RU2535871C1 - Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом - Google Patents
Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2535871C1 RU2535871C1 RU2013131441/10A RU2013131441A RU2535871C1 RU 2535871 C1 RU2535871 C1 RU 2535871C1 RU 2013131441/10 A RU2013131441/10 A RU 2013131441/10A RU 2013131441 A RU2013131441 A RU 2013131441A RU 2535871 C1 RU2535871 C1 RU 2535871C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- protein
- vkorc1
- chinese hamster
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 158
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 title claims abstract description 74
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 101000621945 Homo sapiens Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 102100023485 Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 Human genes 0.000 claims abstract description 83
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims abstract description 18
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims abstract description 18
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims abstract description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 100
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 37
- WXBAKLJXQYICHT-UHFFFAOYSA-N 7-(4-methoxyphenyl)furo[3,2-g]chromen-5-one Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(OC1=C2)=CC(=O)C1=CC1=C2OC=C1 WXBAKLJXQYICHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 13
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 101150025072 VKORC1 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 10
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical group N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 9
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 8
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 8
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 8
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims description 7
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 claims description 7
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 7
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 7
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims description 7
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 7
- 101150022345 GAS6 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 6
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 6
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 6
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 6
- 101001130876 Spiroplasma virus SpV1-R8A2 B Uncharacterized protein ORF6 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 6
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 6
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 claims description 6
- 108010025221 plasma protein Z Proteins 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 5
- 102000043253 matrix Gla protein Human genes 0.000 claims description 5
- 108010057546 matrix Gla protein Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 4
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 23
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 17
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 31
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 16
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000050685 human VKORC1 Human genes 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N Menaquinone 1 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N 0.000 description 8
- 235000019175 phylloquinone Nutrition 0.000 description 8
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 8
- 229960001898 phytomenadione Drugs 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- KUTXFBIHPWIDJQ-LKUDQCMESA-N 7a-methyl-1a-[(e)-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-enyl]naphtho[2,3-b]oxirene-2,7-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2(C/C=C(C)/CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)C1(C)O2 KUTXFBIHPWIDJQ-LKUDQCMESA-N 0.000 description 5
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 5
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- KUTXFBIHPWIDJQ-UHFFFAOYSA-N vitamin K1 epoxide Natural products O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2(CC=C(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)C1(C)O2 KUTXFBIHPWIDJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 101100102642 Homo sapiens VKORC1 gene Proteins 0.000 description 4
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical group OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100038182 Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KUTXFBIHPWIDJQ-BTPXSFBUSA-N (1ar,7as)-7a-methyl-1a-[(e,7r,11r)-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-enyl]naphtho[2,3-b]oxirene-2,7-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)[C@@]2(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@]1(C)O2 KUTXFBIHPWIDJQ-BTPXSFBUSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 206010067787 Coagulation factor deficiency Diseases 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000742236 Homo sapiens Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 208000014763 coagulation protein disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 3
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 2
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 101000920078 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 2
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 2
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102100040283 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- -1 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 108010044156 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase b Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000026260 warfarin resistance Diseases 0.000 description 2
- YPGMOWHXEQDBBV-QWWZWVQMSA-N (4S,5S)-1,2-dithiane-4,5-diol Chemical compound O[C@@H]1CSSC[C@H]1O YPGMOWHXEQDBBV-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- KUTXFBIHPWIDJQ-HBDFACPTSA-N 2,3-epoxyphylloquinone Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)C1(C)O2 KUTXFBIHPWIDJQ-HBDFACPTSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 108010001058 Acyl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002735 Acyl-CoA Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000013831 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101000611202 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101000621954 Synechococcus sp. (strain JA-2-3B'a(2-13)) Vitamin K epoxide reductase homolog Proteins 0.000 description 1
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 102000004210 Vitamin K Epoxide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000779 Vitamin K Epoxide Reductases Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940105772 coagulation factor vii Drugs 0.000 description 1
- 208000022508 combined deficiency of vitamin K-dependent clotting factors 2 Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010048032 cyclophilin B Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010013113 glutamyl carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 229960000027 human factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 101150040063 orf gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000369 oxido group Chemical group [*]=O 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003714 vitamin K1 derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантных белков с Gla-доменом в клетках китайского хомячка. Сконструирована плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, в следующей последовательности, по существу, содержащая следующие элементы: область начала репликации плазмиды pUC; открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; прокариотический промотор гена bla; участок терминального повтора вируса Эпштейна-Барр человека; функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 5' нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген; область, кодирующая последовательность Козак для кэп-зависимой инициации трансляции; ОРС гена субъединицы 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина К (VKORC1) китайского хомячка со стоп-кодоном; функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 3' нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген; промотор ранних генов вируса SV40; ген устойчивости к селекционному агенту; и сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40. Полученной плазмидой трансформируют клетки китайского хомячка - продуцента белка с Gla-доменом, которые используют в способе рекомбинантного получения белков с Gla-доменом. Изобретение позволяет повысить продуктивность указанных клеток за счет повышения активности нативного VKORC1. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл., 8 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих.
Предшествующий уровень техники
Некоторые секретируемые белки позвоночных животных содержат кластеры близкорасположенных гамма-карбоксилированных остатков глутаминовой кислоты, обычно обозначаемые как Gla-домен. Большинство известных белков, содержащих Gla-домен, являются зимогенами сериновых протеаз и участвуют в каскаде свертывания крови. Функции самого Gla-домена могут быть описаны как координирование ионов кальция и Са-зависимое связывание с фосфолипидной мембраной (Nelsestuen et al. (1976) Role of gamma-carboxyglutamic acid. Cation specificity ofprothrombin and factor X-phospholipid binding. J. Biol. Chem., 251, 6886-6893).
В настоящее время известно более 10 белков человека, содержащих Gla-домен, - факторы свертывания крови, такие как протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянты, такие как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранные Gla-белки (TMGPs). Для всех указанных белков гамма-карбоксилирование необходимо для проявления их функциональной активности (Furie et al. (1999) Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid. Blood, 93, 1798-1808).
Гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты (Glu→Gla) происходит пост-трансляционно, локализовано в эндоплазматическом ретикулуме клеток и производится ферментом витамин-К зависимой гамма-глутамин карбоксилазой (GGCX, ЕС 4.1.1.90) (Berkner, K.L. (2000) The vitamin K-dependent carboxylase. J. Nutr., 130, 1877-1880). Источником присоединяемой карбоксильной группы в данной реакции является растворенный углекислый газ, а кофактором GGCX выступает восстановленная дигидрохиноновая форма витамина K, превращающаяся при прохождении реакции в окисленную форму 2,3-эпоксида хинона. Таким образом, реакция гамма-карбоксилирования требует постоянного поддержания существенной концентрации дигидрохиноновой формы витамина К в люмене эндоплазматического ретикулума.
Восстановление эпокси-формы витамина К до дигидрохинона в клетке производится ферментным комплексом VKOR или VKORC (vitamin К oxireductase complex), основным компонентом которого является интегральный белок "субъединица 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина K" (VKORC1, ЕС 1.1.4.1). Ген VKORC1 и основные свойства рекомбинантного белка VKORC1 человека описаны в патентах США 7482141 и 7524665. Известно, что некоторые мутации в этом гене вызывают устойчивость к ингибитору гамма-карбоксилирования белков варфарину, а также редкое наследственное заболевание "множественный дефицит факторов свертываемости крови тип 2" [Rost, Fregin, Ivaskevicius, Conzelmann, Hortnagel, Pelz, Lappegard, Seifried, Scharrer, Tuddenham, Muller, Strom and Oldenburg, Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2 // Nature, v.427, p.537-41 (2004)].
Поскольку белки системы гемостаза должны иметь полностью (или почти полностью) гамма-карбоксилированный Gla-домен для проявления функциональной активности, гетерологичная экспрессия их генов в культивируемых клетках млекопитающих может приводить к секреции неактивных форм белков. Этот нежелательный эффект наиболее выражен для систем экспрессии рекомбинантного фактора VII свертываемости крови и проявляется как невозможность получения существенных количеств функционально активного рекомбинантного фактора VII в клетках линии СНО, при этом клетки линий HepG2 или ВНК позволяют получать функционально активный белок при сходном уровне секреции. В ряде работ было установлено, что увеличение количества GGCX не приводит к улучшению гамма-карбоксилирования молекул фактора VII, в то время как оверэкспрессия гена VKORC1 человека в клетках линии СНО позволяет получить функционально активный продукт и существенно повысить скорость секреции клетками фактора VII (Bolt, G., Т.D. Steenstrup, et al. (2007). "All post-translational modifications except propeptide cleavage are required for optimal secretion of coagulation factor VII." Thromb Haemost 98(5): 988-997). Сходные данные были получены для рекомбинантного фактора свертываемости крови IX, секретируемого клетками линии ВНК [Wajih, Hutson, Owen and Wallin, Increased production of functional recombinant human clotting factor IX by baby hamster kidney cells engineered to overexpress VKORC1, the vitamin К 2,3-epoxide-reducing enzyme of the vitamin К cycle // J Biol Chem, v.280, p.31603-7 (2005)]. Для известных систем экспрессии фактора IX в клетках СНО, лимитированных уровнем процессинга пропептида целевого белка, уровень гамма-карбоксилирования, обеспечиваемый эндогенным ферментом VKORC1, по-видимому, достаточен для получения фактора IX с полной функциональной активностью [McGrath, Factor IX (protease zymogen) // Directory of therapeutic enzymes, p.209-238 (2005)]. В то же время уровень секреции фактора IX при оверэкспрессии гена VKORC1 человека увеличивается в 1,2-1,4 раза (патент США 7375084). Таким образом, оверэкспрессия гена VKORC1 в клетках-продуцентах позволяет увеличить как уровень секреции BK3-белков, так и долю их функционально активных форм.
Вследствие того, что исходно были охарактеризованы ген и кДНК VKORC1 человека, в большинстве работ для оверэкспрессии VKORC1 в культивируемых клетках были использованы плазмиды, содержащие кДНК VKORC1 человека. Известно, что изолированная каталитическая эффективность VKORC1 для различных видов млекопитающих отличается примерно в 4 раза [Wilson, Sauer, Carlson, Wallin, Ward and Hooser, Species comparison of vitamin K1 2,3-epoxide reductase activity in vitro: kinetics and warfarin inhibition // Toxicology, v.189, p.191-8 (2003)]. Поскольку удельная активность фермента VKORC1 может быть точно и непосредственно измерена только при разобщении витамин К оксиредуктазного комплекса и использовании дитиотрейтола в качестве донора электронов, собственная удельная активность VKORC1 не может охарактеризовать его фактическую каталитическую эффективность в живой клетке. Такая каталитическая эффективность, то есть способность поддерживать достаточную концентрацию восстановленной дигидрохиноновой формы витамина K в эндоплазматическом ретикулуме клеток, в которых происходит оверэкспрессия Gla-белка, может быть оценена только косвенным образом, а именно по уровню секреции гамма-карбоксилированной формы оверэкспрессируемого белка. Поскольку белки, переносящие электроны на мембранно-связанный фермент VKORC1, в настоящий момент неизвестны [Wilson, Sauer, Carlson, Wallin, Ward and Hooser, Species comparison of vitamin K1 2,3-epoxide reductase activity in vitro: kinetics and warfarin inhibition // Toxicology, v.189, p.191-8 (2003)], можно предположить, что их сродство к различным ортологам VKORC1 может существенно различаться. Тогда наилучшим вариантом VKORC1 для оверэкспрессии в клетках-продуцентах мог бы быть их собственный VKORC1, поскольку его достаточное сродство к белкам-донорам электронов клетки-хозяина не может вызывать сомнения. В случае клеток линии СНО такой аутологичный вариант VKORC1 не был описан, и его ферментативная активность не была охарактеризована ни прямыми, ни косвенными методами.
По-видимому, естественный уровень экспрессии гена VKORC1 в клетках СНО относительно низок, поскольку данный ген преимущественно экспрессируется в гепатоцитах, а линия клеток СНО получена из яичника. В частности, в работе [de Castilho Femandes, Fontes, Gonsales, Swiech, Picanco-Castro, Faca and Covas, Stable and high-level production of recombinant Factor IX in human hepatic cell line // Biotechnol Appi Biochem, v.58, p.243-9 (2011)] было установлено, что уровень экспрессии функционально активного фактора IX человека выше в линии клеток, полученных из печени (HepG2), чем в линиях клеток, полученных из других тканей; при этом во всех случаях использовался одинаковый экспрессионный вектор. В то же время, уровень экспрессии неустановленных белков, являющихся донорами электронов для VKORC1, в различных тканях неизвестен, также неизвестной остается и необходимость поддержания повышенного уровня экспрессии генов этих белков.
Краткое описание изобретения.
Целью настоящего изобретения является получение клеток китайского хомячка - продуцентов белков с Gla-доменом и предоставление способа получения белков с Gla-доменом с использованием полученных клеток.
Эта цель была достигнута путем того, что авторами настоящего изобретения впервые была клонирована и секвенирована область открытой рамки (ОРС) считывания кДНК VKORC1, полученной из клеток линии СНО DG-44. При оверэкспрессии ОРС аутологичного VKORC1 китайского хомячка, находящегося под контролем промотора CHEF1, в линии клеток СНО DG-44 было обнаружено резкое увеличение ферментативной активности VKORC1. Оверэкспрессия ОРС VKORC1 человека в таком же экспрессионном векторе приводила к значительно меньшему увеличению ферментативной активности VKORC1. Таким образом, ко-экспрессия аутологичного гена VKORC1 китайского хомячка под контролем сильного промотора может увеличить уровень секреции рекомбинантных Gla-белков, что представляет значительный интерес для биотехнологии и потенциально позволяет существенно уменьшить затраты при получении рекомбинантных факторов свертывания крови Vila, IX, X, протромбина, а также белка С, использующихся в качестве лекарственных средств.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является субъединица 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина К (VKORC1) китайского хомячка, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.
Также объектом настоящего изобретения является фрагмент ДНК, кодирующий VKORC1, описанную выше.
Также объектом настоящего изобретения является фрагмент ДНК, описаный выше, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.
Также объектом настоящего изобретения является плазмида, обладающая способностью к экспрессии в клетке китайского хомячка, содержащая фрагмент ДНК, описанный выше, под контролем промотора, функционирующего в указанной клетке.
Также объектом настоящего изобретения является плазмида, описанная выше, в которой указанным промотором является сильный промотор.
Также объектом настоящего изобретения является плазмида, описанная выше, в которой указанной плазмидой является плазмида p1.2-Zeo-CHO-VKORC1, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:5.
Также объектом настоящего изобретения является клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом, в которой повышена активность VKORC1 по п.1.
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, в которой экспрессия VKORC1 повышена за счет повышения экспрессии VKORC1 в указанной клетке.
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, в которой экспрессия VKORC1 повышена за счет трансформации указанной клетки плазмидой по п.4.
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, в которой экспрессия VKORC1 повышена за счет использования сильного промотора, функционирующего в указанной клетке.
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, при этом указанной клеткой является клетка СНО DG44.
Также объектом настоящего изобретения является клетка, описанная выше, в которой белок с Gla-доменом выбран из группы, состоящей из факторов свертывания крови, таких как (протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянтов, таких как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранных Gla-белков (TMGPs).
Также объектом настоящего изобретения является способ получения белка с Gla-доменом, включающий стадии культивирования описанной выше в питательной среде и выделения полученного белка с Gla-доменом из культуральной жидкости.
Также объектом настоящего изобретения является способ, описанный выше, в котором культивируют клетки СНО DG44/p1.2-Zeo-CHO-VKORC1.
Также объектом настоящего изобретения является способ, описанный выше, в котором белок с Gla-доменом выбран из группы, состоящей из факторов свертывания крови, таких как (протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянтов, таких как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранных Gla-белков (TMGPs).
Более подробно настоящее изобретение описано ниже.
Подробное описание настоящего изобретения
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание системы для оверэкспрессии белков с Gla-доменом в клетках китайского хомячка.
Технический результат достигался путем клонирования области открытой рамки считывания кДНК гена VKORC1 китайского хомячка, конструирования на ее основе новой экспрессионной плазмидной ДНК, в частности p1.2-Zeo-CHO-VKORC1, пригодной для трансфекции клеток-продуцентов белков с Gla-доменом и последующей селекции вспомогательного трансгена, позволяющей получать линии-продуценты белков с Gla-доменом с высоким уровнем продукции полностью гамма-карбоксилированного целевого белка и достаточной стабильностью основного и вспомогательного трансгенов в геноме.
В основе технического решения лежит разработанная авторами плазмидная ДНК p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 длиной 12318 п.о., кодирующая ген VKORC1 китайского хомячка под контролем промотора гена CHEF1 (Chinese Hamster translation Elongation Factor 1 alpha), функционирующего в клетке китайского хомячка и фланкированного нетранскрибируемыми областями гена CHEF1, а также генетический элемент, обеспечивающий возможность селекции клонов с инсерциями экспрессионной кассеты в геноме клеток продуцентов. Функциональные промотор и терминатор гена CHEF1 обеспечивают конститутивную экспрессию целевого гена; последовательность кДНК гена VKORC1 китайского хомячка обеспечивает экспрессию полипептидной цепи фермента, последовательность, включающая промотор SV40 и ген фермента устойчивости к действию антибиотика зеоцина (Zeo) обеспечивает возможность селекции стабильно трансфицированных клеток СНО в присутствии зеоцина.
Термин «субъединица 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина K (VKORC1)» означает фермент, катализирующий следующую реакцию: 2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон+окисленный дитиотреитол⇔2,3-эпокси-2,3-дигидро-2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон+1,4-дитиотреитол. Указанную активность классифицируют как ЕС 1.1.4.1. Предыдущее название - витамин K-зависимый фактор дефицита свертывания крови 2 (vitamin K dependent clotting factors deficiency 2, VKCFD2). Наличие активности ацил-СоА-дегидрогеназы может быть установлено способом, описанным, например, Goodstadt L. и Ponting C.P. (Vitamin К epoxide reductase: homology, active site and catalytic mechanism. Trends Biochem Sci. 2004 Jun; 29(6):289-92) или способом, описанным в Примерах 5 или 7. В настоящий момент известны VKORC1 человека, мыши, крысы. Так, аминокислотная последовательность рекомбинантного фермента VKORC1 человека представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:4. Последовательность ОРС гена, кодирующего рекомбинантный фермент VKORC1 человека, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:3. Примером VKORC1 китайского хомячка согласно настоящему изобретению является фермент, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2 или его функциональный вариант. Последовательность белка депонирована заявителем в GenBank (03-APR-2012) под номером AFG26681.1.
Термин "вариант белка", используемый в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, в котором сохраняется активность указанного белка. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 15, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 5. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Следовательно, вариант белка может быть представлен белками с гомологией не менее 80%, предпочтительно, не менее 90%, и, наиболее предпочтительно, не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей, при условии, что активность белка такого сохраняется.
Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.
Замена, делеция, вставка или добавление одной или нескольких аминокислотных остатков являются консервативной (-ыми) мутацией (-ями), если сохраняется активность. Типичным примером консервативной мутации является консервативная замена. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Не на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, He или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu.
Фрагментом ДНК, кодирующим VKORC1 китайского хомячка согласно настоящему изобретению, является любой (с точки зрения вырожденности генетического кода) фрагмент ДНК, кодирующий фермент из китайского хомячка, обладающий активностью VKORC1.
Примером последовательности ОРС гена, кодирующего фермент VKORC1 клеток китайского хомячка DG44 согласно настоящему изобретению, является последовательность, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Указанная последовательность депонирована 03.04.2012 заявителем в базу данных GenBank под номером JQ400047.1. Аминокислотная последовательность фермента VKORC1 клеток китайского хомячка DG44 согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.
Фрагменты ДНК, которые кодируют, по существу, те же регуляторные элементы могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько нуклеотидов в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.
Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный вектор позволяет получить высокопродуктивный клон клеток с увеличенным содержанием ферментов, осуществляющих гамма-карбоксилирование, определяются по ферментативной активности витамин-K эпоксиредуктазного комплекса в лизате клеточной массы (при этом удельная ферментативная активность определяется как отношение скорости восстановления 2,3-эпоксида витамина K1 лизатом клеток в присутствии избытка донора электронов, например дитиотреитола, и концентрации общего белка в исследуемом лизате). Измерение удельной ферментативной активности описано в Примерах 5 и 7.
Измерение степени превращения 2,3-эпоксида витамина K в восстановленную форму витамина К может быть проведено путем последовательного отбора аликвот из лизата исследуемых клеток, смешанных с донором электронов дитиотреитолом и субстратом реакции -2,3-эпоксидом витамина K1, экстракции всех форм витамина K1 смесью гексана и изопропанола, последующим отделением органической фазы, ее выпариванием в вакууме, растворением нелетучего осадка в минимальном объеме метанола, хроматографическом разделении окисленной и восстановленной форм витамина K1 на колонке для обращенно-фазовой хроматографии, расчета объемов пиков форм витамина K1 и вычисления доли восстановленной формы витамина K1.
Активность фермента в клетке может быть повышена за счет увеличения количества соответствующей мРНК, повышения количества соответствующего фермента, или увеличения удельной активности фермента. Количество соответствующей мРНК может быть увеличено за счет увеличения числа копий соответствующего гена или за счет усиления транскрипции соответствующего гена, достигаемого путем использования более сильного промотора, снятия репрессии, или за счет увеличения стабильности мРНК. Количество соответствующего фермента может быть повышено за счет усиления трансляции соответствующей мРНК, достигаемого модификацией нуклеотидной последовательности сайта связывания рибосом соответствующей мРНК или за счет увеличения его стабильности. Удельная активность фермента может быть увеличена за счет введения соответствующих мутаций в аминокислотную последовательность фермента.
Методы усиления экспрессии гена включают увеличение числа копий гена. Введение гена в вектор, способный функционировать в клетке согласно настоящему изобретению, увеличивает число копий гена.
Термин «плазмида, обладающая способностью к экспрессии в клетке китайского хомячка» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии в клетке-хозяине внедренного в него гена, например, такие как промотор, терминатор, и элементов для отбора клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме. Конкретным примером генетических элементов, согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор гена CHEF1, и ген фермента, обеспечивающего устойчивость клеток к действию зеоцина.
Конкретным примером такой плазмиды является плазмида p1.2-Zeo-CHO-VKORC1. Карта экспрессионной плазмиды p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 согласно настоящему изобретению, приведена на Фиг. 1, последовательность плазмиды представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:5. Карта экспрессионной плазмиды p1.2-Zeo-hVKORC1, кодирующей VKORC1 человека, приведена на Фиг. 2, последовательность плазмиды представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:6.
Практические функциональные свойства плазмиды, содержащей ген VKORC1 китайского хомячка, p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 (SEQ ID NO:5) можно оценить по сравнению с контрольной плазмидой p1.2-Zeo-hVKORC1 (SEQ ID NO:6), содержащей OPC VKORC1 человека.
Плазмида p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 размером 12318 п.о. состоит из:
1) фрагмента размером 501 п.о. (6446-6946), включающего открытую рамку считывания VKORC1 китайского хомячка, последовательность Козак, обеспечивающую инициацию трансляции и стоп-кодон;
2) фрагмента векторной плазмиды p1.2-Zeo размером 11817 п.о. (6947-6445), содержащего элементы для экспрессии целевого белка в клетках млекопитающих (функциональный вирусный промотор, сигнал полиаденилирования и функциональный терминатор) и селекционный маркер для отбора в эукариотических клетках, а также элементы, необходимые для продукции плазмиды в бактериальной клетке - область начала репликации и селекционный маркер.
Указанная плазмида содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: PvuI (1409), AbsI (6446), AfeI (6522), NheI (6947), KpnI (11089), PsiI (12204).
Плазмида была получена с использованием стандартных методов генной инженерии, коммерчески доступных плазмид и химически синтезированных олигонуклеотидов [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989].
Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения множества копий гена в геном. Для введения множества копий гена в геном выполняется гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в геномной ДНК, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК, или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. Также возможно включить ген в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена в хромосомную ДНК.
Усиление экспрессии гена также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий гена.
С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор мутации, ведущей к увеличению уровня транскрипции локализованного за промотором гена. Кроме того, возможно ввести нуклеотидную замену в область промотора гена на хромосоме, результатом чего является усиление функции промотора.
Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения во фрагмент ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Козак. Последовательность Козак располагается вокруг старт-кодона целевого гена и способствует инициации трансляции мРНК целевого гена. Использование сильного промотора можно сочетать с использованием более эффективной последовательности Козак.
Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Согласно настоящему изобретению термин «клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом» означает клональную линию клеток китайского хомячка, обладающую способностью к продукции и секреции белка с Gla-доменом, когда она согласно настоящему изобретению выращивается в питательной среде. Используемый здесь термин «клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом» также означает линию клеток, которые способна секретировать белок с Gla-доменом в количестве не менее чем 0,1 мкг/мл, более предпочтительно, не менее чем 1 мкг/мл при культивировании в суспензионной культуре в бессывороточной среде. Указанный белок с Gla-доменом секретируется указанными клетками в культивационную среду.
В качестве примера предпочтительных клеток яичника китайского хомячка может быть приведена линия СНО DG44 (Invitrogen cGMP banked, США; Mol Cell Biol 5, 1750-1759 Kaufman RJ et al. 1985). Круг сублиний СНО не ограничен каким-либо образом, например, могут быть использованы сублинии СНО CHOZN DHFR, CHO DUKX B11 и подобные им.
Конкретным примером линии для получения продуцента фактора свертывания крови VIII человека с делегированным В-доменом согласно настоящему изобретению является линия СНО DG44, но спектр линий клеток не ограничиваются ей.
Белком с Gla-доменом является белок, выбранный из группы, состоящей из факторов свертывания крови, таких как (протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянтов, таких как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранных Gla-белков (TMGPs).
Также для реализации настоящего изобретения еще одной технической задачей явилось создание способа получения высокопродуктивных и стабильных при последовательном пассировании линий клеток млекопитающих-продуцентов белков с Gla-доменом с увеличенным содержанием ферментов, обеспечивающих гамма-карбоксилирование, с использованием эукариотической клетки (или эукариотической клетки-продуцента Gla-домен содержащих белков), трансфицированной экспрессионной плазмидой.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения белка с Gla-доменом в клетках китайского хомячка, включающего культивирование в питательной среде описанных выше клеток - продуцентов белка с Gla-доменом, и выделение полученного целевого рекомбинантного белка из культуральной жидкости.
Выращивание клеток, выделение и очистка целевого белка из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам культивирования, в которых рекомбинантный белок продуцируется с использованием клеток млекопитающих.
Питательная среда, используемая для культивирования, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста клеток. В качестве источника углерода могут использоваться различные углеводы, такие как глюкоза или сахароза и другие органические кислоты. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Выращивание может осуществляться в аэробных условиях, предпочтительно с повышенным содержанием СО2 (8%), таких как перемешивание культуральной жидкости в колбах, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. Обычно, выращивание в течение от 12 часов до 4 дней приводит к накоплению целевого рекомбинантного белка в культуральной среде или в цитоплазме клетки.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования, а затем целевой белок может быть выделен и очищен методами хроматографии и/или концентрирования.
Особенности настоящего изобретения и результаты его практического применения приведены на следующих Фигурах и Примерах.
Краткое описание Фигур.
На Фигуре 1 показана карта экспрессионной плазмиды p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 (длина 12318 пар оснований). Используются следующие обозначения: pUC origin - область начала репликации плазмиды pUC; bla - открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; bla promoter - прокариотический промотор гена bla; EBVTR -участок терминального повтора вируса Эпштейна-Барр человека; СНО EEF1A UFR функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 5′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген; transcription start - точка начала транскрипции, Kozak - область, кодирующая последовательность Козак для кэп-зависимой инициации трансляции, СНО VKORC ORF - ОРС гена VKORC1 китайского хомячка, stop - стоп-кодон, СНО EEF1A DFR функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 3′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген; SV40 early promoter -промотор ранних генов вируса SV40, Zeo(R)- ген устойчивости к селекционному агенту - антибиотику зеоцину, SV40 pA - сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды p1.2-Zeo-hVKORC1 (длина 12324 пар оснований). Обозначения аналогично Фигуре 1. hVKORC1 ORF - ОРС гена VKORC1 человека.
На Фигуре 3 показана схема получения экспрессионных плазмид pCMV6-Entry-CHO-VKORC1 и pCMV6-Entry-hVKORC1. Используются следующие обозначения: Линейные фрагменты ДНК изображены в виде прямоугольников, плазмиды - кругов. Пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, названия эндонуклеаз рестрикции, использовавшихся для клонирования, указаны под названием плазмид курсивом, названия олигонуклеотидных праймеров показаны прямым шрифтом.
На Фигуре 4 показана карта экспрессионного вектора pCMV6-Entry (длина 4927 пар оснований). Используются следующие обозначения: CMV-promoter - цитомегаловирусный промотор, polyA - сигнал полиаденилирования гормона роста быка, ColE1 - бактериальная область начала репликации, f1 - область начала репликации бактериофага f1, Kan/Neo - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу с бактериальным промотором, обеспечивающая устойчивость бактерий к канамицину, SV40 - ранний промотор полиомавируса SV40, обеспечивающий экспрессию аминогликозид-3'-фосфотрансферазы в эукариотических клетках, что позволяет вести их селекцию антибиотиком G418. Направления транскрипции генов указаны стрелками.
На Фигуре 5 показана карта экспрессионной плазмиды pCMV6-Entry-CHO-VKORC1 (длина 5238 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 4, а также: CHOVKORC1 - ОРС гена VKORC1 китайского хомячка, Kozak - последовательность Козак, обеспечивающая инициацию трансляции в клетках эукариот. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 6 показана карта экспрессионной плазмиды pCMV6-Entry-h VKORC1 (длина 5244 пар оснований). Обозначения аналогично Фигуре 5. hVKORC1 - ОРС гена VKORC1 человека.
На Фигуре 7 показана схема получения экспрессионных плазмид p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и р1.2-Zeo-hVKORC1. Обозначения аналогично Фигуре 3
На Фигуре 8 показана карта экспрессионного вектора p1.2-Zeo (длина 11838 пар оснований). Используются следующие обозначения: pUC origin - область начала репликации плазмиды pUC; bla - открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; bla promoter - прокариотический промотер гена bla; EBVTR - участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); 5CHEF функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' НТО этого гена; 3CHEF функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' НТО этого гена; SV40 promoter - область промотора вируса SV40; SV40 рА, terminator - терминатор и сигнал полиаденилирования вируса SV40; zeoR - ген устойчивости к зеоцину. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 9 показаны зависимости уровней восстановления эпоксида витамина K1 (VK1>0) от концентрации лизатов (А) и времени реакции(В). Концентрация общего белка для зависимости уровня превращения VK1>0 от времени реакции - 0,81 мг/мл, время реакции для зависимости уровня превращения VK1>0 от концентрации общего белка в лизатах - 3 ч. Все уровни восстановления скорректированы на величину фонового уровня восстановления VK1>0 в отсутствие лизатов. Обозначения: с VKORC1 - лизат клеток, стабильно трансфицированных плазидой p1.2-Zeo-CHO-VKORCl; hVKORC1 - лизат клеток, стабильно трансфицированных плазидой p1.2-Zeo-h VKORC1; СНО DG-44 - лизат нетрансфицированных клеток линии СНО DG-44.
На Фигуре 10 показана оценка максимальной скорости реакции восстановления эпоксида витамина K1 (VK1>0), катализируемой VKORC1 китайского хомячка и человека. Время реакции - 3 ч. Обозначения аналогично Фиг.9.
На Фигуре 11 показаны результаты определения числа копий экспрессионных кассет, содержащих ОРС VKORC1 китайского хомячка и человека. Копийность генов нормализована на копийность опорного гена китайского хомячка PPIB с известной копийностью 1. Планкой погрешности обозначены стандартные отклонения, не менее трех параллельных определений для каждого образца. Относительная погрешность определения числа копий опорного гена не более 30% для всех образцов. Обозначения: Zeo - область ОРС маркера устойчивости к действию зеоцина, остальные обозначения аналогично Фиг.9.
На Фигуре 12 показаны относительные уровни мРНК оверэкспрессированных ОРС VKORC1 китайского хомячка и человека, нормализованные на уровень мРНК бета-актина. Планкой погрешности обозначены стандартные отклонения, не менее трех параллельных определений для каждого образца. Относительная погрешность определения уровня мРНК бета-актина не более 30% для всех образцов. Обозначения; "СНО DG-44 с" - амплификация при помощи праймеров к искусственному гену VKORC1 китайского хомячка; "СНО DG-44 h" - амплификация при помощи праймеров к ОРС VKORC1 человека, комплементарных ОРС эндогенной мРНК VKORC1 китайского хомячка и ОРС VKORC1 человека, остальные обозначения аналогично Фиг.9.
Существо и промышленная применимость изобретения в биотехнологии иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Получение плазмидной ДНК pAL-CHOVKORC1.
Из замороженной биомассы, содержащей 2 млн клеток CHO-DG44, реагентом TRI Reagent (MRC) была выделена РНК, растворена в воде с 0.5 мкг/мкл проверена на 1,2% ТАЕ агарозном геле. Синтез кДНК проводили набором MINT по протоколу производителя, используя 2 мкл РНК матрицы. Реакционная смесь 10 мкл была разбавлена в 2 раза водой и использована для амплификации кДНК набором Encycio PCR Kit по протоколу производителя. Состав реакционной смеси (10×PCR-буфер - 5 мкл; Encycio полимераза- 1 мкл, dNTP (по 10 мкМ каждого) - 1 мкл, M1-праймер (SEQ ID NO:7) - 10 мкM 2 мкл, первая цепь cDNA, разбавленная в 2 раза - 2 мкл, вода до 50 мкл). Режим амплификации: 95°С - 1 мин и 17 циклов: 95°С - 20 с/66°С - 15 с/72°С - 3 мин. кДНК очищали на колонке, элюировали 50 мкл 5 мМ tris-HCl pH 8.0, концентрация составила 25 нг/мкл. Амплифицированную кДНК перед использованием прогревали 65°С 1 мин, перемешивали, аликвоту разбавляли водой в 20 раз, использовали 1 мкл разбавленной кДНК на 25 мкл ПЦР-смеси. Вели ПЦР, используя праймеры vkof1, vkof2, vkor1 (SEQ ID NO:8-10).
ПЦР проводили при помощи смеси Tersus polymerase mix или Encycio PCR Kit no (ЗАО «Евроген») инструкции производителя на приборе РТС-100 Thermal Cycler («MJ Reseach», США). В параллельных экспериментах использовали реакционную смесь, содержавшую дополнительно 5% DMSO и не содержавшую DMSO. Режим амплификации: 1) 95°С - 3 мин и 39 циклов: 95°С - 20 с/градиент 52-65°С - 20 с/72°С -1 мин, финальная элонгация 72°С - 5 мин; 2) 1) 95°С - 3 мин, 30 циклов: 95°С - 20 с/ инкремент от 65°С с шагом 0,5°С/цикл - 20 с/72°С - 1 мин, 10 циклов: 95°С - 20 с/ 54°С - 20 с/72°С -1 мин, финальная элонгация 72°С - 5 мин.
Продукты ПЦР выделяли из 1% агарозного геля, используя набор реактивов «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США) по протоколу производителя, после чего лигировали в Т-вектор PAL-TA («Евроген», Россия) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора («Fermentas», Литва). Лигирование вели в объеме 10 мкл при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е. coli штамма DH5α, с генотипом F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 end A1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е. coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42С в течение 45 секунд и инкубировали на льду в течение 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOB и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. Затем переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара, и помещали в термостат на 18 часов при 37С. Колонии Е. coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и проводили выделение плазмидной ДНК набором реактивов «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя, первичную нуклеотидную последовательность области вставки полученной плазмиды pAL-CHOVKORC 1 определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12).
Последовательность ОРС гена, кодирующего фермент VKORC 1 клеток китайского хомячка DG44 согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Последовательность депонирована 03.04.2012 заявителем в GenBank JQ400047.1 Аминокислотная последовательность фермента VKORC 1 клеток китайского хомячка DG44 согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2. Последовательность ОРС белка депонирована заявителем в GenBank (03-APR-2012) AFG26681.1.
Полученную плазмиду pAL-CHOVKORC 1, содержащую ОРС гена VKORC 1 клеток китайского хомячка DG44, использовали для получения экспрессионных конструкций.
Пример 2. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pCMV6-Entry-CHO VKORC1.
При помощи адапторных праймеров AD-VKOR-BglRF и AD-CVKOR-AsiGRN2 (SEQ ID NO:13-14) и pAL-CHOVKORC1 в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC1 китайского хомячка с добавленными рестриктными сайтами для субклонирования. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA как описано в примере 1 с образованием pAL-CHOVKORC1-АВ, анализировали методом ПЦР с клонов и секвенированием области вставки, используя праймеры SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12).
Плазмиду pAL-CHOVKORC1-AB с подтвержденной первичной нуклеотидной последовательностью рестрицировали BglII. и AsiGI (изошизомер AgeI) переносили фрагмент, содержащий ОРС в вектор pCMV6-Entry (Кат №PS 100001 Origene, США, Фиг.4), рестрицированный BglII-XmaI, с образованием pCMV6-Entry-CHOVKORC1 (Фиг.5, SEQ ID NO:15). Для этого продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли набором реактивов Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System no методике производителя. Реакцию лигирования очищенных фрагментов и трансформацию лигатами клеток Е. со/г штамма DHSa вели как описано в примере 1. Трансформантов высевали на агаризованную среду с канамицином (30 мкг/1 мл агара). Е. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-VKOR-BglRF и AD-CVKOR-AsiGRN2(SEQ ID NO:13-14). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan (30 мкг/мл), проводили выделение плазмидной ДНК набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-VKOR-BglRF и AD-CVKOR-AsiGRN2 (SEQ ID NO:13-14).
Плазмидную ДНК pCMV6-Entry-CHOVKORCl (SEQ ID NO:15) для трансфекции нарабатывали в клетках Е. соli (штамм Stbl4, #11635018 «Invitrogen»). Клетки культивировали в 0.5 л среды ТВ-Kan (30 мкг/мл) 18 ч, и выделяли плазмиды набором EndoFree Plasmid MaxiKit («Qiagen», США) по протоколу производителя.
Полученную экспрессионную плазмиду pCMV6-Entry-CHOVKORC1, содержащую ОРС гена VKORC 1 клеток китайского хомячка DG44, использовали для получения стабильно трансфицированных поликлональных линий клеток СНО.
Пример 3. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pCMV6-Entry-hVKORC1.
При помощи праймеров AD-hVKO-BglF и AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO:16-17) и Origene clone SC 112318 (Origene, США), соответствующему кДНК VKORC 1 человека (GenBank ID NM_024006.4), в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC 1 человека человека с добавленными рестриктными сайтами для субклонирования. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA как описано в примере 1, с образованием pAL-hVKORC1-AB, анализировали методом ПЦР с клонов и секвенированием области вставки, используя праймеры SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12).
Плазмиду pAL-h VKORC 1-АВ с подтвержденной первичной нуклеотидной последовательностью рестрицировали BglII и AsiGI (Agel) и переносили фрагмент, содержащий ОРС, в вектор pCMV6-Entry (Кат №PS 100001 Origene, США Фиг.4), рестрицированный BglII-XmaI, с образованием pCMV6-Entry-hVKORCl (Фиг.6, SEQ ID NO:18). Для этого продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли с помощью набора реактивов Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System по методике производителя. Лигирование очищенных фрагментов и трансформацию лигатами клеток Е. coli штамма DH5α вели как описано в примере 1. Трансформантов высевали на агаризованную среду с канамицином (30 мкг/1 мл агара). Е. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-hVKO-BglFn AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO:16-17). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-hVKO-BglFn AD-hVKO-AsiGR (SEQ ID NO:16-17).
Плазмидную ДНК pCMV6-Entry-hVKORC1 (SEQ ID N0:18) для трансфекции нарабатывали в клетках E. coli (штамм Stbl4, #11635018 «Invitrogen»). Клетки культивировали в 0.5 л среды ТВ-Кап (30 мкг/мл) в течение 18 ч, и выделяли плазмиды набором EndoFree Plasmid MaxiKit («Qiagen», США) по протоколу производителя.
Полученную экспрессионную плазмиду pCMV6-Entry-hVKORC1, содержащую ОРС гена VKORC 1 человека, использовали для получения стабильно трансфицированных поликлональных линий клеток СНО.
Пример 4. Получение стабильно трансфицированных экспрессионными плазмидами pCMV6-Entry-CHOVKORC1 и pCMV6-Entry-hVKORC1 поликлональных линий клеток СНО.
Клетки эпителия яичника китайского хомячка (СНО), линия DG-44 (Invitrogen, США), были трансфицированы очищенными суперскрученными плазмидами pCMV6-Entry-CHOVKORCl (SEQ ID N0:15), pCMV6-Entry-hVKORC1 (SEQ ID NO:18) и pEGFP-N2 (Clontech Кат. №6081-1, последовательность в GenBank U57608); плазмиду pEGFP-N2, кодирующую зеленый флюоресцентный белок, использовали в качестве отрицательного контроля. Был использован трансфекционный реагент FugeneHD (Promega, США) и соотношение 15 млн клеток/60 мкг ДНК/180 мкл FugeneHD/30 мл культивационного объема. Смесь ДНК и трансфекционного реагента готовили по инструкции производителя трансфекционного реагента и добавляли в суспензионную культуру клеток в указанном выше соотношении, одинаковом для обеих плазмид. Через 48 часов культивации трансфицированных клеток в перемешиваемых колбах культуральную среду заменили на селективную среду, содержавшую 750 мкг/мл антибиотика G418 (Sigma-Aldrich, США) и меняли ее в дальнейшем каждые 3 дня центрифугированием/ресуспендированием осадка клеток. При достижении культурами плотности 1,2 млн кл./мл и доле жизнеспособных клеток более 70% считали культуры установившимися, снижали концентрацию G418 до 250 мкг/мл и проводили отбор образцов клеточной массы для анализа.
Пример 5. Определение удельной активности вариантов VKORC1 китайского хомяка и человека, находящихся под контролем промотора CMV.
Измерение активности проводили по модифицированной методике [Rost S, Fregin A, Ivaskevicius V, Conzelmann E, Hortnagel К, Pelz HJ, Lappegard К, Seifried E, Scharrer I, Tuddenham EG, Muller CR, Strom TM, Oldenburg J. Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2. Nature. 2004 Feb 5; 427(6974):537-4L].
2,3-эпоксид витамина K1 синтезировали из хинона витамина K1 (Sigma Aldrich, США) окислением перекисью водорода и очищали согласно [Max Tishler, Louis F. Fieser, and Norman L. Wendler. Hydro, Oxido and Other Derivatives of Vitamin K1 and Related Compounds. Journal of the American Chemical Society 1940 62 (10), 2866-2871].
Для измерения активности готовили раствор для лизиса клеток состава 25 мМ имидазола рН=7.6, 0.5% CHAPS, 50% глицерина, 5 мМ бензамидина и раствор для проведения ферментативной реакции состава: 25 мМ имидазола рН=7.6, 0.5% CHAPS, 5 мМ CaCl2, 5 мМ DTT, 8 мкМ 2,3-эпоксида витамина K1. Проводили лизис образцов, содержащих по 5 млн клеток, в объеме 500 мкл раствора для лизиса на 1 пробирку, ресуспендировали клетки до исчезновения видимых глазом частиц, инкубировали 30 мин на льду и разрушали клетки при помощи гомогенизатора Даунса. Лизат осветляли центрифугированием 2 мин на 4 тыс. об/мин, отбирали по 10 мкл супернатанта для измерения содержания общего белка по Брэдфорд, в качестве стандарта концентрации белка использовали раствор бычьего сывороточного альбумина. Готовили серию двукратных разведений полученного осветленного лизата в растворе для лизиса и отрицательный контроль - пробирку с 30 мкл раствора для лизиса. В пробирки с разведениями лизата вносили по 500 мкл полного раствора для проведения ферментативной реакции, перемешивали, инкубировали 1 ч в термоблоке при температуре 30°С. После этого вели экстракцию, внося по 660 мкл раствора для экстракции состава изопропанол:гексан (3:2). Из верхней фазы отбирали по 450 мкл в новые пробирки, экстракт полностью выпаривали в вакуумной центрифуге при комнатной температуре, вносили в пробирки по 30 мкл метанола, перемешивали на вортексе и разделяли формы витамина K1 при помощи обращенно-фазовой хроматографии. Использовали колонку Symmetry С 18 75×4.6 mm (Waters, США), метанол в качестве подвижной фазы, скорость потока 1 мл/мин, длина волны детекции - 254 нм, температура колонки - 30°С, объем инъекции - 20 мкл. Для калибровки хроматографической системы и в качестве стандарта количества вещества использовали растворы 2,3-эпоксида и хинона витамина K1 в метаноле. Результаты представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||
| Уровень активности VKORC1 для плазмид с промотором CMV | ||||
| Название плазмиды | Интактные клетки СНО DG-44 | pCMV6-Entry-CHOVKORC1 | pCMV6-Entry-hVKORC1 | Без лизата клеток |
| Концентрация общего белка в исследуемом лизате, мг/мл | 1,29 | 1,13 | 1,49 | - |
| Степень восстановления эпоксида витамина K1, % и доверительный интервал для р=0,05 | 1,019±0,022 | 0,872±0,291 | 0,932±0,022 | 0,646±0,05 |
| Удельная степень восстановления эпоксида витамина K1, %*мл/мг | 0,79 | 0,78 | 0,63 | - |
Выводы: при использовании плазмид с промотором CMV ферментативная активность VKORC1 в стабильно трансфицированных клетках практически не изменяется как для VKORC1 человека, так и для VKORC1 китайского хомячка.
Пример 6. Получение экспрессионных плазмидных ДНК p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и p1.2-Zeo-hVKORC1.
При помощи адапторных праймеров AD-CVKO-AbsIF и AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO:19-20) и pAL-СНО VKORC1 в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC1 китайского хомячка с добавленными рестриктными сайтами для субклонирования. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA как описано в примере 1 с образованием pAL-CHOVKORC1-AN, анализировали методом ПЦР с клонов и секвенированием области вставки, используя праймеры SP6 и T7prom (SEQ ID N0:11-12).
Полученную плазмиду pAL-CHOVKORC1-AN с подтвержденной первичной нуклеотидной последовательностью рестрицировали AbsI и NheI переносили фрагмент, содержащий ОРС в вектор p1.2Zeo (OOO "ЛМБТ", заявка на патент RU2013122048, Фиг.8), рестрицированный AbsI и NheI, с образованием p1.2Zeo-CHOVKORC1 (Фиг.1, SEQ ID NO:5). Для этого продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли набором «Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System». Реакцию лигирования очищенных фрагментов и трансформацию лигатами клеток Е. coli штамма DH5α вели как описано в примере 1. Бактерии после трансформации высевали на агаризованную среду с карбеницилином (50 мкг/1 мл агара). Е. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-CVKO-AbsIF и AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO:19-20). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Carb (50 мкг/мл), проводили выделение плазмидной ДНК набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-CVKO-AbsIF и AD-CVKO-NheIR (SEQ ID NO:19-20).
При помощи праймеров AD-hVKO-AbsIF и AD-hVKO-NheIR (SEQ ID NO:21-22) и плазмиды Origene clone SC 112318 (Origene, США), кодирующей кДНК VKORC1 человека (GenBank ID NM_024006.4) в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий ОРС VKORC1 человека с рестриктными сайтами для субклонирования. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA как описано в примере 1, с образованием pAL-hVKORC1-AN, анализировали методом ПЦР с клонов и секвенированием области вставки, используя праймеры SP6 и T7prom (SEQ ID NO:11-12).
Плазмиду pAL-hVKORC1-AN с подтвержденной первичной нуклеотидной последовательностью рестрицировали AbsI и NheI, переносили фрагмент, содержащий ОРС в вектор pl.2Zeo (ЛМБТ, заявка на патент RU2013122048, Фиг.8), рестрицированный AbsI и NheI, с образованием p1.2Zeo-hVKORC1 (Фиг.2, SEQ ID NO:6). Для этого продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле, выделяли набором «Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System». Реакцию лигирования очищенных фрагментов и трансформацию лигатами клеток Е. coli штамма DH5a. вели, как описано в примере 1. Бактерии после трансформации высевали на агаризованную среду с канамицином (30 мкг/1 мл агара). Е. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-hVKO-AbsIF и AD-hVKO-NheIR (SEQ Ю N0:21-22). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-hVKO-AbsIF и AD-hVKO-NheIR (SEQ ID NO:21-22).
Плазмидные ДНК p1.2Zeo-CHOVKORC1 и p1.2Zeo-hVKORC1 для трансфекции нарабатывали в клетках E. coli (штамм Stbl4, #11635018 «Invitrogen»). Клетки культивировали в 0.5 л среды TB-Carb (50 мкг/ мл) в течение 18 ч, и выделяли плазмиды с использованием набора EndoFree Plasmid MaxiKit («Qiagen», США) по протоколу производителя.
Полученные экспрессионные плазмиды p1.2Zeo-CHOVKORC1 (SEQ ID NO:5) и p1.2Zeo-hVKORCl (SEQ ID NO:6), содержащие соответственно ОРС гена VKORC1 китайского хомячка DG44 и ОРС гена VKORC1 человека, использовали для получения стабильно трансфицированных поликлональных популяций клеток СНО DG-44.
Пример 7. Получение стабильно трансфицированных экспрессионными плазмидами р1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и p1.2-Zeo-hVKORC1 поликлональных популяций клеток СНО DG-44, измерение активности VKORC1.
Трансфекцию клеток линии СНО DG-44 очищенными плазмидами p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и p1.2-Zeo-hVKORC1, кодирующими VKORC1 китайского хомячка и человека, соответственно, проводили, как указано в Примере 4. Получали стабильно трансфицированные культуры при помощи культивации в присутствии 400 мкг/мл антибиотика зеоцин до восстановления жизнеспособности клеток выше 85%. Измерение активности VKORC1 в лизате клеток проводили, как указано в Примере 5, с изменениями - выравнивали концентрацию общего белка в лизатах перед добавлением субстрата реакции и использовали несколько двукратных разведений лизата исследуемых клеток в буферном растворе для лизиса. Реакцию вели 3 ч, отбирали пробы с интервалом 30 мин. Результаты измерения активности VKORC1 при времени реакции 3 ч приведены в Таблице 2, зависимости скоростей восстановления эпоксида витамина K1 (VK1>0) от концентрации лизатов и времени реакции приведены на Фиг.9. Максимальную скорость VKORC1 китайского хомячка и человека оценивали, проводя реакцию восстановления VK1>0 с максимальными концентрациями лизатов клеток, результаты приведены на Фиг.10.
| Таблица 2 | |||
| Уровень активности VKORC1 для плазмид с промотором CHEF1 | |||
| Название плазмиды | Интактные клетки СНО DG-44 | p1.2-Zeo.CHO-VKORC1 | p1.2-Zeo-hVKORCl |
| Удельная активность VKORC1, % конверсии субстрата на 1 мг/мл общего белка за 1 ч | 0,38 | 9,21 | 3,03 |
| Относительный уровень увеличения активности VKORC1, раз | 1 | 24,2 | 8,0 |
| Примечание: расчеты удельной активности для линейных диапазонов зависимости уровня конверсии субстрата от концентраций общего белка. | |||
Выводы: Уровень ферментативной активности VKORC1 может быть повышен в 24 раза при оверэкспрессии аутологичного VKORC1 китайского хомячка и только в 8 раз при оверэкспрессии VKORC1 человека. Оба ортолога VKORC1 практически не подвержены термоинактивации или протеолитическому распаду в течение 3-х часов. Скорость восстановления VK1>0 линейно зависит от концентрации обоих ферментов в выбранном диапазоне концентраций общего белка в лизатах. Максимальная скорость реакции, развиваемая в присутствии избытка VKORC1 китайского хомячка приблизительно вдвое выше максимальной скорости реакции, катализируемой избытком VKORC1 человека.
Пример 8. Измерение числа копий экспрессионных плазмид p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и р1.2-Zeo-hVKORC1, введенных в геном клеток и уровней мРНК VKORC1 китайского хомячка и человека в трансфицированных клетках.
Количественный анализ копийности экспрессионной кассеты в геноме и уровня мРНК проводили методом ПНР в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием амплификатора iCycler iQ (Bio-Rad, США). Для ПЦР использовали готовую 5х реакционную смесь с горячим стартом, содержащую интеркалирующий краситель SYBR Green I, qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия). Каждую реакцию повторяли 3 раза в объеме 25 мкл, в 3-5 повторах.
Геномную ДНК выделяли из 0,5-5 млн клеток набором «Wizard SV Genomic DNA Purification System» (Promega, США) по инструкции производителя. Суммарную РНК выделяли из 0,5-5 млн клеток набором «RNeasy Mini Kit» (Qiagen, США) по инструкции производителя. Для приготовления образцов кДНК использовали по 1 мкг суммарной РНК и набор реактивов «Mint» (Евроген, Россия).
Для определения копийности экспрессионной кассеты в геноме в качестве матрицы использовали геномную ДНК и олигонуклеотидные праймеры, не гомологичные геномным последовательностям китайского хомячка. Для VKORC1 СНО использовали праймеры к С-концевой области ОРС VKORC1 СНО и нетранслируемой области экспрессионной плазмиды р1.2-Zeo-CHO-VKORC1 - RT-cVKOspC-F и RT-cVKOspC-R (SEQ ID NO:23-24). Для VKORC1 человека использовали уникальные праймеры к гену человека - RT-hVKOR-f RT-hVKOR-r (SEQ ID NO:25-26).
Для определения уровня экспрессии мРНК генов VKORC1 в качестве матрицы использовали кДНК и уникальные олигонуклеотидные праймеры, не гомологичные последовательностям китайского хомячка.
Для VKORC1 СНО использовали праймеры RT-cVKOspN-F и RT-cVKOspN-R (SEQ ID NO:27-28), комплементарные участкам двух соседних экзонов искусственного гена, кодируемого плазмидой p1.2-Zeo-CHO-VKORC1. Таким образом, короткий продукт ПЦР мог образовываться только с кДНК-матрицы p1.2-Zeo-CHO-VKORC1, но не с геномных копий p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 или природного гена VKORC1 или природной кДНК VKORC1.
Для VKORC1 человека использовали пару праймеров RT-hVKOR-f RT-hVKOR-r (SEQ ID NO:25-26), специфичных к последовательности гена человека, кодируемой плазмидой p1.2-Zeo-hVKORC1.
Для анализа геномной ДНК клеток обеих линий использовали пару праймеров к гену устойчивости к зеоцину - RT-Zeo-F и RT-Zeo-R (SEQ ID NO:29-30).
Для амплификации опорных генов, в случае ПЦР с геномной ДНК, использовали праймеры к области гена пептидил-пролил изомеразы В (циклофилина В), предположительно уникальной для генома СНО, RT-PPIB-F и RT-PPIB-R (SEQ ID NO:31-32), а в случае ПЦР с кДНК использовали праймеры к бета-актину СНО - RT-bACT-F и RT-bACT-R (SEQ ID NO:33-34).
Копийность экспрессионной кассеты определяли из калибровочной кривой, построенной для серийных разведений экспрессионных плазмид p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 для VKORC1 китайского хомячка и p1.2-Zeo-hVKORC1 для VKORC1 человека. Результаты ПЦР сравнивали с результатами для контрольного ампликона, представленного в геноме клеток СНО только один раз по поисковой выдаче алгоритма BLAST из базы данных NCBI Nucleotide Collection. При анализе уровней экспрессии мРНК было установлено, что эффективность ПЦР составляет не менее 99% для всех использованных пар праймеров, вычисление относительных концентраций мРНК проводили по формуле C=2^(-CT), где СТ - пороговый цикл амплификации.
Выводы: Для обеих плазмид p1.2-Zeo-CHO-VKORC1 и p1.2-Zeo-hVKORC1 число копий экспрессионных кассет в геноме клеток составляет около 6 и не различается при амплификации областей ОРС VKORC1 и ОРС гена устойчивости к зеоцину (фиг.11). Уровень мРНК VKORC1 человека и китайского хомячка различается не более, чем в 1,33 раза (фиг.12). Таким образом, повышенная ферментативная активность оверэкспрессированного VKORC1 китайского хомячка определяется собственными свойствами фермента, а не большей эффективностью трансфекции или лучшим уровнем транскрипции искусственного гена.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Список последовательностей приведен в графической части.
Claims (12)
1. Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, в следующей последовательности, по существу, содержащая следующие элементы:
- область начала репликации плазмиды pUC;
- открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину;
- прокариотический промотор гена bla;
- участок терминального повтора вируса Эпштейна-Барр человека;
- функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 5′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген;
- область, кодирующая последовательность Козак для кэп-зависимой инициации трансляции;
- ОРС гена субъединицы 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина К (VKORC1) китайского хомячка со стоп-кодоном;
- функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 3′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген;
- промотор ранних генов вируса SV40;
- ген устойчивости к селекционному агенту; и
- сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40.
- область начала репликации плазмиды pUC;
- открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину;
- прокариотический промотор гена bla;
- участок терминального повтора вируса Эпштейна-Барр человека;
- функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 5′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген;
- область, кодирующая последовательность Козак для кэп-зависимой инициации трансляции;
- ОРС гена субъединицы 1 комплекса 2,3-эпоксиредуктазы витамина К (VKORC1) китайского хомячка со стоп-кодоном;
- функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 3′ нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген;
- промотор ранних генов вируса SV40;
- ген устойчивости к селекционному агенту; и
- сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40.
2. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанная субъединица VKORC1 китайского хомячка содержит последовательность аминокислот, представленную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.
3. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанной ОРС гена VKORC1 китайского хомячка является фрагмент ДНК, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1
4. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанным геном устойчивости к селекционному агенту является ген устойчивости к зеоцину.
5. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанной плазмидой является плазмида p 1.2-Zeo-CHO-VKORC1, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:5.
6. Клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом, трансформированная плазмидой по п.1.
7. Клетка по п.7, отличающаяся тем, что указанной клеткой является клетка СНО DG44.
8. Клетка по п.7, отличающаяся тем, что указанный белок с Gla-доменом выбран из группы, состоящей из факторов свертывания крови, таких как (протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянтов, таких как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранных Gla-белков (TMGPs).
9. Клетка по п.7, отличающаяся тем, что указанной плазмидой является плазмида p 1.2-Zeo-CHO-VKORC1, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:5.
10. Способ получения белка с Gla-доменом, включающий стадии культивирования клетки по п.7 в питательной среде и выделения полученного белка с Gla-доменом из культуральной жидкости.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что культивируют клетки СНО DG44/p 1.2-Zeo-CHO-VKORC1.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный белок с Gla-доменом выбран из группы, состоящей из факторов свертывания крови, таких как (протромбин или фактор II, факторы VII, IX, X; антикоагулянтов, таких как белок С, белок S, белок Z; остеокальцин или Gla-белок кости, матриксный Gla-белок кости (MGP); белок регулятор клеточного цикла Gas6 (growth arrest specific gene 6 protein) и трансмембранных Gla-белков (TMGPs).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013131441/10A RU2535871C1 (ru) | 2013-07-10 | 2013-07-10 | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013131441/10A RU2535871C1 (ru) | 2013-07-10 | 2013-07-10 | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2535871C1 true RU2535871C1 (ru) | 2014-12-20 |
Family
ID=53286161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013131441/10A RU2535871C1 (ru) | 2013-07-10 | 2013-07-10 | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2535871C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720934C2 (ru) * | 2015-10-07 | 2020-05-14 | Бионтэк Рна Фармасьютикалз Гмбх | Последовательности 3'-utr для стабилизации рнк |
| RU2825292C1 (ru) * | 2019-09-06 | 2024-08-23 | Новартис Аг | Терапевтические слитые белки |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2004136574A (ru) * | 1997-05-01 | 2006-05-27 | Айкос Корпорейшен (Us) | Транскрипционная регуляторная днк гена хомяка ef-1 |
| WO2006063292A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Icos Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| WO2006067116A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Expression of gamma-carboxylated polypeptides in gamma-carboxylation deficient host systems |
| US20060194284A1 (en) * | 2005-02-28 | 2006-08-31 | Baxter International Inc. | Recombinant co-expression of vitamin K epoxide reductase subunit 1 to improve vitamin K dependent protein expression |
-
2013
- 2013-07-10 RU RU2013131441/10A patent/RU2535871C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2004136574A (ru) * | 1997-05-01 | 2006-05-27 | Айкос Корпорейшен (Us) | Транскрипционная регуляторная днк гена хомяка ef-1 |
| WO2006063292A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Icos Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| WO2006067116A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Expression of gamma-carboxylated polypeptides in gamma-carboxylation deficient host systems |
| US20060194284A1 (en) * | 2005-02-28 | 2006-08-31 | Baxter International Inc. | Recombinant co-expression of vitamin K epoxide reductase subunit 1 to improve vitamin K dependent protein expression |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XU X. et al., The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line, Nature Biotechnology, v.29, n.8, p. 735-741. GenBank N * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720934C2 (ru) * | 2015-10-07 | 2020-05-14 | Бионтэк Рна Фармасьютикалз Гмбх | Последовательности 3'-utr для стабилизации рнк |
| US11492628B2 (en) | 2015-10-07 | 2022-11-08 | BioNTech SE | 3′-UTR sequences for stabilization of RNA |
| US12516333B2 (en) | 2015-10-07 | 2026-01-06 | BioNTech SE | 3′-UTR sequences for stabilization of RNA |
| RU2825292C1 (ru) * | 2019-09-06 | 2024-08-23 | Новартис Аг | Терапевтические слитые белки |
| RU2837545C1 (ru) * | 2019-09-06 | 2025-04-01 | Новартис Аг | Терапевтические слитые белки |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8304224B2 (en) | Compositions and methods relating to proteins requiring gamma-carboxylation | |
| AU2008205445A1 (en) | Method for producing gamma-carboxlated proteins | |
| KR20150014941A (ko) | 아이소프렌의 생산을 위한 미생물유기체 및 방법 | |
| JP2008507970A (ja) | アラニン２，３アミノムターゼ | |
| KR100983878B1 (ko) | 유전자 재조합 기술에 의한 인간 트롬빈 제조 방법 | |
| CN102471794B (zh) | 提高维生素k依赖性蛋白质的表达产量的方法 | |
| KR20130025952A (ko) | 비타민 ｋ 의존성 단백질 발현의 개선을 위한 비타민 ｋ 에폭사이드 환원효소 소단위 １의 재조합 동시발현 | |
| RU2535871C1 (ru) | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом | |
| EP2436765B1 (en) | Recombinant factor X with no glycosylation and method for preparing the same | |
| EP2820141A2 (en) | Novel oxidoreductases for enantioselective reactions | |
| RU2585532C2 (ru) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека и способ получения указанного фактора | |
| Guarna et al. | Effect of cDNA copy number on secretion rate of activated protein C | |
| JP2020501525A (ja) | グルタチオンレダクターゼ | |
| US20160215278A1 (en) | Method for mass production of factor vii/viia derivatives | |
| US8013137B2 (en) | Modified enteropeptidase protein | |
| US20210261911A1 (en) | Microorganisms engineered for muconate production | |
| Lameira | Structural Insights, Biochemical Characterization and Physiological Role of Pyruvate: Quinone Oxidoreductase in Corynebacterium glutamicum | |
| Da Silva Lameira | Structural insights, biochemical characterization and physiological role of pyruvate: quinone oxidoreductase in Corynebacterium glutamicum | |
| AU2008202376B2 (en) | Process for producing human thrombin by gene modification technique | |
| JP2006280368A (ja) | 有機酸の製造法 | |
| GB2498705A (en) | Recombinant Alternative Oxidase | |
| HK1155475B (en) | Method for producing gamma-carboxylated proteins | |
| BR112017024123B1 (pt) | Células de levedura de pichia metilotrófica compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante, e método para expressão de um polipeptídeo heterólogo em uma célula |