RU2504781C1 - Способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии штаргардта - Google Patents
Способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии штаргардта Download PDFInfo
- Publication number
- RU2504781C1 RU2504781C1 RU2012138733/15A RU2012138733A RU2504781C1 RU 2504781 C1 RU2504781 C1 RU 2504781C1 RU 2012138733/15 A RU2012138733/15 A RU 2012138733/15A RU 2012138733 A RU2012138733 A RU 2012138733A RU 2504781 C1 RU2504781 C1 RU 2504781C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- abca4
- patient
- macular degeneration
- disposition
- stargardt
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта. Фибробласты кожи, взятые у пациента, культивируют и обрабатывают вирусными конструкциями, несущими гены Oct4, Sox2 и Klf4 под контролем CMV промотера. Осуществляют направленную дифференцировку фибробластов в клетки ретины. Из клеток ретины выделяют кодирующую РНК гена АВСА4. По наличию делеции в экзоне 39-41 гена АВСА4 диагностируют предрасположенность пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта. Изобретение позволяет эффективно диагностировать предрасположенность пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта по наличию делеции в экзоне 39-41 гена АВСА4. 3 ил., 1 табл., 1 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Из существующего уровня техники известно, что генетические мутации могут существенным образом влиять на проявление генов и приводить к заболеваниям, связанным с потерей зрения. Основными типами тканей, которые подвержены патологиям систем зрения, является эпителий ретины и фоторецепторы сетчатки глаза. Определить структуру генов, проявляющихся в патологических тканях, не представляется возможным в связи с инвазивностью процесса взятия материала глаза и возможно чрезвычайно низким уровнем проявлением генов. Настоящее техническое решение позволяет существенно снизить инвазивность и травматичность диагностических процедур по определению генетических особенностей заболеваний глаза.
Наиболее близким к заявленному техническому решению является US 2010299765, опубл. 2010-11-25. В патенте приведен способ получения клеток сетчатки глаза, из эмбриональных стволовых клеток человека. В результате использования определенных условий культивирования методами направленной дифференцировки заявленным способом получаются клетки пигментированного эпителия ретины и фоторецепторные предшественники сетчатки глаза пригодные для трансплантации. Однако, первичным источником клеток являются аллогенные эмбриональные стволовые клетки. В связи с этим, основным недостатком данного технического решения, который не позволяет использовать полученную культуру сетчатки глаза для диагностики, является использование эмбриональных стволовых клеток, которые затруднительно получать для живущих людей, страдающих наследственными дефектами зрения. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка способа диагностики генетических мутаций клеток глаза человека, получаемых из фибробластов кожи.
Новым техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является возможность проведения диагностики мутаций генов, характерных для пигментированных клеток ретины и фоторецепторов, не прибегая к инвазивному взятию материала клеток глаза живого человека.
Для этого предложен способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта, включающий взятие фибробластов кожи у этого пациента, их культивирование и обработку вирусными конструкциями, несущими гены Oct4, Sox2 и Klf4 под контролем CMV промотера, последующее культивирование для направленной дифференцировки фибробластов в клетки ретины и дальнейшее исследование клеток ретины на наличие мутации в экзоне 39-41 гена АВСА4, и по наличию делеции в этом экзоне диагностируют предрасположенность пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта.
Т.е., в заявленном способе фибробласты кожи репрограммируются генетическими факторами, позволяющими дифференцировать клеточную популяцию в клетки эпителия ретины и фоторецепторы глаза, экспрессирующие нормальные и мутантные гены, специфические для проведения генетических тестов с помощью полимеразной цепной реакции.
Описание способа диагностики
В качестве модельной системы были использованы фибробласты кожи людей с проявлением заболевания Штаргардта. В процессе индивидуального развития у этих людей происходит постепенная потеря зрения вплоть до полной слепоты. В основном, заболевание связано с мутациями в гене АВСА4, однако известно ограниченное количество генетических мутаций (http://www.med-gen.ru/science/staff/dnklab/). Поиск новых мутаций, которые могут не затрагивать структурную часть гена может быть затруднен или невозможен в связи с недоступностью эпителия ретины и фоторецепторов для анализа. ДНК фибробластов кожи пациентов носителей Штаргардта была проанализирована на наличие известных мутаций с негативным результатом. Для обнаружения мутаций необходимо исследовать кодирующую РНК известных генов, например АВСА4, на долю которого приходится до 70% известных мутаций. Однако эта РНК обнаруживается только в специализированных клетках ретины. Для получения специализированных клеток ретины фибробласты кожи культивировали в DMEM (ПанЭко, РФ), 15% фетальная бычья сыворотка (FBS) (Hyclone, США), 2 мМ глутамин (Hyclone, США), 50 ед./мл пенициллин-стрептомицин (ПанЭко, РФ). Через 2 недели после культивирования 4×104 клеток обработываются вирусными конструкциями, несущими гены Oct4, Sox2 и Klf4 под контролем CMV промотера (1). Клетки далее культивируются в среде DMEM/F12 (Hyclone, США), 20% Serum replacement (Invitrogen, США), 2 мМ L-глутамин (Hyclone, США), 0.1 мМ β-меркаптоэтанол (Sigma-Aldrich, США), 1% смесь аминокислот (Hyclone, США), bFGF 4 нг/мл (PeproTech, США), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл) (ПанЭко, РФ) до образования колоний (Фиг.1) Через 10 дней образовавшиеся колонии переносятся в дифференцировочную среду: DMEM/F12 с добавлением N2 саплемента, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 150 mM аскорбиновой кислоты, 3% фетальная бычья сыворотка (FBS) (Hyclone, США) (2) и культивирование продолжается еще 3 недели. Через 3 недели на чашках формируется характерный слой окрашенных клеток (Фиг.2). Тотальная РНК из клеточных культур выделяется с помощью MiniRNA kit (Qiagen, США) согласно прилагающимся инструкциям. Обработку ДНКазой осуществляется непосредственно на колонках, с использованием прилагающихся к набору MiniRNA kit ДНКазы и буфера. Реакцию обратной транскрипции проводится с использованием случайных шестинуклеотидных праймеров (Amersham Biosciences, США), M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, США), Ribonuclease Inhibitor (Promega, США), dNTPs (Fermentas, США) согласно прилагающимся инструкциям. На одну реакцию берется 0.5-1 мкг тотальной РНК. Для проведения ПЦР-амплификации продуктов реакции обратной транскрипции берется 0.05-0.1 часть реакционной смеси. ПЦР-амплификацию проводят с помощью ScreenMix (Евроген, РФ) согласно инструкциям производителя. Список использованных в работе праймеров приведен в таблице.
Таблица | |
название | последовательность 3′-5′ |
ABCA4-Pr1-Dir | ctcttaacggcgtttatgtc |
ABCA4-Pr1-Rev | tggatcaatgcattacaaaa |
ABCA4-Pr1-Seq1 | ttggcatacagagtgtcttcta |
ABCA4-Pr1-Seq2 | gggtatatcgagattttcaaga |
ABCA4-Pr1-1-IN-1 | cctcagctctgaccaatct |
ABCA4-Pr1-1-IN-2 | gtagggtgccctgggagag |
ABCA4-Pr1-2-IN-1 | ctcatgaatgcaccagaga |
ABCA4-Pr1-2-IN-2 | gataggatccttccttgtgg |
ABCA4-Pr2-Dir | agagacctttacaaagctgatg |
ABCA4-Pr2-Rev | gtcgctgtaatgtaggattctt |
ABCA4-Pr2-Seq1 | gtctatgtccattcggatctta |
ABCA4-Pr2-Seq2 | acacagatgaacatgatcagag |
ABCA4-Pr2-1-IN-1 | ctgtctgacctcctgtgtg |
ABCA4-Pr2-1-IN-2 | gggtggtagagagctggt |
ABCA4-Pr2-2-IN-1 | ggaacccaacagtaaaagact |
ABCA4-Pr2-2-IN-2 | catgatgaatatcgtcagga |
ABCA4-Pr3-Dir | ggatctactctgtctccatgac |
ABCA4-Pr3-Rev | gataggtcctgagcctcttc |
ABCA4-Pr3-Seq1 | ctctttcttctctggttgaaca |
ABCA4-Pr3-Seq2 | gttcgctttgaagagcaag |
ABCA4-Pr3-1-IN-1 | aagagcatcgtcttggaga |
ABCA4-Pr3-1-IN-2 | caagccaatacgactcttgt |
ABCA4-Pr3-2-IN-1 | ctgcagtggagcaacatc |
ABCA4-Pr3-2-IN-2 | attccgcttgtggtggag |
ABCA4-Pr4-Dir | gaagggacattgaaaccag |
ABCA4-Pr4-Rev | caaaaggagggataacaataga |
ABCA4-Pr4-Seq1 | ttcttatttggaagaaggaaga |
ABCA4-Pr4-Seq2 | gaaggctctactgctcagg |
ABCA4-Pr4-1-IN-1 | cagagccttggcatgtgtc |
ABCA4-Pr4-1-IN-2 | aagttcttgaccaatgcactcc |
ABCA4-Pr4-2-IN-1 | ccactcttcctgaagaactgct |
ABCA4-Pr4-2-IN-2 | agaaagcatcagagccaaaaac |
ABCA4-Pr5-Dir | aagagattccaacacaccatc |
ABCA4-Pr5-Rev | gaaggttttctggagaagtgta |
ABCA4-Pr5-Seq1 | cacaccttaatgttgtcttcag |
ABCA4-Pr5-Seq2 | cacggaaattctacaagacct |
ABCA4-Pr5-1-IN-1 | cggctacctttgtgttttt |
ABCA4-Pr5-1-IN-2 | ttgtcttcagtttctagatgttta |
ABCA4-Pr5-2-IN-1 | acaagacctgacggacaggaac |
ABCA4-Pr5-2-IN-2 | tttcttctgaaacccgatgaag |
ABCA4-Pr6-Dir | aggtgtggtttaataacaaagg |
ABCA4-Pr6-Rev | ggcataaaggtaaagatgttct |
ABCA4-Pr6-Seq1 | agggtcaggaggaagtacac |
ABCA4-Pr6-Seq2 | tacacttctccagaaaaccttc |
ABCA4-Pr6-1-IN-1 | cctggtcagctttctcaat |
ABCA4-Pr6-1-IN-2 | accatggcaaacaggttc |
ABCA4-Pr6-2-IN-1 | actgctcctgctgtatggatg |
ABCA4-Pr6-2-IN-2 | aagatgttctcgtcctgtgagc |
ABCA4-Pr7-Dir | caaaacaaccacattcaagat |
ABCA4-Pr7-Rev | tatttttccatgaaaatcacac |
ABCA4-Pr7-Seq1 | ctggagcatgttgtagtgc |
ABCA4-Pr7-Seq2 | atgctgtggaacgtcatc |
ABCA4-Pr7-1-IN-1 | aagatgctcactggggacac |
ABCA4-Pr7-1-IN-2 | gtagtgcctctccctctgcac |
ABCA4-Pr7-2-IN-1 | gctgtggtcctcacatcc |
ABCA4-Pr7-2-IN-2 | acacagacaaacatgcagaa |
ABCA4-RT-Ex3-AS-Dir | tgtggcctttatctttatttct |
ABCA4-RT-Ex3-AS-Rev | gatgtgtagctctgtccaaata |
Амплификацию соответствующих фрагментов проводят в режиме 95°C - 3 мин, затем в течение 35 циклов: 94°C - 1 мин, 55°C - 1 мин, 72°C - 1 мин. После этого определяется полная нуклеотидная последовательность, полученного набора фрагментов и сравнивается с известной последовательностью гена АВСА4 (Фиг.3). Отсутствие комплементарных нуклеотидов свидетельствует о мутации гена.
При клинических испытаниях предлагаемого способа диагностики были обследованы 8 здоровых человека и 3 пациентов с клиническими признаками макулодистрофии Штаргардта. В результате этого среди пациентов с макулодистрофии Штаргардта был обнаружен носитель мутации в гетерозиготе с делецией 39-41 экзонов, среди здоровых ни одного носителя таких генотипов выявлено не было.
Определяющим существенным отличием заявляемого способа по сравнению с прототипом является использование индивидуальных клеток ретины, полученных после обработки фибробластов кожи вирусными векторами и применение дифференцировочной среды для получения клеток ретины.
Список литературы.
1. Shutova M, Chestkov I, Bogomazova A, Lagarkova M, Kiselev S.L., Generation ofiPS cells from human umbilical vein endothelial cells by lentiviral transduction, and their differentiation to neuronal lineage. In: Kaiming Ye and Sha Jin (eds.). Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols, Springer Protocols Handbooks, DOI 10.1007/978-1 -61779-267-OJ 1, © Springer Science+Business Media, LLC 2011
2. M.A. Lagarkova, M.V. Shutova, A.N. Bogomazova, E.M. Vassina, E.A. Glazov, P Zang., A.A Rizvanov., I.V. Chestkov., S.L. Kiselev. Induction ofpluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale // Cell Cycle. 2010 Mar; 9(5):937-46.
Claims (1)
- Способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта, включающий взятие фибробластов кожи у этого пациента, их культивирование и обработку вирусными конструкциями, несущими гены Oct4, Sox2 и Klf4 под контролем CMV промотера, последующее культивирование для направленной дифференцировки фибробластов в клетки ретины и дальнейшее исследование клеток ретины на наличие мутации в экзоне 39-41 гена АВСА4, и по наличию делеции в этом экзоне диагностируют предрасположенность пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012138733/15A RU2504781C1 (ru) | 2012-09-11 | 2012-09-11 | Способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии штаргардта |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012138733/15A RU2504781C1 (ru) | 2012-09-11 | 2012-09-11 | Способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии штаргардта |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2504781C1 true RU2504781C1 (ru) | 2014-01-20 |
Family
ID=49948059
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012138733/15A RU2504781C1 (ru) | 2012-09-11 | 2012-09-11 | Способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии штаргардта |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2504781C1 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090029930A1 (en) * | 1997-02-27 | 2009-01-29 | Utah, University Of, Research Foundation | Methods of gene therapy using nucleic acid sequences for ATP-binding cassette transporter |
-
2012
- 2012-09-11 RU RU2012138733/15A patent/RU2504781C1/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090029930A1 (en) * | 1997-02-27 | 2009-01-29 | Utah, University Of, Research Foundation | Methods of gene therapy using nucleic acid sequences for ATP-binding cassette transporter |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
LAGARKOVA M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. Cell Cycle. 2010 Mar 1; 9(5):937-946. Epub 2010 Mar 6. [Найдено 18.06.2013] [онлайн], Найдено из Интернета: <URL:http://www.orphanresearch.com/journals/cc/18-LagarkovaCC9-5.pdf>. * |
SHUTOVA M.V. et al. Generation of iPS cells from human umbilical vein endothelial cells by lentiviral transduction, and their differentiation to neuronal lineage. Kaiming Ye and Sha Jin (eds.), Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols, Springer Protocols Handbooks. 2011; p.133-149. * |
SHUTOVA M.V. et al. Generation of iPS cells from human umbilical vein endothelial cells by lentiviral transduction, and their differentiation to neuronal lineage. Kaiming Ye and Sha Jin (eds.), Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols, Springer Protocols Handbooks. 2011; p.133-149. LAGARKOVA M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. Cell Cycle. 2010 Mar 1; 9(5):937-946. Epub 2010 Mar 6. [Найдено 18.06.2013] [онлайн], Найдено из Интернета: <URL:http://www.orphanresearch.com/journals/cc/18-LagarkovaCC9-5.pdf>. * |
ZHONG М. АВСА4 structure-function relationships: role in Stargardt disease and related retinal degenerative diseases. A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy in the faculty of graduate studies (Biochemistry and Molecular Biology) the University of British Columbia (Vancouver). 2009 Apr; 145 p. [Найдено 14.06.2013] [онлайн], Найдено из Интернета: <URL:https://circle.ubc.ca/bitstream/handle/2429/7111/ubc_2009_spring_zhong_ming.pdf?sequence=1>. * |
ZHONG М. АВСА4 structure-function relationships: role in Stargardt disease and related retinal degenerative diseases. A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy in the faculty of graduate studies (Biochemistry and Molecular Biology) the University of British Columbia (Vancouver). 2009 Apr; 145 p. [Найдено 14.06.2013] [онлайн], Найдено из Интернета: <URL:https://circle.ubc.ca/bitstream/handle/2429/7111/ubc_2009_spring_zhong_ming.pdf?sequence=1>. БОРЗЕНОК C.A. и др. Современные возможности дифференциальной диагностики болезни Штаргардта. Практическая медицина 04 (12) Офтальмология, Т.2, 2012, авг. 27; 9 с. [Найдено 14.06.2013] [онлайн], Найдено из Интернета: <URL: http://pmarchive.ru/sovremennye-vozmozhnosti-differencialnoj-diagnostiki-bolezni-shtargardta/>. * |
БОРЗЕНОК C.A. и др. Современные возможности дифференциальной диагностики болезни Штаргардта. Практическая медицина 04 (12) Офтальмология, Т.2, 2012, авг. 27; 9 с. [Найдено 14.06.2013] [онлайн], Найдено из Интернета: <URL: http://pmarchive.ru/sovremennye-vozmozhnosti-differencialnoj-diagnostiki-bolezni-shtargardta/>. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
van der Wal et al. | Large-scale expansion of human iPSC-derived skeletal muscle cells for disease modeling and cell-based therapeutic strategies | |
ES2705052T3 (es) | Micropartículas de células madre y ARNmi | |
JP6450673B2 (ja) | 幹細胞微粒子 | |
CN104703609B (zh) | 干细胞微粒 | |
JP7055638B2 (ja) | 幹細胞からの筋肉系列細胞の生成 | |
JP2016507550A (ja) | 微粒子の製造方法 | |
Roessler et al. | Detailed analysis of the genetic and epigenetic signatures of iPSC-derived mesodiencephalic dopaminergic neurons | |
CA3140619C (en) | Improved retinal organoids and methods of making the same | |
US20210161967A1 (en) | Extracellular vesicles and uses thereof | |
CN109689858A (zh) | 用于产生具有体内血管形成能力的中胚层和/或内皮集落形成细胞样细胞的方法 | |
WO2013071469A1 (zh) | 使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的方法、试剂盒及用途 | |
RU2504781C1 (ru) | Способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии штаргардта | |
Mortimer et al. | Maintenance of a Schwann-like phenotype in differentiated adipose-derived stem cells requires the synergistic action of multiple growth factors | |
NL2030433B1 (en) | Shrna lentivirus for inhibiting the expression of long non-coding rna malat1 and use thereof | |
Li et al. | Proliferation and differentiation of direct co‑culture of bone marrow mesenchymal stem cells and pigmented cells from the ciliary margin | |
Ratajczak et al. | Stem cells and their potential clinical applications in psychiatric disorders | |
CN104130975B (zh) | 人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞及其制备方法和应用 | |
Faynus et al. | Modeling inherited retinal dystrophies using induced pluripotent stem cells | |
Yuan et al. | Microarray analysis of lncRNAs and mRNAs in spinal cord contusion rats with iPSC-derived A2B5+ oligodendrocyte precursor cells transplantation | |
Wang et al. | Prostaglandin E2 enhances proliferation, dedifferentiation and stem-like properties of rat retinal müller glial cells in vitro | |
CN111718898A (zh) | 提高滑膜间充质干细胞逆境耐受性的方法及其试剂 | |
Jiao et al. | MicroRNA-26b-5p promotes development of neonatal respiratory distress syndrome by inhibiting differentiation of mesenchymal stem cells to type II of alveolar epithelial cells via regulating Wnt5a. | |
Lavekar | Analyses of the development and function of stem cell derived cells in neurodegenerative diseases | |
JP2020072731A (ja) | 重層上皮組織形成能を有する細胞、及びその製造方法 | |
Nawal | A Systems Biology Perspective of Stem Cell Differentiation into Microglia |