RU2502803C2 - ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНОВ, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА, ФЕРМЕНТАТИВНО АКТИВНЫЙ КОНЪЮГАТ МУТЕИНА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНОВ, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА, ФЕРМЕНТАТИВНО АКТИВНЫЙ КОНЪЮГАТ МУТЕИНА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2502803C2 RU2502803C2 RU2011120249/10A RU2011120249A RU2502803C2 RU 2502803 C2 RU2502803 C2 RU 2502803C2 RU 2011120249/10 A RU2011120249/10 A RU 2011120249/10A RU 2011120249 A RU2011120249 A RU 2011120249A RU 2502803 C2 RU2502803 C2 RU 2502803C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mutein
- dnase
- human
- recombinant
- plasmid
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 101000863721 Homo sapiens Deoxyribonuclease-1 Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 26
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 23
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims abstract description 20
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 title claims abstract description 12
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 title claims description 67
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 title claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 96
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 82
- 108010067396 dornase alfa Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 29
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 28
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 14
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 12
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- -1 maleimide-polyethylene Chemical group 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 claims 1
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 25
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract description 19
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 abstract description 3
- 101710090149 Lactose operon repressor Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 26
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 101000863717 Bos taurus Deoxyribonuclease-1 Proteins 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000309464 bull Species 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 4
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 4
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 101000801195 Homo sapiens TLE family member 5 Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 2
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 2
- 102000056245 human TLE5 Human genes 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 5-[(3-carboxylato-4-nitrophenyl)disulfanyl]-2-nitrobenzoate Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)[O-])=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C([O-])=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000907661 Pieris rapae Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- YYQRGCZGSFRBAM-UHFFFAOYSA-N Triclofos Chemical compound OP(O)(=O)OCC(Cl)(Cl)Cl YYQRGCZGSFRBAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010011035 endodeoxyribonuclease DpnI Proteins 0.000 description 1
- 108010021310 endodeoxyribonuclease NcoI Proteins 0.000 description 1
- 108010015866 endodeoxyribonuclease NheI Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003172 expectorant agent Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 102000055805 human DNASE1 Human genes 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 229940066491 mucolytics Drugs 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229960001147 triclofos Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии и представляет собой способ получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, а также их конъюгатов с полиэтиленгликолем, с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей промотор, функционирующий в бактериальной клетке, фрагмент ДНК, кодирующий гексагистидиновый кластер, фрагмент, кодирующий последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с ДНКазой I человека или ее функционально активным мутеином, содержащим замены аспарагина на цистеин, участок терминации транскрипции, фрагмент вектора рЕТ28а(+), содержащий участок инициации репликации бактериофага fl, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона. Предложенное изобретение позволяет получать рекомбинантную ДНКазу I человека или ее мутеин с высоким выходом. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 12 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения дезоксирибонуклеазы I человека.
Предшествующий уровень техники.
Дезоксирибонуклеаза I (синонимы ДНКаза I, Панкреатическая дезоксирибонуклеаза, Deoxyribonuclease I, DNAse I, шифр международного Классификатора Ферментов ЕС 3.1.21.1) человека - природный внеклеточный фермент, вырабатываемый поджелудочной и слюнными железами. В максимальной концентрации он содержится в ЖКТ, где происходит переваривание ДНК, присутствующей в пище. Низкие концентрации ДНКазы I обнаруживаются в сыворотке здоровых людей. ДНКаза I человека - это гликопротеин, содержащий 260 аминокислот, с молекулярной массой 33000-38000 дальтон. Фермент гомологичен ДНКазе I быка, их аминокислотный состав совпадает на 77%. Пространственная структура ДНКазы быка была определена в работах [Suck, D., С. Oefner, et al. (1984). "Three-dimensional structure of bovine pancreatic DNAse I at 2.5 A resolution." EMBO J 3(10): 2423-2430; Suck, D. and C. Oefner (1986). "Structure of DNAse I at 2.0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA." Nature 321(6070): 620-625.].
Основным источником ДНКазы I для научных исследований и фармацевтики являлся крупный рогатый скот. Процесс выделения и хроматографической очистки ДНКазы I описан в работах [Funakoshi, A., Y. Tsubota, et al. (1980). "Simple purification and properties of bovine pancreatic deoxyribonuclease I." J Biochem 88(4): 1113-1118.; Paudel, H.K. and T.H. Liao (1986). "Comparison of the three primary structures of deoxyribonuclease isolated from bovine, ovine, and porcine pancreas. Derivation of the amino acid sequence of ovine DNase and revision of the previously published amino acid sequence of bovine DNase." J Biol Chem 261(34): 16012-16017.; Nefsky, В. and A. Bretscher (1989). "Preparation of immobilized monomeric actin and its use in the isolation of protease-free and ribonuclease-free pancreatic deoxyribonuclease I." Eur J Biochem 179(1): 215-219.].
Проблема использования поджелудочной железы быка как исходного сырья для выделения ДНКазы I состоит в том, что в этой ткани содержится сложная смесь протеаз, что затрудняет выделение, и, кроме того, существует вероятность контаминации препарата прионами и вирусами животных.
В исследованиях in vitro было установлено, что ДНКаза может снижать вязкость гнойных секретов легких [Armstrong, J.В. and J.С. White (1950). "Liquefaction of viscous purulent exudates by deoxyribonuclease." Lancet 2(6641): 739-742; Chemick, W.S., G.J. Barbero, et al. (1961). "In-vitro evaluation of effect of enzymes on tracheobronchial secretions from patients withcystic fibrosis." Pediatrics 27: 589-596].
Бычья панкреатическая ДНКаза I (дорназа) была разрешена к клиническому применению в США в 1958 г. как муколитическое средство ингаляционного и парентерального применения, однако из-за многочисленных побочных эффектов вышла из медицинского употребления. Вероятной причиной побочных действий была контаминация препарата другими пищеварительными панкреатическими ферментами быка (он содержал до 2% трипсина и химотрипсина) [Lieberman, J. (1962). "Enzymatic dissolution of pulmonary secretions. An in vitro study of sputum from patients with cystic fibrosis of pancreas." Am J Dis Child 104: 342-348].
Очевидной заменой лекарственных препаратов ДНКазы I быка является рекомбинантная высокоочищенная ДНКаза I человека.
ДНКаза I человека была выделена и частично очищена из поджелудочной железы [Funakoshi, A., Y. Tsubota, et al. (1977). "Purification and properties of human pancreatic deoxyribonuclease I." J Biochem 82(6): 1771-1777], дуоденального сока, сыворотки [Love, J.D. and R.R. Hewitt (1979). "The relationship between human serum and human pancreatic DNAse I." J Biol Chem 254(24): 12588-12594] и мочи [Murai, K., М. Yamanaka, et al. (1978). "Purification and properties of deoxyribonuclease from human urine." Biochim Biophys Acta 517(1): 186-194]. Было установлено, что N-концевой аминокислотой зрелого белка является лейцин [Ito, K., N. Minamiura, et al. (1984). "Human urine DNAse I: immunological identity with human pancreatic DNAse I, and enzymic and proteochemical properties of the enzyme." J Biochem 95(5): 1399-1406].
Ген человеческой ДНКазы был изолирован из библиотеки панкреатической кДНК с использованием олигонуклеотидных зондов. Был выделен клон полноразмерной кДНК, состоящий из 1039 пар оснований. Было выявлено, что он содержит одну длинную открытую рамку считывания, кодирующую полипептид из 260 аминокислот, высокогомологичный бычьей ДНКазе I. При экспрессии данной кДНК в клетках человека А-293 был получен активный фермент [Shak, S., D.J. Capon, et al. (1990). "Recombinant human DNAse I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum." Proc Natl Acad Sci USA 87(23): 9188-9192].
Промышленно пригодная система экспрессии ДНКазы I человека (рчДНКазы), описанная в патенте США 7297526, основана на использовании культивируемых клеток яичника китайского хомячка (СНО-DP7), содержащих множественные копии трансгена рчДНКазы под контролем раннего промотора цитомегаловируса. Данная система позволяет получать рчДНКазу в значительных количествах и используется при промышленном производстве лекарственного препарата рчДНКазы «Дорназа альфа», но в то же время, культивирование клеток СНО требует использования дорогостоящей культуральной среды и сложной системы очистки продукта, включающей стадии вирус-инактивации.
Потенциально более экономичными промышленно пригодными системами экспрессии гена рчДНКазы являются основанные на использовании дрожжей S. cerevisae или P. pastoris либо бактерий Е. coli. Экспрессия гена рчДНКазы в дрожжевых системах экспрессии приводит к появлению N-гликозилированной формы белка (патент США 7118901), экспрессия в Е. coli - к появлению негликозилированной формы. Удельная ферментативная активность рчДНКазы в обоих случаях одинакова. Поскольку структура N-связанных гликанов, продуцируемых дрожжами, значительно отличается от таковой для человека и N-гликаны дрожжей иммуногенны для млекопитающих, экспрессируемая в дрожжевых системах рчДНКаза непригодна для медицинского применения. Таким образом, среди всех систем экспрессии в микроорганизмах, система экспрессии рчДНКазы в клетках Е. coli лучше подходит для получения фармацевтически пригодного продукта.
Существует ряд работ по получению ферментативно активной ДНКазы I быка в бактериальной системе, но возможности повышенной экспрессии гена данного белка ограничены в связи с токсичностью продукта для клеток-продуцентов. В отличие от эукариот, у которых процессы транскрипции и трансляции проходят в разных клеточных компартментах, в клетке Е. coli эти процессы сопряжены. Наличие активной ДНКазы в цитоплазме приводит к деградации геномной ДНК и последующему лизису бактериальной клетки, поэтому повышенная экспрессия ДНКазы неизбежно приводит к генетической нестабильности клона, т.е. отбор суперпродуцентов одновременно является отбором наиболее генетически нестабильных бактерий. Так, в работе [Worrall, A.F. and В.A. Cormolly (1990). "The chemical synthesis of a gene coding for bovine pancreatic DNAse I and its cloning and expression in Escherichia coli" J Biol Chem 265(35): 21889-21895] экспрессировали активную ДНКазу быка в системе E. coli, используя синтетический ген с оптимизированными кодонами и промотор поздних генов фага лямбда pL. Показано, что продукт экспрессии обладал токсичностью для клеток штамма-продуцента, поэтому выход целевого белка лежал в пределах от 100 мкг до 1 мг/л культуры. Активность экспрессированного фермента была сопоставима с активностью нативного фермента быка. Однако значения активности, приведенные авторами (5×108 Ед/г белка), были измерены для не полностью очищенного препарата. В работе [Chen, С.Y., S. С.Lu, et al. (1998). "Cloning, sequencing and expression of a cDNA encoding bovine pancreatic deoxyribonuclease I in Escherichia coli: purification and characterization of the recombinant enzyme." Gene 206(2): 181-184] экспрессировали природную кДНК быка в системе E. coli штамм BL21(DE3)pLysE. Однако уровень экспрессии оставался низким, так как продукт оказался токсичным для бактерий. Клетки лизировались после индукции, фермент обнаруживался как в культуральной среде, так и в клетках. По данным авторов, индуцированная культура давала 3500 Ед/л. Активность выделенного фермента составляла 908 Ед/мг, что сопоставимо с контрольным измерением тем же методом активности природного фермента, выделенного авторами параллельно из тканей быка (938 Ед/мг). Таким образом, расчетная продуктивность данного метода составляет около 4 мг/л культуры.
Несколько больший уровень экспрессии дезоксирибонуклеазы I быка был достигнут при помощи трансформации штамма JM109 клеток E. coli плазмидой pHEL12, несущей ген ДНКазы I под контролем промотора Т7 и последующей инфекции культуры клеток бактериофагом М13/Т7 при одновременной индукции экспрессии целевого гена при помощи ИПТГ [Linardou, H., A.A. Epenetos, et al. (2000). "A recombinant cytotoxic chimera based on mammalian deoxyribonuclease-I." Int J Cancer 86(4): 561-569]. Существенным ограничением данного метода является необходимость инфицирования рабочей культуры бактериофагом, поскольку при промышленной культивации очистка оборудования от бактериофага практически невозможна.
Подробное описание настоящего изобретения
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии получения ферментативно активной рекомбинантной ДНКазы I человека с более высоким выходом.
Технический результат достигался путем создания технологии, включающей в себя новую экспрессионную плазмидную ДНК, кодирующую оптимизированный для экспрессии в бактериальной системе ген ДНКазы I человека, создание штамма продуцента E. coli на ее основе и технологии выделения и модификации ДНКазы I.
В основе данного решения лежат разработанные авторами экспрессионные плазмиды pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 и pET28EK-DNASEIC106, длиной 6091 п.о., содержащие фрагмент ДНК, включающий последовательность, кодирующую синтетический отщепляемый лидерный N-концевой пептид длиной 19 аминокислот, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, и слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую ДНКазу I человека, либо ее мутеины [N18C] или [N106C], соответственно. Указанный фрагмент содержит оптимальные для E. coli кодоны, позволяющие увеличить уровень экспрессии гетерологичного белка за счет эффективной трансляции всех аминокислот полипептида. Наличие лидерного пептида подавляет ферментативную активность ДНКазы I, что снижает токсичность продукта экспрессии для бактерии, что приводит к значительному увеличению выхода целевого белка.
Целью настоящего изобретения является предоставление экспрессионной плазмиды, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей ДНКазу I человека, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше экспрессионной плазмиды, где указанная плазмида выбрана из группы, состоящей из плазмид pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 и pET28EK-DNASEIC106.
Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной описанной выше плазмидой, - продуцента предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где указанная бактерия представлена штаммами E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18 и E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106.
Также целью настоящего изобретения является предоставление предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, содержащего отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер, и последовательность узнавания энтерокиназы.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше мутеина ДНКазы I человека, при этом мутеин содержит точечную замену N18C или N106C.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, получение зрелого белка обработкой энтерокиназой и выделение зрелого белка.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором культивируют штамм E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18 или E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного способа, в котором мутеин содержит точечную замену N18C или N106C.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантной дезоксирибонуклазы I человека или ее мутеина, включающего предварительное ограниченное восстановление белков, инкубацию с малеимид-полиэтиленгликолем и выделение полученных конъюгатов.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного способа, в котором мутеин содержит точечную замену N18C или N106C.
Также целью настоящего изобретения является предоставление конъюгата полиэтиленгликоля и рекомбинантной дезоксирибонуклазы I человека или ее мутеина, полученного описанным выше способом.
Подробное описание настоящего изобретения
Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание способа получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, а также их конъюгатов с полиэтиленгликолем, с использованием бактерии, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, и слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую ДНКазу I человека, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.
Термин «экспрессионная плазмида» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в него гена, например, такие как промотор, терминатор. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека в составе экспрессионной кассеты, согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.
Фрагментом ДНК, кодирующим предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека, согласно настоящему изобретению, является, например, синтетический ген, кодирующий предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер, и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей ДНКазу I человека. Указанный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР (см. Пример 1, Фиг.1). Также указанный фрагмент ДНК может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO 2005071077.
Чтобы обеспечить эффективную трансляцию клонированного гена в E. coli, предпочтительно, чтобы в последовательности, кодирующей предшественник ДНКазы I человека, все редкие кодоны были заменены синонимичными часто встречающимися кодонами и часто встречающиеся кодоны были распределены в последовательности равномерно, в соответствии с частотностью кодонов экспрессирующихся генов E. coli.
Последовательность гена, кодирующего предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека, согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2. Аминокислотная последовательность зрелой рекомбинантной ДНКазы I человека представляет собой последовательностей под номером SEQ ID NO:2 без 19 первых аминокислот.
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), кодирующего предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке.
ДНКаза I (панкреатическая дезоксирибонуклеаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5'-фосфатные группы.
Термин «мутеин» означает мутантный белок или белок, кодируемый мутантным геном. Предпочтительным мутеином ДНКазы I согласно настоящему изобретению является мутантная ДНКаза I, содержащая замену одной или нескольких аминокислот на цистеин. Наличие дополнительного остатка цистеина в мутеиновых вариантах ДНКазы I человека позволяет производить их направленную модификацию полиэтиленгликолем с получением конъюгатов в ферментативно высокоактивной форме.
Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами ДНКазы I человека, определяются по его способности гидролизовать как одно-, так и двухцепочечные фрагменты ДНК. Так, например, активность ДНКазы I человека можно детектировать методом зимографии как описано в Примере 10. Считается, что вариант белка обладает свойствами предшественника ДНКазы I человека при условии, что активность указанного варианта составляет не ниже 1% активности нативной ДНКазы I человека.
Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер, и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей ДНКазу I человека, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.
В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pBR322, pMW119, pUC19, pET22b, pET28b и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.
Конкретным вариантом реализации настоящего изобретения являются плазмиды, которые состоят из:
1) фрагмента NheI-NcoI длиной 29 п.о., представляющего собой синтетический адаптер, кодирующий гексагистидиновый кластер;
2) фрагмента NcoI-HindIII вектора рЕТ28а(+) длиной 5246 п.о., содержащего область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; участок терминации транскрипции; последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона;
3) фрагмента NheI-HindIII длиной 816 п.о., кодирующего ДНКазу I человека либо ее мутеины [N18C] или [N106C] и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназой.
Указанные плазмиды содержат уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: NheI (1), ApaI (1068), PciI (2958), HindIII (5276).
Структуры соответствующих плазмид pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106 приведены на Фиг.2, 3 и 4.
При помощи созданных плазмид можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии предшественника ДНКазы I человека может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки-реципиента.
«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой приводит к экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).
Согласно настоящему изобретению, «бактериальная клетка-продуцент предшественника ДНКазы I человека» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению предшественника ДНКазы I человека согласно настоящему изобретению, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «бактериальная клетка-продуцент предшественника ДНКазы I человека» также означает клетку, которая способна накапливать продуцент предшественника ДНКазы I человека в количестве не менее чем 1 мг/л, более предпочтительно, не менее чем 30 мг/л. Указанный предшественник ДНКазы I человека накапливается в указанной клетке предпочтительно в виде телец включения.
Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник ДНКазы I человека.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E. coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.
Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента предшественника ДНКазы I человека согласно настоящему изобретению является, но не ограничиваются им, штамм Escherichia coli BL21[DE3].
Штамм Escherichia coli BL21[DE3] характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками.
Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки образуют нити; на агаризованной среде - беловатые крупные колонии с неровным краем. Активность штамма определяется методом денситометрии электрофореграммы. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, канамицина сульфат 30 мкг/мл.
Генетические особенности штамма. Генотип штамма - F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB - mB -)λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).
Трансформация штамма Escherichia coli BL21[DE3] плазмидами рЕТ28ЕК-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106 приводит к получению штаммов-продуцентов BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18C, BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106C, соответственно, которые обеспечивали синтез рекомбинантного белка-предшественника ДНКазы I человека в количестве 15-40% от суммарного содержания белка клеток.
Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI кодирует гибридный белок предшественник LEK-DNASEI, состоящий из аминокислотной последовательности ДНКазы I человека и слитого в рамке N-концевого лидерного пептида длиной 19 аминокислот, содержащего шестигистидиновый кластер и сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой ДНКазы I человека.
Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18C кодирует гибридный белок предшественник LEK-DNASEI[N18C], состоящий из аминокислотной последовательности мутеина ДНКазы I человека [N18C] и слитого в рамке N-концевого лидерного пептида длиной 19 аминокислот, содержащего шестигистидиновый кластер и сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой мутеина ДНКазы I человека.
Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106C кодирует гибридный белок предшественник LEK-DNASEI[N106C], состоящий из аминокислотной последовательности мутеина ДНКазы I человека [N106C] и слитого в рамке N-концевого лидерного пептида длиной 19 аминокислот, содержащего шестигистидиновый кластер и сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой мутеина ДНКазы I человека.
Способ получения ДНКазы I человека или ее мутеина согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, получение зрелого белка обработкой энтерокиназой и выделение указанного зрелого белка рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина.
Ковалентная модификация путем присоединения к белковой молекуле полимеров определенной структуры позволяет создавать препараты с пролонгированным действием, то есть преодолеть ряд недостатков препаратов на основе белков, к которым относятся: недостаточная стабильность (in vitro и in vivo), неустойчивость к действию протеаз (особенно пептидов), короткий период полураспада/полувыведения при введении в организм (минуты), иммуногенность и антигенность, наличие выраженных побочных эффектов при длительном клиническом применении [Abuchowski, A.; McCoy, J.R.; Palczuk, N.С.; van Es, Т.; Davis, F.F. (1977), "Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase". Journal of Biological Chemistry 252 (II): 3582-3586]. Изменение фармакодинамики препарата методом ПЭГилирования используется при производстве ряда разрешенных к клиническому применению препаратов, например, гранулоцитарный колоний стимулирующего фактора (ГКСФ), интерферона бета и др.
Поэтому в рамки настоящего изобретения также включается способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина согласно настоящему изобретению, включающий предварительное ограниченное восстановление ДНКазы I человека или ее мутеина согласно настоящему изобретению, инкубацию их с малеимид-полиэтиленгликолем и выделение полученных конъюгатов.
Также в рамки настоящего изобретения включаются конъюгат полиэтиленгликоля и рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, полученный описанным выше способом.
Использование указанного выше способа позволяет проводить синтез и продукцию конъюгатов мутеинов рекомбинантной ДНКазы I человека с полиэтиленгликолем согласно настоящему изобретению с активностью не менее 10% активности нативной ДНКазы I человека или быка.
Особенности плазмид и результаты их практического применения приведены на следующих Фигурах.
Краткое описание Фигур:
На Фигуре 1 показана схема сборки синтетического гена ДНКазы I человека из олигонуклеотидных праймеров и схема получения экспрессионных плазмид рЕТ28ЕК-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106.
На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEI. Используются следующие обозначения: "pBR322ori" область начала репликации плазмиды pBR322; "ROP" - ген РНК-организующего белка Rop; "f1 ori" - участок инициации репликации бактериофага f1; "KanR2" - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; "Т7 prom" - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; "T7term" - участок терминации транскрипции; "lacI" - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; "LEK-DNASEI" - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида белка-предшественника ДНКазы I человека, включающего отделяемый N-концевой дополнительный пептид "LEK" и зрелую ДНКазу I человека "DNASEI". Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания. "N18", "N106" - триплеты нуклеотидов, соответствующих сайтам N-гликозилирования природной ДНКазы I человека.
На Фигуре 3 показана карта экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEI18C. Используются обозначения аналогично Фигуре 2, а также: "LEK-DNASEI[N18C]" - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида белка-предшественника мутеина ДНКазы I человека [N18C].
На Фигуре 4 показана карта экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEI106C. Используются обозначения аналогично Фигуре 2, а также: "LEK-DNASEI[N106C]" - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида белка-предшественника мутеина ДНКазы I человека [N106C].
На Фигуре 5 показана электрофореграмма тотального белка клеток штамма-продуцента BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI при индукции. ДСН-ПААГ анализ для культур штамма-продуцента, полученных из трех случайно отобранных колоний. Обозначения "-" и "+" - образцы до индукции и через 2 ч после индукции культур 1 мМ ИПТГ. "М" - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. Положение целевого белка указано стрелкой.
На Фигуре 6 приведены электрофореграммы белковых фракций при очистке, ренатурации и процессинге белка-предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека. Обозначения: "IB" - солюбилизированные тельца включения, "FF" - фракция проскока через металлохелатную колонку, "20"-"500" - фракции ступенчатой элюции возрастающими концентрациями имидазола, в мМ; "Е" - фракция элюата при промывке колонки ЭДТА, "REF" - растворимый белок после рефолдинга, "ЕК" - реакционная смесь после 2 ч расщепления энтерокиназой. Дорожки "REF" и "EK" - электрофорез в невосстанавливающих условиях, остальные дорожки - в восстанавливающих. Положение белка-предшественника указано стрелкой.
На Фигуре 7 приведена зимограмма белка-предшественника ДНКазы I. Окраска бромистым этидием. Расположение дорожек: "[M-1]DNASEI" - рекомбинантная ДНКаза I человека с дополнительным N-концевым остатком метионина, "LEK-DNASEI" - белок-предшественник ДНКазы I человека, "bDNAse I" - природная ДНКаза I быка, "М" - предокрашенный маркер молекулярных масс. Количество нанесенных на соответствующие дорожки белков указано в нг, положение белка-предшественника ДНКазы I человека указано стрелкой. Ферментативная активность пропорциональна размеру темной зоны на светлом фоне - участку деградации иммобилизованной в полиакриламидном геле двуцепочечной ДНК.
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Получение плазмидной ДНК PAT-EK-DNASEI, кодирующей предшественник ДНКазы I человека с отделяемым N-концевым пептидом
Для известной аминокислотной последовательности ДНКазы I человека с добавленным N-концевым лидерным пептидом (SEQ ID NO:3), содержащим последовательность узнавания энтерокиназой, была проведена обратная трансляция в последовательность нуклеотидов ДНК. При этом были использованы кодоны, оптимальные для экспрессии этого гена в E. coli класса В, а также была проведена оптимизация структуры гена по вторичной структуре мРНК, GC составу, обеспечено отсутствие нежелательных регуляторных элементов (например, отсутствие внутренних сайтов связывания рибосом), а также отсутствие протяженных повторов, палиндромов.
Индекс CAI (Codon Adaptation Index), отражающий эффективность экспрессии гена в данном организме, для полученной последовательности составил 0,8, что является хорошим прогностическим показателем для промышленной пригодности полученного на его основе штамма-продуцента. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:4.
Синтетический ген, кодирующий полипептид ДНКазы I человека, получали методом полимеразной цепной реакции с использованием синтетических олигонуклеотидов, приведенных в таблице 1, на приборе Терцик МС2 («ДНК-Технология», Россия).
Готовили инкубационную смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; 10 пМ каждого праймера; по 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 1-2 ед. термостабильной ДНК-полимеразы в объеме 50 мкл. Поверх этой смеси наслаивали 50 мкл легкого минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация - 94°C, 3 мин; 25 циклов - денатурация 94°C, 30 сек, отжиг 55°C, 30 сек, достройка 72°C, 45-60 сек; 1 цикл - достройка 72°C, 7 мин.
Продукт ПЦР выделяли из 1% агарозного геля с использованием набора "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя и лигировали в векторную плазмиду PAL-TA (ЗАО «Евроген», Россия) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва). Полученными лигазными смесями трансформировали клетки E. coli штамма DH5α, с генотипом F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток E. coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 мин, нагревали до 42 С на 45 секунд и инкубировали на льду 5 минут, затем добавляли 800 мкл питательного бульона SOB, инкубировали при 37°C 60 минут, затем переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл агара и помещали в термостат на 37°С 18 часов. Колонии E. coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды M13rev (SEQ ID NO:19) и M13dir (SEQ ID NO:20). 5 отобранных клонов наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. Для полученных плазмид определяли нуклеотидную последовательность области вставки методом ПЦР-секвенирования с использованием стандартных праймеров T7prom (SEQ ID NO:21) и SP6 (SEQ ID NO:22) к последовательности вектора.
Пример 2. Получение плазмид PAT-EK-DNASEIC18 и PAT-EK-DNASEIC106, кодирующих мутеины N18C и N106C ДНКазыI человека с отделяемым N-концевым лидером
Для получения плазмиды PAT-EK-DNASEIC18 проводили сайт-направленный мутагенез плазмиды PAT-EK-DNASEI методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-DNA-CN-L-F (SEQ ID NO:23) и IP-DNA-CN-L-R (SEQ ID NO:24).
Для получения плазмиды PAT-EK-DNASEIC106 проводили сайт-направленный мутагенез плазмиды PAT-EK-DNASEI методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-DNA-CN-R-F (SEQ ID NO:25) и IP-DNA-CN-R-R (SEQ ID NO:26).
Сайт-направленный мутагенез методом инвертированной ПЦР проводили по [Michael P. Weiner, Tim Gackstetter, Gina L. Costa, John C. Bauer, and Keith A. Kretz. Site-directed Mutagenesis using PCR in Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. A.M. Griffin and H.G. Griffin. ISBN 1-898486-01-8, 1995. Horizon Scientific Press, PO Box 1, Wymondham, Norfolk, U.K.] с модификациями. Каждый олигонуклеотид фосфорилировали отдельно. Реакцию проводили в буфере трис-HCl, pH 7,5, содержащем 10 мМ MgCl2, 50 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТФ и 100 пМ олигонуклеотида, 1 ед. полинуклеотидкиназы фага Т4 (Сибэнзим, Россия) в течение 30 мин при 37°C. После окончания реакции фермент инактивировали при 65°C 10 мин. Затем использовали для проведения инвертированной ПЦР в количестве 20 пМ на реакцию. ПЦР вели с использованием набора "Encyclo PCR kit" (ЗАО Евроген, Россия) по инструкции производителя, по следующей схеме: 1 цикл: 4 мин 94°C, 2 мин 50°C, 2 мин 72°C; затем 11 циклов 1 мин - 94°C, 1 мин - 55°C, 2 мин 72°C. Продукт ПЦР разводили вдвое однократным буфером для эндонуклеазы DpnI, добавляли 10 Ед. DpnI и инкубировали при 37°C 30 мин, затем вносили 2.5 Ед. полимеразы Pfu, переносили на 72°C и инкубировали еще 30 мин. Полученную смесь очищали, используя набор реактивов "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя. Проводили лигирование очищенного продукта инвертированной ПЦР с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва) в течение 1 часа при комнатной температуре. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки E. coli штамма DH5α. 4 клона E. coli наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Нуклеотидную последовательность полученных плазмид определяли методом ПЦР-секвенирования.
Для секвенирования плазмиды PAT-EK-DNASEIC18 использовали специфический олигонуклеотид SQ-DNA-CN-L-F (SEQ ID NO:27).
Для секвенирования плазмиды PAT-EK-DNASEIC106 использовали специфический олигонуклеотид SQ-DNA-CN-R-F (SEQ ID NO:28).
Пример 3. Получение векторной плазмиды pET28Thr-
Векторная плазмида была получена на основе коммерческого вектора рЕТ28а(+) (Novagen, США), со вставленным коротким ДНК адаптером. Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) обрабатывали последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и NheI, после чего инактивировали ферменты прогреванием 20 мин при 65°C и выделяли из геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя, и лигировали с адаптером. Адаптер получали отжигом двух частично комплиментарных олигонуклеотидов AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:29) и AD-6H-NheR (SEQ ID NO:30), при отжиге образующих дуплекс с выступающими «липкими» 5'-концами. Для получения адаптера вносили в пробирку по 100 пм каждого олигонуклеотида, нагревали до 95°C и медленно охлаждали до комнатной температуры. Адаптер лигировали с NcoI-NheI фрагментом плазмиды рЕТ28а Т4 ДНК-лигазой (Fermentas), полученными лигазными смесями, трансформировали клетки E. coli штамма DH5α. Колонии E. coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:29) и T7t (SEQ ID NO:31).
Отобранные клоны наращивали в 5 мл 2xYT-Kan и проводили выделение плазмидной ДНК с набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Нуклеотидную последовательность области вставки адаптера в полученных плазмидах определяли методом ПЦР-секвенирования с праймера T7t (SEQ ID NO:31).
Пример 4. Получение экспрессионных плазмид pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 и pET28EK-DNASEIC106
Реципиентную плазмиду pET28Thr-, полученную как описано в примере 3, обрабатывали эндонуклеазами NheI и HindIII; проводили дефосфорилирование с последующей инактивацией щелочной фосфатазы 10 мин при 65°C. Фрагмент ДНК выделяли из агарозного геля набором Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США) по методике производителя.
Донорные плазмиды также обрабатывали эндонуклеазами NheI и HindIII, продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли из геля набором Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США).
Для получения экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEI в качестве донорной использовали плазмиду PAT-EK-DNASEI, полученную как описано в примере 1.
Для получения экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEIC18 в качестве донорной использовали плазмиду PAT-EK-DNASEIC18, полученную как описано в примере 2.
Для получения экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEIC106 в качестве донорной использовали плазмиду PAT-EK-DNASEIC106, полученную как описано в примере 2.
Реакцию лигирования очищенных фрагментов донора и акцептора проводили с использованием Т4 ДНК лигазы (Fermentas, Литва) по методике производителя. Лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli штамма DH5α, колонии E. coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательности векторов T7t (SEQ ID NO:31) и T7prom (SEQ ID NO:21). Отобранные клоны наращивали в 5 мл 2xYT-Каn и проводили выделение плазмидной ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Нуклеотидную последовательность в области вставки в полученных генетических конструкциях определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием стандартных праймеров к последовательности вектора T7t (SEQ ID NO:31) и T7prom (SEQ ID NO:21).
Пример 5. Получение штаммов-продуцентов Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC18, BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC106, оценка продуктивности штаммов-продуцентов и локализация целевого белка
Для получения штаммов-продуцентов гибридных белков предшественников ДНКазыI человека и ее мутеинов экспрессионные конструкции, полученные по примеру 5, использовали для трансформации компетентных клеток E. coli BL21[DE3] (с генотипом F-ompT hsdSB (r-m-) gal dcm (DE3)) и проводили отбор клонов, сохраняющих уровень биосинтеза рекомбинантного полипептида не ниже 30-50% от суммарного клеточного белка в течение, по крайней мере, четырех последовательных пассажей.
Для получения штамма E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI - продуцента белка-предшественника ДНКазы I человека клетки штамма E. coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET28EK-DNASEI.
Для получения штамма E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC18 - продуцента белка-предшественника мутеина [N18C] ДНКазы I человека клетки штамма E. coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET28EK-DNASEIC18.
Для получения штамма E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC106 - продуцента белка-предшественника мутеина [N106C] ДНКазы I человека клетки штамма E. coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET28EK-DNASEIC106.
Трансформанты E. coli BL21[DE3] высевали на агаризованную среду 2xYT-агар с добавлением канамицина до 30 мкг/мл и глюкозы до 2%, проводили аналитическую экспрессию целевых белков для пяти случайно выбранных клонов типичного фенотипа. Клоны подращивали в питательном бульоне с добавлением канамицина до 30 мкг/мл и раствора глюкозы до 2% в течение 6-7 часов, инокулировали новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растили культуру до достижения оптической плотности 2 О.Е., индуцировали изопропилтио-р-D-галактозидом, и культивировали еще 2 ч. После окончания культивации осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали клетки в растворе 10 мМ Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА-Na, 0.1% Тритона-Х100, 10 мкг/мл лизоцима в соотношении 10 мл раствора на 1 г клеточной пасты, выдерживали суспензию 30 мин на льду и проводили разрушение клеток ультразвуковым диспергатором до исчезновения видимой вязкости суспензии. Отбирали образцы для электрофоретического анализа, разделяли в них растворимую и нерастворимую фракцию белков центрифугированием в микроцентрифуге, дополнительно ресуспендировали осадок в том же растворе и осаждали центрифугированием. Результаты электрофоретического анализа тотального белка для штамма BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI приведены на Фиг.5, электрофоретическая подвижность и интенсивность полосы целевого белка для мутеинов [N18C] и [N106C] полностью аналогичны. По данным гель-электрофореза белковых фракций все 3 целевых белка практически полностью были локализованы в нерастворимой фракции белков, т.е. находились в форме «телец включения».
Пример 6. Наработка, выделение и очистка в денатурирующих условиях белков-предшественников ДНКазы I человека и ее мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C]
Получение очищенных денатурированных белков-предшественников ДНКазы I человека и ее мутеинов N18C и N106C из штаммов-продуцентов Е.coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI; BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC18 и BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC106 проводили по следующей общей схеме: выращивание штаммов-продуцентов, индукция, отделение биомассы, лизис и дезинтеграция клеток в присутствии ЭДТА-Na; отделение телец включения; солюбилизация; металлохелатная хроматография. Для этого штаммы-продуценты высевали из музея петлей истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 2% глюкозы, растили 14 часов при +37°C. Одну отдельную колонию соответствующего штамма переносили в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 2% глюкозы, и растили на качалке 14 часов при +37°C. Полученными культурами инокулировали 3 колбы по 250 мл среды 2xYT, содержащих 30 мкг/мл канамицина и 0,1% глюкозы, растили на качалке 3,5 часа при +37°C, отбирали образцы бактериальной суспензии для анализа, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили еще 4 часа.
Отделяли осадки биомассы центрифугированием, осадки клеток ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис pH 7,4, 2 мМ ЭДТА), добавляли лизоцим до 10 мкг/мл и Тритон Х100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадки центрифугированием 10 мин при 18000 об/мин. Осадки ресуспендировали в 20 мл раствора А, добавляли детергент NP-40 до 1%, суспензии обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли тельца включения центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные осадки телец включения ресуспендировали в растворе А, добавляли NaCl до 500 мМ, суспензию обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные препараты обогащенных телец включения хранили при -70°C. Чистота всех целевых белков в полученных препаратах составляла не менее 80% по данным денситометрии электрофореграмм.
Для проведения солюбилизации целевых белков к навескам приблизительно 50 мг телец включения добавляли раствор Б (8 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ бета-меркаптоэтанола, pH 8.0) в соотношении 10 мл раствора на 1 г телец. Суспензии инкубировали при перемешивании 2 часа при +37°C, отделяли не растворившийся клеточный дебрис центрифугированием 10 мин при 18000 об/мин. Супернатанты наносили на колонки HiTrap Chelating Sepharose (GE Healthcare, США), содержащие хелатированные ионы кобальта и уравновешенные раствором В (6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 500 мМ хлорида натрия, pH 7,0). Колонки промывали раствором Г (6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ имидазола pH 7,0) и элюировали целевые белки раствором Д (6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ имидазола pH 7,0). Элюаты концентрировали ультрафильтрацией до конечной концентрации белка 20 мг/мл, обессоливали диафильтрацией и замораживали. Чистота всех целевых белков в полученных препаратах составляла не менее 95% по данным денситометрии электрофореграмм.
Пример 7. Ренатурация белков-предшественников ДНКазы I человека и ее мутеинов [N18C] и [N106C]
Ренатурацию белков проводили при помощи рефолдинга быстрым разбавлением. Дисульфидные связи денатурированных белков-предшественников восстанавливали обработкой 5 мМ дитиотреитола в течение 30 мин при комнатной температуре. Для всех трех белков использовали раствор для рефолдинга одинакового состава, содержащий 50 мМ Tris-HCl pH=8,0, 4 мМ CaCl2, 4 мМ MgSO4, 2 мМ восстановленного глутатиона, 0,4 мМ окисленного глутатиона, 1% ПЭГ 1500, 2 М мочевины. Растворы денатурированных белков-предшественников вводили в растворы для рефолдинга по каплям при постоянном перемешивании, использовали разведение 1:40. Вели рефолдинг 1 ч при комнатной температуре при постоянном перемешивании без доступа кислорода. После этого отделяли выпавший осадок центрифугированием. Выход растворимых ковалентно мономерных белков-предшественников составлял во всех случаях не менее 70% по денситометрии электрофореграммы. Растворы ренатурированных белков концентрировали ультрафильтрацией до конечной концентрации белка 3-4 мг/мл и немедленно отделяли N-концевые пептиды обработкой энтерокиназой.
Пример 8. Отделение N-концевых пептидов от белков-предшественников ДНКазы I человека и ее мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C].
Отделение N-концевых пептидов проводили при помощи рекомбинантной энтерокиназы ("Sigma", США), используя соотношение фермент:субстрат 1:10 (по массе). Реакцию вели в течение 2 ч при +37°C, используя разбавленные в 2 раза водой растворы белков-предшественников, т.е. при концентрации субстратов 1,5-2 мг/мл. Степень превращения для всех трех белков-предшественников составила около 70% по данным гель-электрофоретического анализа.
Пример 9. Финальная очистка ДНКазы I человека и ее мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C].
Отделение процессированных белков от белков-предшественников, свободных N-концевых пептидов, энтерокиназы и посторонних примесных белков проводили адсорбцией в объеме, добавляя к реакционным смесям суспензию сорбента Chelating Sepharose FF ("GE Healthcare", США) с иммобилизованными ионами кобальта в соотношении 300 мкл суспензии на 1 мг белка. Реакционные смеси инкубировали с сорбентом 1 ч при комнатной температуре при помешивании. После этого супернатанты отделяли, осадки сорбента промывали 5 объемами раствора 25 мМ Tris-HCl pH8,0, 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgSO4, 1 мМ восстановленного глутатиона, 1 М мочевины, объединяли супернатанты, концентрировали их ультрафильтрацией до конечной концентрации общего белка 1,5-2 мг/мл и удаляли восстановленный глютатион диафильтрацией до отрицательной реакции фильтрата с реактивом Эллмана (5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой)). В результате этой процедуры были получены растворы очищенной рекомбинантной ДНКазы I человека и ее мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C], содержащие не более 5% примесных белков по данным гель-электрофоретического анализа.
Пример 10. Измерение активности рекДНКазы I человека методом зимографии.
Готовили пластину геля для электрофореза по Лэммли. В разделяющий гель перед полимеризацией добавляли ДНК из тимуса крупного рогатого скота до конечной концентрации 10 мкг/мл. Наносили по несколько разведений образцов исследуемых белков в растворе для подготовки образца к электрофорезу по Лэммли, а также аналогично солюбилизированные отмытые тельца включения контрольного белка - ДНКазы I человека с дополнительным N-концевым остатком метионина, и стандарт ферментативной активности - природную ДНКазу I крупного рогатого скота.
По завершении электрофореза отделяли концентрирующий гель, разделяющий гель отмывали в растворе (Тритон Х-100 1%, Трис-HCl pH 7,5, 20 мМ) 3 раза по 10 мин для удаления из геля ЭДТА, додецилсульфата натрия и ренатурации белков в смешанных мицеллах детергентов. Затем гель промывали в растворе (Трис-HCl 20 мМ, NaCl 150 мМ, Твин 20 0,05%, CaCl2 5 мМ, MgCl2 5 мМ, MnSO4 5 мМ) 2 раза по 5 мин. В третью порцию раствора добавляли бромистый этидий до 1 мкг/мл и вели инкубацию геля в течение 30 мин при +37°C. Гель помещали на трансиллюминатор и фотографировали. Продолжали инкубирование на +37°C до проявления видимых зон распада субстрата, но не больше 2-х суток. При денситометрии полученных зимограмм было установлено, что удельная активность белка-предшественника ДНКазы I по отношению к природной ДНКазе I быка составляет не более 0,01%, при этом удельная активность метионил-ДНКазы I составляет около 0,1%, а удельная активность зрелой рекомбинантной ДНКазы I человека - около 1%. Поскольку единственным отличием рекомбинантной ДНКазы от природного белка является отсутствие N-связанных олигосахаридов, было предположено, что ферментативная активность белка может быть восстановлена при конъюгации аминокислот в сайтах N-гликозилирования (позиции 18 и 106) с гидрофильными полимерами.
Пример 11. Направленная конъюгация мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C] с малеимид-полиэтиленгликолем
Очищенные мутеины DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C], содержащие замены остатков аспарагина на остатки цистеина, обрабатывали реактивом ТСЕР (трихлорэтилфосфат) в молярном соотношении 5:1 в течение 10 мин при комнатной температуре для полного восстановления непарного остатка цистеина и добавляли ПЭГ-малеимид 10 кДа ("CreativePEGWorks", США) в молярном соотношении 5:1. Реакционную смесь инкубировали 60 мин при комнатной температуре. Осаждали непрореагировавшие мутеины разбавлением реакционной смеси в 4 раза водой и отделяли осадки центрифугированием. Очистку конъюгатов проводили анионообменной хроматографией на колонках HiTrap Capto DEAE 1 мл ("GE Healthcare", США), уравновешенных раствором 20 мМ Трис-HCl pH 7,0; 5 мМ CaCl2. Супернатанты разбавленных реакционных смесей наносили на колонки немедленно по окончании центрифугирования. Колонки промывали 5 объемами стартового раствора и вели элюцию линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0 до 300 мМ за 20 мл, собирая элюат фракциями по 1 мл. Фракции, содержащие только монозамещенные конъюгаты мутеинов (по данным ДСН-ПААГ анализа), объединяли, концентрировали ультрафильтрацией на мембранах с порогом отсечения 10 кДа, обессоливали диафильтрацией к раствору 20 мМ Трис-HCl, 5 мМ CaCl2 до конечной концентрации белка 1-2 мг/мл и использовали для определения ферментативной активности. Анионообменная хроматография позволяет эффективно отделять конъюгаты от остатков непрореагировавших мутеинов за счет изменения заряда поверхности белка после конъюгации и более ранней элюции конъюгатов.
Пример 12. Определение ферментативной активности в растворе рекомбинантной ДНКазы I человека, мутеинов DNASEI(N18C] и DNASEI[N18C] и их конъюгатов с полиэтиленгликолем 10 кДа
Поскольку ПЭГ-производные мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C] обладают переменной молекулярной массой и не образуют сфокусированных зон при электрофорезе в ДСН-ПААГ, измерение их ферментативной активности зимографией затруднительно. Для сравнения удельной ферментативной активности конъюгатов, мутеинов и исходной рекомбинантной ДНКазы I человека использовали методику гидролиза сверхскрученной плазмиды в растворе с последующим разделением продуктов реакции в агарозном геле и расчетом степени гидролиза субстрата по денситометрии цифровой фотографии геля.
Гидролиз вели в растворе, содержащем сверхскрученную плазмиду pUC19 в концентрации 30 нг/мкл, 25 мМ Hepes, pH 7.0, 0,1 мкг/мкл бычьего сывороточного альбумина, 4 мМ MgCl2, 4 мМ MnSO4 и/или CaCl2. Реакционные смеси инкубировали ровно 10 мин, реакцию останавливали добавлением Na-ЭДТА до 20 мМ. Было установлено, что удельная ферментативная активность рекомбинантной ДНКазы I человека составляет не более 2% от активности ДНКазы I быка, ферментативная активность мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N18C] в данном тесте не выявляется, т.е. составляет менее 10% от удельной активности рекомбинантной ДНКазы I человека. В то же время удельная активность обоих конъюгатов DNASEI[N18C] и DNASEI[N18C] с ПЭГ составляет 10-20% от активности ДНКазы I быка.
Приведенные результаты показали, что включение в последовательность синтезируемого белка лидерного N-концевого пептида, кодируемого оптимальными для Е. coli кодонами снижает токсичность продукта экспрессии для бактерий, что приводит к значительному увеличению выхода целевого белка. N-концевой пептид также позволяет проводить хроматографическую очистку экспрессируемого белка в денатурирующих условиях методом металлохелатной хроматографии, что, в свою очередь, дает возможность получать гомогенный продукт при помощи одной хроматографической стадии. После удаления дополнительного пептида обработкой энтерокиназой и отделения зрелой ДНКазы I повторной металлохелатной хроматографией может быть получен очищенный препарат белка. Полученные указанным способом мутеиновые варианты ДНКазы I человека могут быть превращены в ферментативно высокоактивную форму при направленной конъюгации с полиэтиленгликолем.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
| Таблица 1. | ||
| Олигонуклеотиды для получения синтетического гена ДНКазы I человека. | ||
| Название | Последовательность (5'-3') | SEQ ID NO |
| AS-DN-F1 | GCGGCAACGATACCTTCAATCGTGAACCGGCAATTGT GCGGTTTTTCTCTCGCTTCACCGAAGTTCGCGAGTTTG CGATCGTAC | 5 |
| AS-DN-F2 | TTCGTGTATCGCCCTGATCAGGTGAGCGCAGTAGACA GCTACTATTATGACGATGGGTGCGAGCCTTGCGGCAA CGATACCTTC | 6 |
| AS-DN-F3 | CCCGGACACCTATCATTATGTCGTGAGTGAACCACTG GGCCGCAATAGCTATAAAGAGCGCTACCTGTTCGTGT ATCGCCCTGA | 7 |
| AS-DN-F4 | CAGGAAGTTCGCGACTCACATTTAACGGCGGTTGGCA AACTGCTGGATAATCTGAATCAGGATGCCCCGGACA ССТАТСАТТАТ | 8 |
| AS-DN-F5 | AATGAGTAACGCCACCCTCGTCTCCTATATTGTGCAG ATTCTGAGCCGTTACGATATCGCACTGGTACAGGAAG TTCGCGACTC | 9 |
| AS-DN-F6 | ACTATAAAGATGACGATGACAAACTGAAAATTGCCG CGTTTAATATTCAGACGTTTGGGGAAACCAAAATGAG TAACGCCACCC | 10 |
| AS-DN-F7 | TTGCTAGCGACTATAAAGATGACGATGACAAA* | 11 |
| AS-DN-R1 | CATCCAGATACACATCGTAGAGGGCATCAATTTCTGC GACAGCGTCCCCCGGGGCAGCATGTAACGGTACGAT CGCAAACTCGC | 12 |
| AS-DN-R2 | ATGAACAACCGGCGTTAAAATCCCCCATGAGCATTAC ATCCTCCAGGCCCCATTTCTCTTGTACATCCAGATAC ACATCGTAGA | 13 |
| AS-DN-R3 | GGAATCAACCATTGGAAAGTCGGAGACGTCCACAGC CGAATGGAAGACCACTGGGACGGGCGTACATATGAA CAACCGGCGTTA | 14 |
| AS-DN-R4 | GCCCGCCACTACAATACGATCATACGCACAATGGGTC GGGGTTGCCGTAGTATCTGCGCTGTCTGGAATCAACC ATTGGAAAGT | 15 |
| AS-DN-R5 | GACCATACGCCGCCTGAAAGTTAAACGGTAACGCAC TATCTGGAACCACAGCGCCACGTAAAAGCATGCCCG ССАСТАСААТАС | 16 |
| AS-DN-R6 | GCTTCTATTATTTCAACATCACTTCGACCGGATAGTG ATCCGAAATCGCTTGTGCAAGTTGATCGCTCAGACCA TACGCCGCCT | 17 |
| AS-DN-R7 | TTAAGCTTCTATTATTTCAACATCACT** | 18 |
| * жирным шрифтом выделен сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции NheI | ||
| ** жирным шрифтом выделен сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции HindIII | ||
Claims (18)
1. Плазмида для экспрессии в клетках бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, неактивного предшественника ДНКазы I человека или ее мутеинов, содержащего отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, по существу, содержащая:
- промотор, функционирующий в бактериальной клетке;
- фрагмент ДНК, кодирующий гексагистидиновый кластер;
- фрагмент, кодирующий последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с ДНКазой I человека или ее функционально активным мутеином, содержащим замены аспарагина на цистеин;
- участок терминации транскрипции;
- фрагмент вектора рЕТ28а(+), содержащий участок инициации репликации бактериофага fl, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона.
- промотор, функционирующий в бактериальной клетке;
- фрагмент ДНК, кодирующий гексагистидиновый кластер;
- фрагмент, кодирующий последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с ДНКазой I человека или ее функционально активным мутеином, содержащим замены аспарагина на цистеин;
- участок терминации транскрипции;
- фрагмент вектора рЕТ28а(+), содержащий участок инициации репликации бактериофага fl, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона.
2. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанным фрагментом ДНК, кодирующим предшественник ДНКазы I, является фрагмент ДНК, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID:1, или его вариант.
3. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанным промотором является промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.
4. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанный мутеин ДНКазы I содержит замену N18C или N106C.
5. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанная плазмида выбрана из группы, состоящей из плазмид pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 и pET28EK-DNASEIC106.
6. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, трансформированная плазмидой по п.1, - продуцент неактивного предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, содержащего замены аспарагина на цистеин.
7. Бактерия по п.6, отличающая тем, что указанный мутеин ДНКазы I содержит замену N18C или N106C.
8. Бактерия по п.6, отличающаяся тем, что указанная бактерия выбрана из группы, включающей бактерии Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, E.coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18C и Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106C.
9. Предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, содержащий отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, полученный путем культивирования бактерии по п.6 в питательной среде и предназначенный для получения активной формы ДНКазы 1 человека или ее мутеина.
10. Предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека по п.9, содержащий последовательность аминокислот, представленную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, или ее вариант.
11. Предшественник мутеина ДНКазы I человека по п.9, отличающийся тем, что указанный мутеин содержит замену аспарагина на цистеин N18C или N106C.
12. Способ получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий культивирование бактерии по п.6 в питательной среде, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, получение зрелого белка обработкой энтерокиназой и выделение указанного зрелого белка рекомбинантной ДНКазы 1 человека или ее мутеина.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что культивируют штамм Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18C или Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106C.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный мутеин содержит замену N18C или N106C.
15. Способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантного мутеина ДНКазы I человека, полученного способом по п.12, включающий предварительное ограниченное восстановление белка, инкубацию с малеимид-полиэтиленгликолем и выделение полученного конъюгата.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный мутеин содержит точечную замену N18C или N106C.
17. Ферментативно активный конъюгат мутеина рекомбинантной ДНКазы I человека, содержащего замены аспарагина на цистеин, и полиэтиленгликоля, полученный способом по п.15.
18. Ферментативно активный конъюгат по п.17, отличающийся тем, что указанный мутеин содержит точечную замену N18C или N106C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011120249/10A RU2502803C2 (ru) | 2011-05-20 | 2011-05-20 | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНОВ, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА, ФЕРМЕНТАТИВНО АКТИВНЫЙ КОНЪЮГАТ МУТЕИНА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011120249/10A RU2502803C2 (ru) | 2011-05-20 | 2011-05-20 | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНОВ, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА, ФЕРМЕНТАТИВНО АКТИВНЫЙ КОНЪЮГАТ МУТЕИНА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011120249A RU2011120249A (ru) | 2012-11-27 |
| RU2502803C2 true RU2502803C2 (ru) | 2013-12-27 |
Family
ID=49254532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011120249/10A RU2502803C2 (ru) | 2011-05-20 | 2011-05-20 | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНОВ, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА, ФЕРМЕНТАТИВНО АКТИВНЫЙ КОНЪЮГАТ МУТЕИНА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2502803C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2634416C1 (ru) * | 2017-05-05 | 2017-10-26 | Светлана Александровна Ермолаева | Штаммы-продуценты вариантов рекомбинантного белка Интерналин 321, агониста рецептора фактора роста |
| WO2022074656A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Protalix Ltd. | Long-acting dnase |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2182598C2 (ru) * | 1994-11-21 | 2002-05-20 | Новартис Аг | Модифицированные ингибиторы протеиназы |
| US20040219529A1 (en) * | 2003-03-31 | 2004-11-04 | Ambion, Inc. | Compositions and methods of using a synthetic DNase I |
| WO2005071077A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Sloning Biotechnology Gmbh | De novo enzymatic production of nucleic acid molecules |
| RU2278688C1 (ru) * | 2004-12-02 | 2006-06-27 | Сергей Викторович Луценко | Препарат человеческого эндостатина и способ его получения |
| RU2006110371A (ru) * | 2006-03-31 | 2007-10-10 | Автономна некоммерческа организаци "Институт молекул рной диагностики" (АНО "ИнМоДи") (RU) | Вакцинная композиция для профилактики и лечения онкологических заболеваний, генетические конструкции и способ получения компонентов этой композиции |
| RU2312868C2 (ru) * | 2003-03-13 | 2007-12-20 | Ханми Фарм. Ко., ЛТД | Физиологически активный полипептидный конъюгат, обладающий пролонгированным периодом полувыведения in vivo |
-
2011
- 2011-05-20 RU RU2011120249/10A patent/RU2502803C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2182598C2 (ru) * | 1994-11-21 | 2002-05-20 | Новартис Аг | Модифицированные ингибиторы протеиназы |
| RU2312868C2 (ru) * | 2003-03-13 | 2007-12-20 | Ханми Фарм. Ко., ЛТД | Физиологически активный полипептидный конъюгат, обладающий пролонгированным периодом полувыведения in vivo |
| US20040219529A1 (en) * | 2003-03-31 | 2004-11-04 | Ambion, Inc. | Compositions and methods of using a synthetic DNase I |
| WO2005071077A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Sloning Biotechnology Gmbh | De novo enzymatic production of nucleic acid molecules |
| RU2278688C1 (ru) * | 2004-12-02 | 2006-06-27 | Сергей Викторович Луценко | Препарат человеческого эндостатина и способ его получения |
| RU2006110371A (ru) * | 2006-03-31 | 2007-10-10 | Автономна некоммерческа организаци "Институт молекул рной диагностики" (АНО "ИнМоДи") (RU) | Вакцинная композиция для профилактики и лечения онкологических заболеваний, генетические конструкции и способ получения компонентов этой композиции |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LINARDOU H. ET AL., A recombinant cytotoxic chimera based on mammalian deoxyribonuclease-I, Int J Cancer., 2000, v.86, no.4, pp.561-569. * |
| База данных PatSearch: Deoxyribonuclease-1, номер Р24855, код DNAS1-HUMAN, 01.03.1992 [найдено 18.07.2012]. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2634416C1 (ru) * | 2017-05-05 | 2017-10-26 | Светлана Александровна Ермолаева | Штаммы-продуценты вариантов рекомбинантного белка Интерналин 321, агониста рецептора фактора роста |
| WO2022074656A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Protalix Ltd. | Long-acting dnase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011120249A (ru) | 2012-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103184208B (zh) | 人精氨酸酶和定点聚乙二醇化人精氨酸酶及其应用 | |
| JP5909172B2 (ja) | 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生 | |
| US20040219529A1 (en) | Compositions and methods of using a synthetic DNase I | |
| NO324529B1 (no) | Fremgangsmate for a fremstille interferon-beta i en Escherischia coli-vertscelle. | |
| CN111471669A (zh) | 一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法 | |
| RU2502803C2 (ru) | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНОВ, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЕЕ МУТЕИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА, ФЕРМЕНТАТИВНО АКТИВНЫЙ КОНЪЮГАТ МУТЕИНА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНКазы I ЧЕЛОВЕКА | |
| KR102142255B1 (ko) | Crm197 단백질 발현 방법 | |
| CN110093336B (zh) | 一种稳定的胰蛋白酶及其制备方法 | |
| WO2019052586A1 (en) | BACTERIAL STRAIN CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM AND USE THEREOF | |
| KR101634078B1 (ko) | 봉입체 형성 단백질의 제조방법 | |
| Chang et al. | Expression of Taiwan Banded Krait Phospholipase A2inEscherichia coli, a Fully Active Enzyme Generated by Hydrolyzing with Aminopeptidase | |
| JP2004313169A (ja) | 組換え枯草菌 | |
| JP7791715B2 (ja) | Ｃｓｑ－タグを用いたタンパク質の発現及び精製方法 | |
| KR102099342B1 (ko) | Crm197 단백질 발현 방법 | |
| RU2803949C1 (ru) | Способ экспрессии белка crm197 | |
| KR101658081B1 (ko) | CysQ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| RU2817891C1 (ru) | Продуцент l-аспарагиназы e. coli и экспрессионная плазмида pet28a-asnsyn, кодирующая l-аспарагиназу | |
| RU2495934C2 (ru) | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia НЕАКТИВНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C112S] ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ЭНТЕРОКИНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА | |
| CN119913124B (zh) | 高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突变体 | |
| CN119876069B (zh) | 具有高活性且免疫原性弱化的人源尿酸氧化酶突变体 | |
| EP3221449B1 (en) | Process for refolding recombinant chymotrypsin | |
| RU2550027C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДА, СОДЕРЖАЩАЯ ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ МУТЕИН [C245S] ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ С-КОНЦЕВЫМ ТАГОМ, БАКТЕРИЯ E. coli - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА МУТЕИНА [C245S] ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ С-КОНЦЕВЫМ ТАГОМ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО МУТЕИНА [C245S] ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ С-КОНЦЕВЫМ ТАГОМ, РЕКОМБИНАНТНЫЙ МУТЕИН [C245S] ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА С НЕОТДЕЛЯЕМЫМ С-КОНЦЕВЫМ ТАГОМ | |
| CN118222555A (zh) | 一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体及其重组基因 | |
| CN118440922A (zh) | β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶S突变体及其重组基因 | |
| CN120060179A (zh) | 具有免疫原性弱化且高活性的人源尿酸氧化酶突变体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170521 |