентов - источников углерода и азота в питательной среде. Этот процесс особенно активно протекает в условиях культивирования клеток штамма-продуцента в ферментере (Фиг. 3, 7, 11). В связи с вышеизложенным, была проведена экспериментальная ферментация на среде с дополнительным внесение глюкозы и источника аминокислот.It is known that one of the parameters that limit the stage of biosynthesis is the rapid depletion of the main components - sources of carbon and nitrogen in the nutrient medium. This process is particularly active in the cultivation of cells of the producer strain in the fermenter (Fig. 3, 7, 11). In connection with the foregoing, experimental fermentation was carried out on a medium with the addition of glucose and a source of amino acids.
При выборе скорости подачи глюкозы учитывали особенности промотор-операторной области, под контролем которой находится искусственный ген sav-rgd. Согласно литературным данным, активация этой промотор-операторной области осуществляется комплексом CRP-cAMP (Hammer - Jespersen K. // Metabolism of Nucleotides, Nucleosides and Nucleobases in Microorganisms / Ed. Munch - Petersen A. London, New York, San Francisco: Acad. Press - 1983. - P.203-258. Kolb A., Busby S., Buc H., Garges S., Adhya S. (1993) Transcriptional regulation by cAMP and its receptor protein. Annu. Rev. Biochem. 62, 749-795). В самом общем виде: этот промотор является катаболит-чувствительным и репрессируется в условиях присутствия высоких концентраций глюкозы репрессором CytR. В связи с этим, скорость подачи глюкозы регулировалась таким образом, чтобы конечная концентрация в питательной среде была не выше 1-2 г/л.When choosing the glucose supply rate, the features of the promoter-operator region, under the control of which the artificial gene sav-rgd, were taken into account. According to published data, the activation of this promoter-operator region is carried out by the CRP-cAMP complex (Hammer - Jespersen K. // Metabolism of Nucleotides, Nucleosides and Nucleobases in Microorganisms / Ed. Munch - Petersen A. London, New York, San Francisco: Acad. Press - 1983. - P.203-258. Kolb A., Busby S., Buc H., Garges S., Adhya S. (1993) Transcriptional regulation by cAMP and its receptor protein. Annu. Rev. Biochem. 62, 749-795). In its most general form: this promoter is catabolite-sensitive and is repressed in the presence of high glucose concentrations by the CytR repressor. In this regard, the glucose delivery rate was regulated so that the final concentration in the nutrient medium was no higher than 1-2 g / l.
При проведении ферментации использовали среду следующего состава: М9++глюкоза выбранную ранее как оптимальную для лабораторных экспериментов, которая содержала 2 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л глюкозы и 200 мкг/мл ампициллина. Для рН-статирования использовали стандартную процедуру, описанную выше, а рН поддерживали на уровне 7,5. При внесении посевного материала контролировали оптическую плотность до достижения значения OD600 равного 0,06. Скорость мешалки поддерживали равной 450 об/мин. Принудительную аэрацию проводили путем подачи 1 V воздуха на V среды (1,5 л/мин). Следует отметить, что при таком режиме по показаниям ДО содержание растворенного кислорода снижалось в течение первых 5 часов (до мин. значения 10%), затем наблюдался подъем концентрации растворенного кислорода до 20-25%. Концентрацию глюкозы определяли на анализаторе глюкозы Biosen C-line (EKF Diagnostic). Исходный объем среды в ферментере составлял 1,1 л. Инокулировали посевным материалом и вели подпитку 40%-ным раствором глюкозы (скорость подачи 25 мл/час, поддержание концентрации глюкозы на уровне 1 г/л) в течение 10 час. По окончании введения глюкозы дробно добавляли стерильный раствор пептона (10 г/л), дрожжевого экстракта (5 г/л) и ампициллина (100 мг/л) в течение еще 8 часов. Скорость подачи раствора составляла 25 мл/час. Общий объем культуральной суспензии составлял на момент окончания ферментации примерно 1,35 л. Процесс культивирования проводили в течение 18 часов.When carrying out the fermentation, a medium of the following composition was used: M9 + + glucose previously selected as optimal for laboratory experiments, which contained 2 g / l of yeast extract, 4 g / l of glucose and 200 μg / ml of ampicillin. For pH-stating, the standard procedure described above was used, and the pH was maintained at 7.5. When the seed was applied, the optical density was monitored until an OD 600 value of 0.06 was reached. The stirrer speed was maintained at 450 rpm. Forced aeration was carried out by supplying 1 V air to V medium (1.5 l / min). It should be noted that in this mode, according to the testimony of BS, the content of dissolved oxygen decreased during the first 5 hours (to min. 10%), then there was a rise in the concentration of dissolved oxygen to 20-25%. Glucose concentration was determined on a Biosen C-line glucose analyzer (EKF Diagnostic). The initial volume of medium in the fermenter was 1.1 l. The seed was inoculated and fed with a 40% glucose solution (feed
Результаты ферментации при условии подпиткой источниками углерода и аминокислот приведены на Фиг.11-13.The results of fermentation, provided that the sources of carbon and amino acids are fed are shown in Figs. 11-13.
Анализ приведенных данных (Фиг.11-13) позволяет утверждать, что в период культивирования с 10 до 14 часов происходит исчерпание основного источника углерода - глюкозы (культура растет при лимитации источника углерода). В этот же период культура метаболитически перестраивается к потреблению аминокислот из пептона и дрожжевого экстракта, что выражается в понижении скорости роста культуры (несмотря на начало дробного введения источников аминокислот) и, одновременно, продукции целевого белка. После этого наблюдается резкое возрастание как плотности культуральной суспензии, так и уровня накопления рекомбинантного белка SAV-RGD (Фиг.11-13). Эти данные позволяют предположить, что в условиях культивирования в лабораторном ферментере, происходит начальная интенсивная утилизация глюкозы, что приводит к наработке популяции клеток штамма-продуцента, способного к активному продуцированию целевого рекомбинантного белка, а последующая дробная подпитка аминокислотными компонентами служит своеобразным «индуктором» активирующим биосинтез рекомбинантного белка SAV-RGD.Analysis of the data (Figs. 11-13) allows us to state that during the cultivation period from 10 a.m. to 2 p.m. there is an exhaustion of the main carbon source - glucose (the culture grows when the carbon source is limited). In the same period, the culture is metabolically converted to the consumption of amino acids from peptone and yeast extract, which is expressed in a decrease in the growth rate of the culture (despite the beginning of fractional introduction of amino acid sources) and, at the same time, the production of the target protein. After this, there is a sharp increase in both the density of the culture suspension and the level of accumulation of the recombinant protein SAV-RGD (11-13). These data suggest that under the conditions of cultivation in a laboratory fermenter, the initial intensive utilization of glucose occurs, which leads to the production of a population of cells of the producer strain that can actively produce the target recombinant protein, and the subsequent fractional feeding with amino acid components serves as a kind of “inducer” activating biosynthesis recombinant protein SAV-RGD.
Одновременно, следует признать, что избранный подход дробной подачи глюкозы является оптимальным, т.к. в питательной среде не создается высокая концентрация этого источника углерода, приводящая к слишком интенсивному формированию ацетата, угнетающее действие которого на рост культуры рекомбинантного штамма Е.coli - продуцента целевого белка в ферментере было обнаружено ранее.At the same time, it should be recognized that the chosen approach of fractional glucose supply is optimal, because a high concentration of this carbon source is not created in the nutrient medium, leading to too intense formation of acetate, the inhibitory effect of which on the growth of the culture of the recombinant E. coli strain, the producer of the target protein in the fermenter, was previously detected.
В связи с этим можно было предложить разнести процесс культивирования клеток штамма-продуцента на два этапа: наращивание общей биомассы и этап активного биосинтеза рекомбинантного белка. При этом стадия «индукции» аминокислотными добавками может быть проведена не дробной подачей, а единовременным внесением аминокислотных компонентов.In this regard, it could be suggested that the process of cultivating the cells of the producer strain be divided into two stages: increasing the total biomass and the stage of active biosynthesis of the recombinant protein. In this case, the stage of "induction" of amino acid additives can be carried out not by fractional supply, but by the simultaneous introduction of amino acid components.
Таким образом, оптимальными условиями культивирования рекомбинантного штамма Е.coli - продуцента целевого белка в ферментере являются:Thus, the optimal cultivation conditions of the recombinant strain of E. coli, the producer of the target protein in the fermenter, are:
Среда M9++глюкоза следующего состава (г/л):M9 + + glucose medium of the following composition (g / l):
рН-статирование - рН 7,5.pH stating - pH 7.5.
Количество вносимого посевного материала - по OD600 0,05-0,09 культуральной среды.The amount of seed seeded is OD 600 0.05-0.09 culture medium.
Скорость мешалки - 450 об/мин.The stirrer speed is 450 rpm.
Принудительная аэрация - 1,5 л воздуха в минуту.Forced aeration - 1.5 liters of air per minute.
Подпитка - 40%-ным раствором глюкозы (скорость подачи 25 мл/час, поддержание концентрации глюкозы на уровне 1 г/л) в течение 10 час.Make-up - with a 40% glucose solution (feed rate of 25 ml / hour, maintaining a glucose concentration of 1 g / l) for 10 hours.
Дробная подпитка - раствор пептона (10 г/л), дрожжевого экстракта (5 г/л) и ампициллина (100 мг/л) в течение последующих 8 часов со скоростью подачи 25 мл/час.Fractional recharge - a solution of peptone (10 g / l), yeast extract (5 g / l) and ampicillin (100 mg / l) for the next 8 hours with a feed rate of 25 ml / hour.
Время ферментации - 18 часов.Fermentation time is 18 hours.
Пример 5. Приготовление растворов для хроматографии, лизиса клеток, гель-фильтрации и ультрафильтрации.Example 5. Preparation of solutions for chromatography, cell lysis, gel filtration and ultrafiltration.
Для приготовления буфера «А» в мерный стакан объемом 1000 мл вносят 950 мл дистиллированной воды и добавляют навески NaCl (29 г), и Na2CO3 (5,3 г) и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Раствор титруют до достижения рН 10,8. После чего доводят объем до 1000 мл и хранят при температуре +4°С.To prepare buffer “A”, 950 ml of distilled water was added to a 1000 ml measuring cup and weighed portions of NaCl (29 g) and Na 2 CO 3 (5.3 g) were added and stirred on a magnetic stirrer until completely dissolved. The solution is titrated until a pH of 10.8 is reached. Then the volume is adjusted to 1000 ml and stored at a temperature of + 4 ° C.
Для приготовления буфера «Б» в мерный стакан объемом 1000 мл вносят 950 мл дистиллированной воды и добавляют навески NaCl (29 г) и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. После чего доводят объем до 1000 мл и хранят при температуре +4°С.To prepare buffer “B”, 950 ml of distilled water is added to a 1000 ml measuring cup and weighed portions of NaCl (29 g) are added and stirred on a magnetic stirrer until completely dissolved. Then the volume is adjusted to 1000 ml and stored at a temperature of + 4 ° C.
Для приготовления буфера «В» в мерный стакан объемом 1000 мл вносят 950 мл дистиллированной воды и добавляют навески CH3COONa (4,1 г) и NaCl (29 г), и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Раствор титруют до достижения рН 4,0. После чего доводят объем до 1000 мл и хранят при температуре +4°С.To prepare buffer “B”, 950 ml of distilled water was added to a 1000 ml measuring cup and weighed portions of CH 3 COONa (4.1 g) and NaCl (29 g) were added and stirred on a magnetic stirrer until completely dissolved. The solution is titrated until a pH of 4.0 is reached. Then the volume is adjusted to 1000 ml and stored at a temperature of + 4 ° C.
Для приготовления буфера для гель-фильтрации в мерный стакан объемом 1000 мл вносят 950 мл дистиллированной воды и добавляют навески Na2HPO4 (1,42 г) и NaCl (8,7 г), и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Раствор титруют до достижения рН 7,4. После чего доводят объем до 1000 мл и хранят при температуре +4°С.To prepare a gel filtration buffer, 950 ml of distilled water is added to a 1000 ml measuring beaker and weighed portions of Na 2 HPO 4 (1.42 g) and NaCl (8.7 g) are added and stirred on a magnetic stirrer until completely dissolved. The solution is titrated until a pH of 7.4 is reached. Then the volume is adjusted to 1000 ml and stored at a temperature of + 4 ° C.
Для приготовления буфера ТЕ-буфера в мерный стакан объемом 1000 мл вносят 950 мл дистиллированной воды и добавляют навески Трис-Cl (3,94 г) и ЭДТА (1,47 г), и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Раствор титруют до достижения рН 8,0. После чего доводят объем до 1000 мл и хранят при температуре +4°С.To prepare the TE buffer, 950 ml of distilled water is added to a 1000 ml measuring cup and weighed portions of Tris-Cl (3.94 g) and EDTA (1.47 g) are added and stirred on a magnetic stirrer until completely dissolved. The solution is titrated until a pH of 8.0 is reached. Then the volume is adjusted to 1000 ml and stored at a temperature of + 4 ° C.
Для приготовления буфера лизирующего буфера в мерный стакан объемом 1000 мл вносят 750 мл дистиллированной воды и добавляют навески Трис-Cl (1,57 г), ЭДТА (2,92 г), лизоцим (1 г) и сахарозу (200 г), перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Раствор титруют до достижения рН 8,0. После чего доводят объем до 1000 мл и хранят при температуре +4°С.To prepare a lysis buffer buffer, 750 ml of distilled water are added to a 1000 ml measuring cup and weighed portions of Tris-Cl (1.57 g), EDTA (2.92 g), lysozyme (1 g) and sucrose (200 g) are mixed on a magnetic stirrer until completely dissolved. The solution is titrated until a pH of 8.0 is reached. Then the volume is adjusted to 1000 ml and stored at a temperature of + 4 ° C.
Пример 6. Оптимизация процесса получения периплазматической фракции клеток штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD.Example 6. Optimization of the process of obtaining the periplasmic fraction of cells of the producer strain of the recombinant protein SAV-RGD.
Полученную биомассу промывают двукратно 100 мл ТЕ-буфером (10 мМ Трис-Cl, рН 8,0; 5 мМ ЭДТА) с отделением ее центрифугированием при тех же условиях. К полученной биомассе добавляют лизирующий буфер, содержащий 20% сахарозы, 10 мМ ЭДТА, 1 мг/мл лизоцима, 25 мМ Трис-Cl, рН 8,0, и инкубируют 15-20 минут при +4°С (ледяная баня) при постоянном перемешивании. Смесь центрифугируют 10 мин. при 10000 об/мин (+4°С). Супернатант, содержащий фракцию периплазматических белков, собирают и используют для очистки целевого белка.The resulting biomass is washed twice with 100 ml of TE-buffer (10 mm Tris-Cl, pH 8.0; 5 mm EDTA) with separation by centrifugation under the same conditions. Lysing buffer containing 20% sucrose, 10 mM EDTA, 1 mg / ml lysozyme, 25 mM Tris-Cl, pH 8.0 is added to the resulting biomass and incubated for 15-20 minutes at + 4 ° C (ice bath) at a constant stirring. The mixture is centrifuged for 10 minutes. at 10000 rpm (+ 4 ° C). The supernatant containing the periplasmic protein fraction is collected and used to purify the target protein.
Процесс оптимизации включал подбор соотношения лизирующего буфера и объема биомассы с варьированием данного соотношения - 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 и 1:25. Контрольным параметром являлось количество выделенного целевого белка. Содержание целевого белка в периплазматической фракции определяли с помощью ВЭЖХ. Результаты оптимизации суммированы в Таблице 1.The optimization process included the selection of the ratio of lysis buffer and biomass volume with a variation of this ratio - 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:15, 1:20 and 1:25. The control parameter was the amount of the selected target protein. The content of the target protein in the periplasmic fraction was determined using HPLC. The optimization results are summarized in Table 1.
Как видно из приведенных данных соотношение лизирующего буфера и биомассы можно значительно уменьшить, доведя его до величины 1:20 (1 объем лизирующего буфера: 20 объемов суспензии клеток после ферментации). При этом практически весь белок SAV-RGD локализовался в надосадочной жидкости (фракции периплазматических белков штамма-продуцента). Дальнейшее увеличение количество биомассы на один объем лизирующего приводило к увеличению вязкости получаемого раствора белков, а также к потерям при отделении раствора периплазматических белков от осадка после центрифугирования. В связи с этим, в дальнейшем использовали соотношение лизирующего буфера к объему суспензии клеток 1:20.As can be seen from the above data, the ratio of lysis buffer to biomass can be significantly reduced by bringing it to a value of 1:20 (1 volume of lysis buffer: 20 volumes of cell suspension after fermentation). Moreover, almost the entire SAV-RGD protein was localized in the supernatant (fractions of the periplasmic proteins of the producer strain). A further increase in the amount of biomass per lysing volume led to an increase in the viscosity of the resulting protein solution, as well as to losses in the separation of the periplasmic protein solution from the precipitate after centrifugation. In this regard, in the future, the ratio of lysis buffer to the volume of the cell suspension 1:20 was used.
Пример 7. Очистка рекомбинантного белка SAV-RGD методом ионообменной хроматографии.Example 7. Purification of recombinant protein SAV-RGD by ion exchange chromatography.
Ранее авторы настоящего изобретения показали, что использование метода аффинной хроматографии на 2-иминобиотин-агарозе позволяет достичь степени очистки целевого продукта в 17,5 раз, а чистоты - 95-97%. Для увеличения степени чистоты целевого белка и удешевления стоимости данной стадии технологического процесса были проведены эксперименты по сравнению процессов выделения рекомбинантного белка SAV-RGD из периплазматической фракции на колонках с носителями 2-иминобиотин-агароза и SP-сефароза. Объем носителя увеличивали в соответствии с коэффициентом масштабирования, что соответствовало увеличению получаемой культуральной жидкости на стадии 1 масштабирования - колбы, стадии 2 масштабирования - 1,5 литровый ферментер и стадии 3 масштабирования - 7 литровый ферментер.Previously, the authors of the present invention showed that the use of affinity chromatography on 2-iminobiotin agarose allows to achieve the degree of purification of the target product by 17.5 times, and the purity of 95-97%. To increase the degree of purity of the target protein and reduce the cost of this stage of the technological process, experiments were conducted comparing the processes of isolation of the recombinant protein SAV-RGD from the periplasmic fraction on columns with 2-iminobiotin-agarose and SP-sepharose carriers. The volume of the carrier was increased in accordance with the scaling factor, which corresponded to an increase in the obtained culture fluid at the
Очистку рекомбинантного белка SAV-RGD методом ионообменной хроматографии проводили следующим образом. Периплазматическую фракцию вносили при постоянном перемешивании в буферный раствор 0,01 М ацетата натрия, рН 4,0 для удаления части балластных белков. Полученный раствор титровали до рН 4,0 ледяной уксусной кислотой и инкубировали в течение 10 минут при постоянном перемешивании. Затем раствор центрифугировали 30 мин (5000xg, +4°C). Супернатант осторожно сливали и наносили на колонку с SP-сефарозой fast flow (GE, США) с помощью перистальтического насоса (скорость протока 2,5 мл/мин). Колонку промывали последовательно 100 мл 0,01 М ацетата натрия, рН 4,0; 250 мл 0,15 М NaCl в 0,01М ацетате натрия, рН 4,0. Белок элюировали 0,25 М NaCl в 0,01М ацетате натрия, рН 4,0. Выход белка контролировали с помощью ультрафиолетового детектора. Полученный раствор белка собирали и определяли концентрацию белка с помощью метода ВСА (BCA-kit, Sigma), чистоту белка контролировали ВЭЖХ на колонке Symmetry 300C4 (4,6×150 мм) в градиенте 0,1% ТФУ - ацетонитрил, а также электрофорезом в 14%-ном полиакриламидном геле. Элюат концентрировали с помощью ячейки Amicon (мембрана РМ-30) до концентрации белка 10-20 мг/мл и диализовали против 3 л 0,01 М фосфата натрия, рН 7,4 (+4°С, 18 ч). Диализат фильтруют через мембранный фильтр с размерами пор 0,22 мкм, аликвоты фильтрата переносили в стерильные пенициллиновые флаконам емкостью 10 мл, флаконы накрывают стерильной тканью Петрянова, выдерживают при - 70°С (как минимум 2 ч) и лиофилизовали 20 ч. Флаконы с высушенным препаратом укупоривают стерильными резиновыми пробками и зажимают алюминиевыми колпачками. Хранят при (+4°С).Purification of the recombinant protein SAV-RGD by ion exchange chromatography was carried out as follows. The periplasmic fraction was introduced with constant stirring in a buffer solution of 0.01 M sodium acetate, pH 4.0 to remove part of the ballast proteins. The resulting solution was titrated to pH 4.0 with glacial acetic acid and incubated for 10 minutes with constant stirring. Then, the solution was centrifuged for 30 min (5000xg, + 4 ° C). The supernatant was carefully drained and applied to a fast flow SP-Sepharose column (GE, USA) using a peristaltic pump (flow rate 2.5 ml / min). The column was washed sequentially with 100 ml of 0.01 M sodium acetate, pH 4.0; 250 ml of 0.15 M NaCl in 0.01 M sodium acetate, pH 4.0. The protein was eluted with 0.25 M NaCl in 0.01 M sodium acetate, pH 4.0. Protein yield was monitored using an ultraviolet detector. The resulting protein solution was collected and the protein concentration was determined using the BCA method (BCA-kit, Sigma), protein purity was monitored by HPLC on a Symmetry 300C4 column (4.6 × 150 mm) in a gradient of 0.1% TFA - acetonitrile, as well as by electrophoresis in 14% polyacrylamide gel. The eluate was concentrated using an Amicon cell (PM-30 membrane) to a protein concentration of 10-20 mg / ml and dialyzed against 3 L of 0.01 M sodium phosphate, pH 7.4 (+ 4 ° C, 18 h). The dialysate is filtered through a 0.22 μm membrane filter, aliquots of the filtrate are transferred into sterile penicillin vials with a capacity of 10 ml, the vials are covered with a sterile Petryanov cloth, kept at -70 ° C (at least 2 hours) and lyophilized for 20 hours. Vials with dried the drug is sealed with sterile rubber stoppers and clamped with aluminum caps. Store at (+ 4 ° C).
Количество полученного рекомбинантного белка SAV-RGD определяли методом ВЭЖХ, концентрацию белка - с помощью метода ВСА (BCA-kit с протоколом методики фирмы-производителя Sigma, кат. № ВСА1-1KT, США). Полученные данные суммированы в Таблице 2.The amount of recombinant SAV-RGD protein obtained was determined by HPLC, and the protein concentration was determined using the BCA method (BCA kit with the protocol of the Sigma manufacturer's technique, Cat. No. BCA1-1KT, USA). The data obtained are summarized in Table 2.
Как видно из полученных данных, как выход по целевому белку, так и степень его чистоты были сопоставимы или выше при использовании ионообменной хроматографии. Чистоту полученных двумя методами целевых белков оценивали методом ВЭЖХ. Данные представлены на Фиг.14. Результаты хроматографического анализа свидетельствуют, что чистота рекомбинантного белка SAV-RGD, выделенного методом аффинной хроматографии и чистота рекомбинантного белка SAV-RGD, выделенного методом ионообменной хроматографии сопоставима. Однако, при сопоставимых выходах и чистоты целевого белка экономические показатели двух методов выделения различаются значительно. При максимальном масштабировании затраты на сорбент при выделении 1 мг целевого белка SAV-RGD составляют: при применении аффинной хроматографии 28,3 евро/мг, а при использовании ионообменной хроматографии - 0,14 евро/мг. То есть метод аффинной хроматографии дороже более чем в 200 раз. Следовательно, замена носителя для проведения выделения и очистки рекомбинантного белка SAV-RGD позволяет удешевить данную стадию технологического процесса. Кроме того, емкость 2-Имнобиотин-агарозы и его невысокая стабильность (сшитая агароза) не позволяет рассчитывать на большое число циклов очистки белка на основе стрептавидина, необходимое при масштабировании процесса. В то же время SP-сефароза в качестве носителя достаточно стабильна и выдерживает многократные циклы очистки белка.As can be seen from the obtained data, both the yield of the target protein and its degree of purity were comparable or higher when using ion exchange chromatography. The purity of the target proteins obtained by two methods was evaluated by HPLC. The data are presented in FIG. The results of chromatographic analysis indicate that the purity of the recombinant SAV-RGD protein isolated by affinity chromatography and the purity of the recombinant SAV-RGD protein isolated by ion exchange chromatography are comparable. However, with comparable yields and purity of the target protein, the economic indicators of the two isolation methods differ significantly. With maximum scaling, the cost of the sorbent when isolating 1 mg of the target SAV-RGD protein is: when using affinity chromatography, 28.3 euros / mg, and when using ion exchange chromatography, 0.14 euros / mg. That is, the method of affinity chromatography is more than 200 times more expensive. Therefore, replacing the carrier for isolation and purification of the recombinant protein SAV-RGD allows you to reduce the cost of this stage of the process. In addition, the capacity of 2-Imnobiotin agarose and its low stability (crosslinked agarose) do not allow counting on a large number of protein purification cycles based on streptavidin, which is necessary for scaling the process. At the same time, SP-Sepharose as a carrier is quite stable and can withstand multiple cycles of protein purification.
Таким образом, полученные результаты показали перспективность использования ионообменной хроматографии для выделения и очистки рекомбинантного белка SAV-RGD.Thus, the results obtained showed the promise of using ion exchange chromatography for the isolation and purification of recombinant SAV-RGD protein.
Пример 8. Проверка биологической активности полученного белка SAV-RGD.Example 8. Verification of the biological activity of the obtained SAV-RGD protein.
Эффективность связывания целевого белка с клетками меланомы человека линии MeWo определяли следующим образом:The binding efficiency of the target protein to human melanoma cells of the MeWo line was determined as follows:
Подготовка клеток.Cell preparation.
Клеточную культуру метастазирующей беспигментной меланомы человека MeWo (malignant melanoma (derived from metastatic site, lymph node by Y. Kodera and M. Bean, 1974), ATCC® HTB-65™), высевали на 10-ти сантиметровые культуральные чашки (Greiner, Австрия) и растили в течение 72 часов в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, Dulbecco′s modified Eagles medium) (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (Hyclone, США), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (либо 200 мкг/мл канамицина). Культивирование вели при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислоты. Плотность культуры оценивали визуально. В экспериментах использовали клетки в экспоненциальной стадии роста, прошедшие 3-4 пассажа после размораживания. К моменту постановки эксперимента клетки занимали приблизительно 30-50% площади поверхности дна чашки.MeWo human metastatic pigmentless melanoma cell culture (malignant melanoma (derived from metastatic site, lymph node by Y. Kodera and M. Bean, 1974), ATCC® HTB-65 ™), was plated on 10 cm culture dishes (Greiner, Austria ) and grown for 72 hours in the Needle modified Dulbecco medium (DMEM, Dulbecco's modified Eagles medium) (PanEco, Russia) with the addition of 10% fetal calf serum (Hyclone, USA), 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin (or 200 μg / ml kanamycin). Cultivation was carried out at 37 ° C in a humid atmosphere containing 5% carbon dioxide. The density of the culture was evaluated visually. In the experiments, cells were used in the exponential growth stage, passing 3-4 passages after thawing. By the time of the experiment, the cells occupied approximately 30-50% of the bottom surface of the cup.
Непосредственно перед проведением эксперимента по оценке эффективности связывания белка с клетками, из культуральных чашек среду удаляли, клетки промывали 3 раза раствором DPBS (ПанЭко, Россия), после чего вносили 4 мл раствора Версена (ПанЭко, Россия) и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Раствор Версена удаляли, клетки смывали с чашки при помощи 3 мл среды DMEM без сыворотки, ресуспендировали и инкубировали в течение 30 минут. Количество клеток определяли методом подсчета в камере Горяева.Immediately before the experiment to evaluate the efficiency of protein binding to cells, the medium was removed from the culture plates, the cells were washed 3 times with DPBS solution (PanEco, Russia), after which 4 ml of Versen solution (PanEco, Russia) was added and incubated for 5 minutes at room temperature. The Versen solution was removed, the cells were washed from the plate with 3 ml of serum-free DMEM medium, resuspended and incubated for 30 minutes. The number of cells was determined by counting in a Goryaev chamber.
Исходя из данных подсчета, клетки разводили средой DMEM без сыворотки до достижения плотности 200-250 тысяч клеток/1 мл суспензии.Based on the counting data, the cells were diluted with serum-free DMEM until a density of 200-250 thousand cells / 1 ml of suspension was reached.
Получение FITC-меченого рекомбинантного белка SAV-RGD.Obtaining FITC-labeled recombinant protein SAV-RGD.
Лиофилизированный рекомбинантный белок SAV-RGD растворяли в PBS до концентрации 1 мг/мл. FITC-конъюгированный биотин (Biotin-4-Fluorescein, В10570, Molecular Probes, Inc.) растворяли в DMSO до концентрации 25 мг/мл. Раствор FITC-биотина добавляли к раствору рекомбинантного белка SAV-RGD, перемешивали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 60 минут. Поскольку белок SAV-RGD содержит 4 сайта связывания биотина, молярное соотношение SAV-RGD:FITC-биотин в растворе составляло 1:4. Таким образом, для мечения 1 мг рекомбинантного белка использовали 44,5 мкг FITC-биотина.The lyophilized recombinant SAV-RGD protein was dissolved in PBS to a concentration of 1 mg / ml. FITC-conjugated biotin (Biotin-4-Fluorescein, B10570, Molecular Probes, Inc.) was dissolved in DMSO to a concentration of 25 mg / ml. The FITC-Biotin solution was added to the SAV-RGD recombinant protein solution, mixed and incubated in the dark at room temperature for 60 minutes. Since the SAV-RGD protein contains 4 biotin binding sites, the molar ratio of SAV-RGD: FITC-biotin in solution was 1: 4. Thus, 44.5 μg FITC-Biotin was used to label 1 mg of the recombinant protein.
Оценка эффективности связывания FITC-меченого рекомбинантного белка SAV-RGD с клетками линии MeWo.Evaluation of the binding efficiency of the FITC-labeled recombinant protein SAV-RGD with MeWo cells.
Подготовка экспериментального образца (Э). 250 мкл подготовленной клеточной суспензии, содержащей 50-60 тыс. клеток, помещали в 1,5 мл пробирку и добавляли 25 мкл раствора исследуемого белка SAV-RGD, меченого FITC. Таким образом, конечная концентрация белка в растворе составляла 1,25*10-6 моль/л. Пробирки с клеточной суспензией помещали в термостат и инкубировали в течение 1 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2, встряхивая каждые 10-15 минут. По прошествии 1 часа клетки осаждали центрифугированием в настольной центрифуге (3 мин. при 3000 об./мин. (800g)) и удаляли супернатант. Осадок промывали 400 мкл раствора DPBS, осаждали центрифугированием, а затем ресуспендировали в 250 мкл раствора DPBS.Preparation of an experimental sample (E). 250 μl of the prepared cell suspension containing 50-60 thousand cells was placed in a 1.5 ml tube and 25 μl of the FITC-labeled SAV-RGD test protein solution was added. Thus, the final concentration of protein in the solution was 1.25 * 10-6 mol / L. Tubes with cell suspension were placed in a thermostat and incubated for 1 hour at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 , shaking every 10-15 minutes. After 1 hour, the cells were pelleted by centrifugation in a benchtop centrifuge (3 min. At 3000 rpm. (800g)) and the supernatant was removed. The precipitate was washed with 400 μl of DPBS solution, precipitated by centrifugation, and then resuspended in 250 μl of DPBS solution.
Подготовка контрольного образца (К). 250 мкл подготовленной клеточной суспензии, содержащей 50-60 тыс. клеток, помещали в пробирку и добавляли 25 мкл раствора DPBS. Пробирки с клеточной суспензией помещали в термостат и инкубировали в течение 1 часа при 37°С в атмосфере 5% CO2, периодически встряхивая (каждые 10-15 минут). По прошествии 1 часа клетки осаждали центрифугированием (3 мин. при 3000 об/мин (800g)) и удаляли супернатант. Осадок промывали 400 мкл раствора DPBS, осаждали центрифугированием, а затем ресуспендировали в 250 мкл раствора DPBS.Preparation of control sample (K). 250 μl of the prepared cell suspension containing 50-60 thousand cells was placed in a tube and 25 μl of DPBS solution was added. Tubes with cell suspension were placed in a thermostat and incubated for 1 hour at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 , periodically shaking (every 10-15 minutes). After 1 hour, the cells were besieged by centrifugation (3 min. At 3000 rpm (800g)) and the supernatant was removed. The precipitate was washed with 400 μl of DPBS solution, precipitated by centrifugation, and then resuspended in 250 μl of DPBS solution.
Интенсивность флуоресценции клеток из экспериментального (Э) и контрольного (К) образцов анализировали при помощи проточного цитофлуориметра (FACS Aria SORP, Beckton Dickinson, либо аналога), определяя медиану распределения интенсивности флуоресценции клеток экспериментального (Мэ) и контрольного (Мк) образцов, соответственно.The fluorescence intensity of cells from the experimental (E) and control (K) samples was analyzed using a flow cytometer (FACS Aria SORP, Beckton Dickinson, or analog), determining the median distribution of fluorescence intensity of the cells of the experimental (Me) and control (Mk) samples, respectively.
Вывод об эффективности белкового препарата делали на основании значения М, которое рассчитывается по формуле: М=(Мэ/Мк*5). Если полученное значение больше либо равно 1, то анализируемый препарат считается эффективным, если меньше 1 - неэффективным.The conclusion about the effectiveness of the protein preparation was made on the basis of the value of M, which is calculated by the formula: M = (Me / Mk * 5). If the obtained value is greater than or equal to 1, then the analyzed drug is considered effective, if less than 1 - ineffective.
Результаты эксперимента по оценке эффективности связывания рекомбинантного белка SAV-RGD клетками меланомы человека линии MeWo представлены на Фиг.15.The results of an experiment to evaluate the binding efficiency of the recombinant protein SAV-RGD by human melanoma cells of the MeWo line are presented in Fig. 15.
Хотя указанное изобретение описано в деталях выше, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть внесены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения и целиком включены в настоящее описание посредством ссылки.Although the invention has been described in detail above, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not beyond the scope of the present invention. All cited documents are part of the description of the present invention and are fully incorporated into this description by reference.
Claims (2)
- культивирование в питательной среде штамма бактерии MG1655/pSAV-RGD, полученного трансформацией штамма Escherichia coli MG1655 плазмидой pSAV-RGD, в свою очередь полученной на базе вектора pUC18 и включающей последовательность, кодирующую слитый пробелок SAV-RGD (pro-sav-rgd) под контролем промотора уридинфосфорилазы (Pudp) Е. coli, где в первые 10 ч культивирования осуществляют подпитку 40% раствором глюкозы при скорости подачи 25 мл/час и поддержании глюкозы на уровне 1 г/л, по окончании которой дробно добавляют стерильный раствор пептона 10 г/л, дрожжевого экстракта 5 г/л и ампициллина 100 мг/л, продолжая культивирование в течение 8 ч;
- получение периплазматической фракции клеток указанного штамма-продуцента рекомбинантного белка SAV-RGD посредством добавления к суспензии клеток лизирующего буфера, содержащего лизоцим в концентрации 1 г/л, при соотношении объемов лизирующего буфера и суспензии клеток 1:20;
- очистка рекомбинантного белка SAV-RGD методом ионообменной хроматографии с последующей ультрафильтрацией; и
- лиофилизация очищенного рекомбинантного белка SAV-RGD.1. The method of obtaining the recombinant protein SAV-RGD, presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 2, specifically recognizing human melanoma cells, comprising the following stages:
- culturing in a nutrient medium a strain of the bacterium MG1655 / pSAV-RGD obtained by transforming the Escherichia coli strain MG1655 with the plasmid pSAV-RGD, in turn, obtained on the basis of the pUC18 vector and including the sequence encoding the fused gap SAV-RGD (pro-sav-rgd) under control the promoter of uridine phosphorylase (Pudp) E. coli, where in the first 10 hours of cultivation they are fed with a 40% glucose solution at a feed rate of 25 ml / h and the glucose is maintained at 1 g / l, after which a sterile peptone solution of 10 g / l, yeast extract 5 g / l and amp tsillina 100 mg / L, while continuing the cultivation for 8 hours;
- obtaining the periplasmic fraction of cells of the indicated producer strain of the recombinant protein SAV-RGD by adding to the cell suspension a lysis buffer containing lysozyme at a concentration of 1 g / l, with a ratio of the volumes of lysis buffer and cell suspension of 1:20;
- purification of recombinant protein SAV-RGD by ion exchange chromatography followed by ultrafiltration; and
- lyophilization of purified recombinant protein SAV-RGD.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013142555/10A RU2563540C2 (en) | 2013-09-18 | 2013-09-18 | Method for obtaining recombinant protein sav-rgd, specifically recognising melanoma cells |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013142555/10A RU2563540C2 (en) | 2013-09-18 | 2013-09-18 | Method for obtaining recombinant protein sav-rgd, specifically recognising melanoma cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013142555A RU2013142555A (en) | 2015-03-27 |
RU2563540C2 true RU2563540C2 (en) | 2015-09-20 |
Family
ID=53286486
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013142555/10A RU2563540C2 (en) | 2013-09-18 | 2013-09-18 | Method for obtaining recombinant protein sav-rgd, specifically recognising melanoma cells |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2563540C2 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2153535C1 (en) * | 1999-05-14 | 2000-07-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Recombinant plasmid dna psa v27 encoding synthesis of soluble streptavidine from streptomyces avidinii and bacterial strain escherichia coli as producer of soluble streptavidine from streptomyces avidinii |
-
2013
- 2013-09-18 RU RU2013142555/10A patent/RU2563540C2/en active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2153535C1 (en) * | 1999-05-14 | 2000-07-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Recombinant plasmid dna psa v27 encoding synthesis of soluble streptavidine from streptomyces avidinii and bacterial strain escherichia coli as producer of soluble streptavidine from streptomyces avidinii |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
SYRKINA M.S. ET AL. Preparation and functional evaluation of RGD-modified streptavidin targeting to integrin-expressing melanoma cells // Protein. Eng. Des. Sel., 2013 Feb; 26(2):143-50. * |
СЫРКИНА М.С. Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний. Автореферат. М.: 2012, с. 1-24 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2013142555A (en) | 2015-03-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bajaj et al. | Poly (glutamic acid)–an emerging biopolymer of commercial interest | |
JP5101492B2 (en) | Production of recombinant protein by self-proteolytic cleavage of fusion protein | |
KR20190018725A (en) | Fermentation method to improve recombinant human collagen production level | |
CN111019962A (en) | SOD-ELP fusion protein and preparation method thereof | |
CN110387379B (en) | Mixed culture process and application of recombinant escherichia coli for producing glutathione | |
CN109652484A (en) | A kind of method that full cell high-efficient catalyzes and synthesizes N-BETA-Alanyl-L-histidine | |
WO2012033150A1 (en) | Process for production of equol | |
Pilz et al. | Lipopeptides development in cosmetics and pharmaceutical applications: a comprehensive review | |
RU2180002C2 (en) | Method of collagenase producing | |
CA2751831A1 (en) | Nucleic acid molecule of a biosynthetic cluster encoding non ribosomal peptide synthases and uses thereof | |
RU2563540C2 (en) | Method for obtaining recombinant protein sav-rgd, specifically recognising melanoma cells | |
ES2267579T3 (en) | PEPTIDOSINTETASAS CONFECTED TO MEASURE, PROCEDURE FOR PREPARATION AND USE. | |
CN113105556A (en) | Ferritin nanoparticle for modifying ERK polypeptide inhibitor and preparation method and application thereof | |
CN103627691B (en) | A kind of immobilization glutathione synthetase and its preparation and application | |
RU2577138C1 (en) | Method of producing of recombinant protein sav-rgd | |
Balakrishnan et al. | Influence of amino acids on the biosynthesis of cyclosporin A by Tolypocladium inflatum | |
CN110195088A (en) | A kind of new arginine hydrolase and its encoding gene and application | |
KR20160000979A (en) | Auto-Cell Concentration Recognition Auto-Inducible Expression System For Which Inducer Is Not Required and Use Thereof | |
CN109666618B (en) | Lactobacillus engineering bacterium with improved viability in acid stress environment | |
CN109762834B (en) | Fermentation and one-step purification method for obtaining aromatic isopentenyl transferase | |
CN105713908A (en) | Recombinant bombyx mori gloverin and preparation method and application thereof | |
CN102344900A (en) | Engineering bacterium for expressing antihypertensive peptide and method for preparing antihypertensive peptide | |
JP2022522276A (en) | Continuous production method of recombinant GLP-1 peptide by bacteria | |
CN110484552A (en) | The preparation method of non-animal derived property Plasmid DNA | |
CN111518851A (en) | Continuous preparation of immobilized enzyme14/15N]Method for producing L-citrulline |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TC4A | Altering the group of invention authors |
Effective date: 20151211 |