RU2535159C1 - Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с пептидогликаном - Google Patents
Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с пептидогликаном Download PDFInfo
- Publication number
- RU2535159C1 RU2535159C1 RU2013138199/15A RU2013138199A RU2535159C1 RU 2535159 C1 RU2535159 C1 RU 2535159C1 RU 2013138199/15 A RU2013138199/15 A RU 2013138199/15A RU 2013138199 A RU2013138199 A RU 2013138199A RU 2535159 C1 RU2535159 C1 RU 2535159C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- component
- activity
- peptidoglycan
- enzyme
- complement component
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущность изобретения состоит в том, что в лунках микропанели сорбируют препарат пептидогликана, затем вносят пробу, содержащую компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии ЭДТА, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C3 человека и субстрат этого фермента, расчет активности компонента C3 проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор для определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пептидогликана, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью C3 в качестве стандарта. Группа изобретений позволяет определять функциональную активность компонента C3 системы комплемента человека и обладает хорошей воспроизводимостью результатов. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил.
Description
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.
Известен способ определения функциональной активности компонента C3 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропанели комплемента морской свинки, служащего в качестве источника компонентов C1, C2 и C4 (присутствующий компонент C3 морской свинки не обнаруживается специфическими антителами против C3 человека) и анализируемой пробы, содержащей компонент C3 человека с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит связывание C3 на молекулах активатора - сорбированного иммуноглобулина. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C3 человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C3, конъюгированных с ферментом.
Известен также способ [2], позволяющий определять функциональную активность компонента C3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата дерината для использования в качестве активатора классического пути комплемента и заменой комплемента морской свинки гомологичным реагентом R3 - сыворотки крови человека, лишенной активности C3.
Наконец, для активации компонента C3, необходимой для связывания на микропанели с последующим определением количества связавшегося теми же приемами, в способе [3] используется альтернативная C3 конвертаза, формируемая в результате активации альтернативного пути с помощью сорбируемого на микропанели лизоцима - активатора альтернативного пути и реагента R3, как источника факторов В и D человека, необходимых для формирования C3 конвертазы альтернативного пути комплемента.
Недостатком всех этих способов является участие в процессе активации компонента C3, C3 конвертазы, формируемой из компонентов комплемента морской свинки в первом случае либо из компонентов или факторов комплемента реагента R3, во втором и в третьем случаях, поскольку при проведении определения активности компонента C3 в сыворотках крови неизбежно создаются условия активации комплемента по классическому или альтернативному пути, что затрагивает и другие компоненты комплемента и может приводить к их неспецифической сорбции на поверхности лунок микропанели.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента C3 комплемента человека в условиях отсутствия активации ни одного из путей комплемента и не требующего участия других компонентов комплемента и не затрагивающего их, если они присутствуют в анализируемой пробе.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели препаратов, содержащих пептидогликан, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ЭДТА для блокирования всех путей активации комплемента, в ходе которой происходит связывание C3 на сорбированном пептидогликане, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента C3 человека, отмывание несвязавшегося конъюгата, внесение субстрата конъюгированного фермента и проведение расчета активности компонента C3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Тем самым достигается определение функциональной активности C3 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.
Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным пептидогликаном, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью C3 в качестве стандарта.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости активации всей системы комплемента.
В основе предлагаемого способа лежит обнаруженная способность препаратов пептидогликана прочно и одинаково связывать (по-видимому, ковалентно) только функционально активные молекулы компонента C3, которая не зависит от наличия в среде солей кальция и магния, необходимых для активации классического и лектинового путей, только магния для альтернативного пути, а также в среде с ЭДТА, когда отсутствие ионов кальция и магния полностью блокирует возможность активации комплемента.
Иммуномодулирующие свойства пептидогликана известны давно [4, 5]. В 1983 г. было впервые показано, что пептидогликан из Lactobaccilus bulgaricus (бластолизин) активирует альтернативный путь комплемента [6], и тем самым было доказано, что иммуномодулирующие свойства пептидогликанов из клеточных стенок бактерий обусловлены его воздействием на систему комплемента. Кроме того, в литературе неоднократно публиковались работы, посвященные иммуномодулирующей активности пептидогликанов. В частности, это касалось свойств препарата иммуномакса [7, 8], представляющего собой кислый пептидогликан растительного происхождения.
Пример 1. Определение функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Пептидогликан - аптечный препарат иммуномакс в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, с конечной концентрацией 5-20 мкг/мл вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый компонент C3 в том же буфере. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против C3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного компонента C3 рассчитывают по стандартной кривой (рис.1), где представлено определение активности компонента C3 комплемента человека иммуноферментным методом на иммуномаксе. (R2=0.98).
Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента C3. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пептидогликана, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известным содержанием активного компонента C3 в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.
Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента C3 и позволяет достоверно определять функциональную активность компонента C3 в количествах от 1 нг описанным способом с использованием описанного набора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека по классическому пути. 2005. Патент РФ 2251397. Бюл. №13. 10.05.2005.
2. Козлов Л.В., Гора Н.В., Бичучер A.M. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека. Патент РФ 2417375. Бюл. №12. 27.04.2011.
3. Козлов Л.В., Гора Н.В. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека по альтернативному пути активации. Патент 2380707. 27.01.2010.
4. White R.G., Bernstock L., Johns R.G.S., Lederer E. The influence of components of M. tuberculosis and other Mycobacteria upon antibody production to ovalbumin. Immunology. 1958. V.1. P.54-66.
5. Ellouz F., Adam A., Ciorbaru R., Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1974. V.59. No.4. P.1317-1325.
6. Козлов Л.В., Зинченко А.А., Соляков Л.С., Сизой М.Н., Ищенко A.M., Мартюшин С.В., Андреев С.В. Механизм активации комплемента человека иммуностимуляторами из клеточных стенок бактерий. Биоорган. химия. 1983. Т.9. №8. С.1047-1055.
7. Атауллаханов Р.И.; Пичугин А.В.; Хаитов P.M. Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью, вещество, полученное этим способом, и фармацевтическая композиция на его основе. Патент 2195308. 27.12.2002.
8. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Шишкова Н.М., Мастернак Т.Е., Малкина Е.Ю., Ульянова Л.И., Стеценко О.Н. Клеточные механизмы иммуномодулирующего действия препарата иммуномакса. Иммунология. 2005. №2. С.111-120.
Claims (3)
1. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели препарат пептидогликана, затем в лунки микропанели вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии ЭДТА, выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве пептидогликана используют аптечный препарат иммуномакс.
3. Набор для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пептидогликана, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С3 в качестве стандарта.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013138199/15A RU2535159C1 (ru) | 2013-08-16 | 2013-08-16 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с пептидогликаном |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013138199/15A RU2535159C1 (ru) | 2013-08-16 | 2013-08-16 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с пептидогликаном |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2535159C1 true RU2535159C1 (ru) | 2014-12-10 |
Family
ID=53285830
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013138199/15A RU2535159C1 (ru) | 2013-08-16 | 2013-08-16 | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с пептидогликаном |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2535159C1 (ru) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2162604C1 (ru) * | 1999-05-26 | 2001-01-27 | Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского | Способ определения дефицитов изотипов с4а и с4в компонента комплемента человека |
US6221657B1 (en) * | 1995-09-08 | 2001-04-24 | Imutran Limited | Modified human C3 DNA sequences and vectors |
RU2195664C2 (ru) * | 2000-07-25 | 2002-12-27 | Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского | Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека |
RU2458346C1 (ru) * | 2010-12-29 | 2012-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1-ингибитора по альтернативному пути |
-
2013
- 2013-08-16 RU RU2013138199/15A patent/RU2535159C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6221657B1 (en) * | 1995-09-08 | 2001-04-24 | Imutran Limited | Modified human C3 DNA sequences and vectors |
RU2162604C1 (ru) * | 1999-05-26 | 2001-01-27 | Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского | Способ определения дефицитов изотипов с4а и с4в компонента комплемента человека |
RU2195664C2 (ru) * | 2000-07-25 | 2002-12-27 | Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского | Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека |
RU2458346C1 (ru) * | 2010-12-29 | 2012-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1-ингибитора по альтернативному пути |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2191111A1 (en) | Immunoassay for the determination of high molecular weight antigens | |
RU2417375C2 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
JP6743322B2 (ja) | 生体試料中の(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法、(1→3)−β−D−グルカン分析用キット、及び(1→3)−β−D−グルカンの免疫学的分析方法に使用するための生体試料用アルカリ前処理液 | |
RU2232991C1 (ru) | Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
RU2380707C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
RU2195662C1 (ru) | Способ определения функциональной активности c1-ингибитора комплемента человека | |
RU2535159C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с пептидогликаном | |
RU2506594C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
RU2232992C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
RU2376606C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека | |
RU2571289C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с лизоцимом | |
RU2495432C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека | |
RU2376605C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
RU2425383C1 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2374650C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора в комплемента человека | |
RU2450275C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по альтернативному пути | |
RU2413224C1 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C1q КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2232993C1 (ru) | Способ определения функциональной активности фактора b комплемента человека | |
RU2251697C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека по классическому пути активации | |
RU2195670C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c2 комплемента человека | |
RU2457491C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по классическому пути | |
CN105223355A (zh) | 临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒 | |
RU2464566C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного количественного определения с1 ингибитора комплемента человека | |
RU2235329C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ Clr2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2195664C2 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170817 |