RU2496877C2 - ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА - Google Patents
ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2496877C2 RU2496877C2 RU2011150908/10A RU2011150908A RU2496877C2 RU 2496877 C2 RU2496877 C2 RU 2496877C2 RU 2011150908/10 A RU2011150908/10 A RU 2011150908/10A RU 2011150908 A RU2011150908 A RU 2011150908A RU 2496877 C2 RU2496877 C2 RU 2496877C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- site
- gene
- recombinant protein
- vector
- proteinase
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 238000005204 segregation Methods 0.000 title abstract description 19
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 138
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 49
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108091033454 Hok/sok system Proteins 0.000 claims description 38
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 22
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 22
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 20
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 19
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 18
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 18
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 18
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 17
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims description 16
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 14
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 101710090149 Lactose operon repressor Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 abstract description 9
- 239000008101 lactose Substances 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 114
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 82
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 36
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 16
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 15
- 101150072105 hok gene Proteins 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 9
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 8
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 5
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical group OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VCWNAJUHTLWQQT-XCHBPHIQSA-N 4-o-methyl-tpa Chemical compound C([C@@]1(C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)OC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C VCWNAJUHTLWQQT-XCHBPHIQSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 2
- 101100278012 Escherichia coli (strain K12) dnaG gene Proteins 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 101100165173 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) basS gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101100421924 Thermus thermophilus (strain ATCC BAA-163 / DSM 7039 / HB27) spo0C gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 102000028861 calmodulin binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000084 calmodulin binding Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 108010021310 endodeoxyribonuclease NcoI Proteins 0.000 description 2
- 108010015866 endodeoxyribonuclease NheI Proteins 0.000 description 2
- 108010000306 endodeoxyribonuclease PaeI Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 101150004979 flmA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 101150048892 parB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108010091624 preproparathormone Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTLHODXEDLCLAD-VKHMYHEASA-N (2s)-2-(carboxymethylamino)butanedioic acid Chemical group OC(=O)CN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O BTLHODXEDLCLAD-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010055991 BglII endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 241000702315 Escherichia virus phiX174 Species 0.000 description 1
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101700012268 Holin Proteins 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101001012451 Homo sapiens Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 101000767151 Homo sapiens General vesicular transport factor p115 Proteins 0.000 description 1
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 101001093919 Homo sapiens SEC14-like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 102000053563 human MYC Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031942 natural killer cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005312 nonlinear dynamic Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150095542 tap gene Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 235000008979 vitamin B4 Nutrition 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой вектор для получения вектора для экспрессии в бактериальной клетке предшественника целевого рекомбинантного белка, слитого с N-концевым пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой, по существу состоящий из участка инициации репликации pBR322 ori; гена репрессора лактозного оперона; бактериального промотора; области, кодирующей N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой; участка клонирования (полилинкера); участка терминации транскрипции, функционирующего в бактериальной клетке; фрагмента, кодирующего негеномную пару токсин-антитоксин, при этом ген антитоксина ориентирован таким образом, что направление его транскрипции совпадает с направлением транскрипции целевого гена; гена, кодирующего бактериальный маркер селекции. Изобретение относится также к вектору для экспрессии в бактериальной клетке предшественника целевого рекомбинантного белка, слитого с N-концевым пептидом, бактерии, содержащей такой вектор, и способу получения рекомбинантного белка с использованием бактерии. Изобретение позволяет получить новый вектор с повышенной сегрегационной стабильностью для высокоэффективной экспрессии рекомбинантных белков со слитым в рамке N-концевым лидерным пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 12 ил, 1 табл., 4 пр.
Description
Область изобретения.
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой плазмидный вектор с увеличенной сегрегационной стабильностью для экспрессии рекомбинантных белков со слитым в рамке N-концевым лидерным пептидом.
Предшествующий уровень техники
Поскольку современные промышленные системы биосинтеза гетерологичных белков в бактериальных клетках предполагают использование сильных индуцируемых промоторов, существенным ограничением их продуктивности является недостаточная сегрегационная стабильность экспрессионных плазмид, то есть заметная вероятность потери бактериальной клеткой всех копий плазмиды при делении. Потеря частью клеток экспрессионной плазмиды и вызванное этим падение продуктивности системы экспрессии особенно заметно при проведении продолжительной индукции целевого гена и при культивации штамма-продуцента при недостаточной концентрации (или полного отсутствия) в среде селективного антибиотика.
Для повышения сегрегационной стабильности плазмид Е.coli был разработан ряд векторов, включающих системы «позитивной селекции», основанные на нарушении образования цитотоксического продукта при встраивании целевого фрагмента - MCS в области SacB [Pierce, J. С., В. Sauer, et al. (1992). "A positive selection vector for cloning high molecular weight DNA by the bacteriophage P1 system: improved cloning efficacy." Proc Natl Acad Sci USA 89(6): 2056-2060], gpE фага ФХ174 [Henrich, B. and R. Plapp (1986). "Use of the lysis gene of bacteriophage phi X174 for the construction of a positive selection vector." Gene 42(3): 345-349], pKG2 плазмида, несущая расщепляющую геномную ДНК рестриктазу под контролем LacUV5 промотора [Kuhn, I., F. H. Stephenson, et al. (1986). "Positive-selection vectors utilizing lethality of the EcoRI endonuclease." Gene 42(3): 253-263], CcdB и Kid [Bernard, P. and M. Couturier (1991). "The 41 carboxy-terminal residues of the miniF plasmid CcdA protein are sufficient to antagonize the killer activity of the CcdB protein." Mol Gen Genet 226(1-2): 297-304; [Gabant, P., T. Van Reeth, et al. (2000). "New positive selection system based on the parD (kis/kid) system of the R1 plasmid." Biotechniques 28(4): 784-788; патенты США 6180407, 7176029, 5910438 (Universite Libre de Bruxelles)]. Такие системы не могут быть использованы в высококопийных плазмидах из-за невозможности полностью подавить образование токсического продукта. Кроме того, плазмидные векторы, содержащие вышеуказанные гены и генетические локусы, пригодны для трансформации только специальных, совместимых с ними, штаммов Е.coli и содержат протяженные участки активно транскрибируемой нецелевой ДНК, уменьшающие продуктивность системы биосинтеза гетерологичных белков.
Другой, более пригодный для промышленного использования, тип систем сегрегационной стабилизации плазмид представляет собой пару транскрибируемых генов, кодируемых плазмидой - ген токсичного для клетки белка со стабильной мРНК и ген специфического антитоксина с нестабильной мРНК. Общие сведения о таких системах "токсин-антитоксин" приведены в работе Cooper Т, Paixao Т, Heinemaim JA. (Within-host competition selects for plasmid-encoded toxin-antitoxin systems, Proc. R. Soc. В October 22, 2010 277:3149-3155).
Среди систем токсин-антитоксин наибольший практический интерес представляет генетический локус Hok/Sok (другое название - parB) природной плазмиды Е.coli R1.
Локус Hok/Sok, впервые описанный в работе (The parB (hok/sok) Locus of Plasmid R1: A General Purpose Plasmid Stabilization System. Nature Biotechnology 6, 1402-1405 (1988)); состоит из гена hok, который кодирует 52 аминокислотный токсин, вызывающий диссипацию мембранного потенциала (механизм аналогичен действию белков лизиса бактериофагов - холинов (holin - от hole «дыра»), которые встраиваются в мембрану и образуют поры). Второй ген фрагмента - sok не имеет полипептидного продукта. Он кодирует лабильные антисмысловые РНК, препятствующие трансляции гена hok. Механизм процесса направленного блокирования работы гена hok описан в работе [Thisted Т, Sorensen NS, Gerdes K (1995). "Mechanism of post-segregational killing: secondary structure analysis of the entire Hok mRNA from plasmid R1 suggests a fold-back structure that prevents translation and antisense RNA binding". J. Mol. Biol. 247 (5): 859-73. PMID 7536849].
При делении клеток Е.coli и потере дочерней клеткой всех копий несущей локус Hok/Sok плазмиды в нее переходит долгоживущий белковый токсин Hok и его РНК, а также короткоживущие антитоксические РНК Sok, которые быстро деградируют, после чего клетка погибает. Некоторые штаммы Е.coli могут быть более устойчивы к токсическому действию Hok, чем другие, из-за присутствия в их геноме локусов, гомологичных Hok/Sok (PMID: 10361310). Вероятность гибели клеток, потерявших плазмиду, также зависит от исходной копийности плазмиды с локусом Hok/Sok и может зависеть от положения и ориентации локуса Hok/Sok относительно других транскрипционно активных участков плазмиды.
В ряде работ было описано применение локуса Hok/Sok для повышения сегрегационной стабильности плазмид, кодирующих гетерологичные белки, в том числе под сильным индуцируемым промотором (патент США 6413768), однако оптимальная копийность такой стабилизированной плазмиды и оптимальное положение локуса Hok/Sok относительно других участков векторной плазмиды, получаемой в ходе настоящей работы, оставалось неизвестным.
Важной стадией получения рекомбинантных белков является метод их очистки. Аффинная хроматография является одним из наиболее селективных методов очистки белков. Одна ступень аффинной очистки позволяет уменьшить уровень примесей в растворе целевого белка в тысячи раз. Стандартным методом аффинной очистки белков является применение сорбентов с ковалентно иммобилизованными антителами к очищаемому белку или искусственно добавленным к последовательности целевого белка специальным эпитопам антител - тэгам. Примерами таких эпитопов, к которым были получены коммерчески доступные моноклональные антитела, являются FLAG (Einhauer, A. and Jungbauer, A. (2001) The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J. Biochem. Biophys. Methods 49, 455-465) и с-myc (Evan GI, Lewis GK, Ramsay G, Bishop JM. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol Cell Biol. 1985 Dec; 5(12):3610-6.).
Аффинная хроматография с использованием иммобилизованных антител или других иммобилизованных белков, способных образовывать прочные комплексы с белками-лигандами, имеет ряд существенных ограничений, препятствующих ее использованию при промышленном получении рекомбинантных белков в микробиологических системах экспрессии. Основным ограничением является высокая стоимость самих антител или других чистых белков и низкая стабильность полученных на их основе сорбентов. Также существенными ограничениями являются: невозможность регенерации и дезинфицирования сорбентов раствором гидроксида натрия, невозможность вести очистку денатурированных и восстановленных целевых белков, утечка иммуногенного лиганда, необходимость вести элюцию целевых белков кислыми или щелочными растворами.
Некоторые недостатки обычных вариантов аффинной хроматографии могут быть преодолены путем дериватизации поверхности хроматографического сорбента малыми химическими молекулами - лигандами белков, которые, в свою очередь, являются частью слитного с целевым белка и отделяются от целевого белка после аффинной очистки обработкой сайт-специфическими протеиназами. Такие сорбенты во многих случаях недороги в производстве и выдерживают обработку раствором гидроксида натрия. Типичные примеры систем - белок, связывающий мальтозу (maltose binding protein, MBP), глютатион-S-трансфераза (GST), белок, связывающий кальмодулин (calmodulin binding protein, CBP), strep II (STR). Прямое сравнение применимости данных систем для очистки слитных белков приведено в работе (Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif. 2005 May; 41(1):98-105). Системы аффинной очистки из данной группы обладают двумя существенными и неустранимыми недостатками - неизбежным загрязнением целевого белка нерасщепленным слитным белком, содержащим иммуногенные белки-партнеры и падением продуктивности системы экспрессии из-за необходимости вести биосинтез больших количеств белка-партнера.
Единственным распространенным методом аффинной хроматографии, пригодным для разделения денатурированных белков, содержащих только короткий тэг, является металлохелатная хроматография. (металлоаффинная хроматография, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC), основанная на образовании координационных устойчивых комплексов между ионом переходного металла, координированного привитым к поверхности сорбента хелатирующим агентом, и двумя-тремя близкорасположенными остатками гистидина в составе очищаемого белка. (Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 1975 Dec 18; 258(5536):598-9; Gaberc-Porekar V, Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods. 2001 Oct 30;49(1-3):335-60). При проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях сближение в пространстве остатков гистидина (или других аминокислот - доноров электронов), расположенных в различных местах полипептидной цепи, становится затруднительным и высокое сродство к сорбенту проявляют только белки, имеющие в своем составе искусственно созданные олигогистидиновые кластеры в составе тэгов.
Стандартным лигандом для металлохелатной хроматографии является пептид 6xHis (гексагистидиновый кластер), описанный в патенте США 4,569,794. Наиболее распространенный тип сорбента для металлохелатной хроматографии представляет собой иммобилизованные на поверхности декстрановых сферических гранул химические группы иминодиуксусной кислоты (IDA), другие коммерчески доступные сорбенты используют группы нитрилотриуксусной кислоты (NTA) или карбоксиметиласпартата.
Поскольку сверхэкспрессия гетерологичных белков в клетках Е.coli в большинстве случаев приводит к накоплению целевого белка в цитоплазме бактерий в нерастворимой форме и присутствию в составе целевого белка по крайней мере одного дополнительного N-концевого аминокислотного остатка, унифицированный набор методов биосинтеза, выделения, первичной очистки и ферментативного процессинга рекомбинантных белков медицинского применения, минимально зависящих от природы целевого белка (так называемая технологическая платформа) представляет большой практический интерес.
Предпочтительным вариантом реализации такой технологической платформы является применение короткого N-концевого тэга для аффинной очистки целевого белка в денатурирующих условиях и последующее отделение такого тэга от целевого белка при помощи рекомбинантной сайт-специфической протеиназы человека, то есть протеиназы, обладающей минимальной иммуногенностью. Примером такой протеиназы является фермент пищеварительного тракта энтерокиназа, а точнее ее легкая цепь, расщепляющая полипептидную цепь после сайта узнавания Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- и перед любым аминокислотным остатком, кроме остатка пролина. В то же время, расположение кластера отрицательно заряженных аминокислотных остатков сайта узнавания энтерокиназы вблизи олигогистидинового кластера приводит к ослаблению взаимодействия олигогистидинового кластера с металлохелатным сорбентом.
В литературе описан ряд вариантов олигогистидиновых кластеров, обеспечивающих более плотное связывание очищаемых белков с поверхностью металлохелатного сорбента, чем первоначально описанный кластер 6xHis. В частности, относительно высокой аффинностью обладают кластеры, включающие 6-14 остатков гистидина, перемежающихся остатками заряженных или гидрофобных аминокислот и описанные в патентных заявках США 20100286070 и 20060030007. Существенным недостатком данных кластеров, а особенно их наиболее протяженных вариантов является появление в кодирующих эти кластеры плазмидных ДНК прямых повторов, уменьшающих стабильность плазмид. Другой известной альтернативой кластеру 6xHis является кластер MAT с последовательностью HNHRHKH, включающий положительно заряженные аминокислоты и описанный в патентной заявке США 20060257927, однако его аффинность к металлохелатным сорбентам при расположении вблизи кластера отрицательно заряженных аминокислот и проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях неизвестна.
Подробное описание изобретения
Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлась разработка высокоэффективного экспрессионного вектора, обеспечивающего повышенную по сравнению с традиционно используемой копийность вектора при одновременной повышенной сегрегационной устойчивости при продолжительной индукции, позволяющей увеличить уровень продукции целевого белка путем проведения продуктивной индукции целевого гена в течение большего времени и начала индукции при более высокой плотности культуры, чем в общепринятых системах.
Другой технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлось использование указанного выше вектора для экспрессии рекомбинантных белков, слитых в рамке с коротким N-концевым пептидом, с последующим обеспечением высокой эффективности очистки слитного белка методом металлохелатной хроматографии и последующим контролируемым отделением всех аминокислот указанного пептида сайт-специфичной протеиназой.
Еще одной технической задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось определение минимальной длины олигогистидинового кластера, располагаемого в полипептидной цепи вблизи кластера отрицательно заряженных аминокислот и обладающего высокой аффинностью к металлохелатному сорбенту на основе хелатирующих групп иминодиуксусной кислоты при проведении хроматографии в денатурирующих условиях.
Технический результат достигался за счет создания плазмидного вектора на основе плазмиды рЕТ28а, содержащего делецию области элемента ограничения копийности (ROP), замену области, кодирующей дополнительный N-концевой пептид на область, кодирующую более эффективный пептид 10Е, содержащий 10 остатков гистидина и сайт узнавания энтерокиназы, а также содержащий элемент сегрегационной стабильности Hok/Sok, расположенный по ходу транскрипции целевого гена после терминатора транскрипции целевого гена и ориентированный таким образом, что направление транскрипции гена sok совпадает с направлением транскрипции целевого гена.
Вектор содержит следующие элементы, перечисленные в порядке расположения:
pBR322 ori - участок инициации репликации плазмиды;
lacI - ген репрессора лактозного оперона;
промотор;
N-leader - область, кодирующая N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;
участок клонирования (полилинкер);
участок терминации транскрипции;
фрагмент, кодирующий негеномную пару токсин-антитоксин - генетический элемент, обеспечивающий сегрегационную стабильность; и
ген, кодирующий маркер селекции.
Элементы вектора перечислены в порядке их расположения. Порядок расположения функциональных элементов является существенным для эффективной работы вектора.
Промотором может быть любой сильный конститутивный или индуцибельный промотор, функционирующий в бактериальной клетке, например промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, PL, Ptac, но не ограничивается ими. Промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 является предпочтительным.
N-leader - это область, кодирующая N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой.
Наличие декагистидинового кластера позволяет проводить металлохелатную хроматографию предшественника целевого рекомбинантного белка.
Наличие сайта протеиназы в N-концевом лидерном пептиде предшественника целевого рекомбинантного белка является необходимым. Указанный сайт позволяет проводить отделение N-концевого лидерного пептида. Однако наличие фрагмента, кодирующего сайт узнавания протеиназой, в описанном выше векторе не является обязательным. Указанный фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, может быть внедрен в конструкцию для экспрессии предшественника целевого белка вместе с открытой рамкой считывания (ОРС) целевого белка. Для этого используют адапторные праймеры, один из которых содержит подходящий сайт рестрикции для клонирования, фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, расположенный в одной рамке считывания рядом с первой аминокислотой целевого белка, либо непосредственно перед ней, и участок, идентичный 5′-области ОРС целевого белка; а второй праймер содержит подходящий сайт рестрикции для клонирования, и участок, комплементарный 3′-области ОРС целевого белка. Фрагмент ДНК, содержащий фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, и ОРС целевого белка, может быть получен методом ПЦР с использованием описанных выше адапторных праймеров.
Дизайн таких адапторных праймеров для конкретного целевого гена является рутинной процедурой и специалист в данной области техники с легкостью может сконструировать и синтезировать подобные праймеры.
В случае, когда фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, находится в описанном выше векторе (в области N-leader), OPC целевого белка лигируют в указанный вектор так, чтобы N-leader и OPC были в одной рамке считывания. Экспрессия гена целевого белка в полученной плазмиде приводит к образованию предшественника, расщепление которого протеиназой приводит к образованию целевого белка, содержащего несколько дополнительных аминокислот на N-конце.
В случае, когда фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, расположенный непосредственно перед первой аминокислотой целевого белка, лигируют в составе фрагмента, содержащего OPC целевого белка и полученного с использованием адапторных праймеров как описано выше, экспрессия гена целевого белка в полученной плазмиде приводит к образованию предшественника, расщепление которого протеиназой приводит к образованию целевого белка, не содержащего никаких дополнительных аминокислот на N-конце. Подобный подход позволяет получать нативные целевые белки, которые могут быть использованы для терапевтических целей.
В качестве специфической протеиназы, используемой для отщепления лидерного пептида от полученного гибридного белка после его очистки методом металлохелатной хроматографии, может быть использована энетерокиназа человека, энтерокиназа крупного рогатого скота, специфические протеиназы человека тромбин, фактор Ха, специфическая протеиназа вируса гравировки табака TEV, спцифическая протеиназа риновируса человека HRV3C (для продукции терапевтических белков предпочтительно использовать специфические протеиназы человека, так как примеси гетерологичных белков в терапевтическом белке будут иммуногенны). Однако специфические протеиназы не ограничиваются только указанными протеиназами.
Участком терминации транскрипции может быть участок терминации транскрипции бактериофага Т7 (T7term), участки терминации транскрипции Е.coli rrnC, rrnBt1 и rrnBt2, последовательность вируса везикулярного стоматита VSV, гена препропаратиреоидного гормона человека (РТН)), но не ограничивается ими. Участок терминации транскрипции бактериофага Т7 (T7term) является предпочтительным.
Примерами негеномных пар токсин-антитоксин является система hok/sok стабилизирующая плазмиду R1 в Е.coli, система FlmA/FlmB, гомолог hok/sok, стабилизирующая плазмиду F в Е.coli, и подобные им. Система hok/sok является предпочтительной.
В качестве маркера селекции может использоваться ген устойчивости к антибиотику, например, канамицину, ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, но не ограничивается ими. Ген устойчивости к канамицину является предпочтительным.
Конкретным воплощением вектора согласно настоящему изобретению является вектор pHYP, в котором указанным промотором является промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, участком терминации транскрипции является участок терминации транскрипции бактериофага Т7, сайт узнавания специфической протеиназы представляет собой сайт узнавания энтерокиназы, а геном, кодирующим селекционный маркер, является ген устойчивости к канамицину.
Вектор состоит из 5151 по и содержит уникальные (то есть единственные) сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: XhoI (529), HindIII (544), NheI (602).
Функциональная схема вектора с указанием координат функциональных элементов представлена на Фиг.9, а полная нуклеотидная последовательность этого вектора представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:40. Вектор был получен с использованием стандартных методов генной инженерии и химически синтезированных олигонуклеотидов [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989].
При помощи созданного вектора можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащей к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанным вектором. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники.
«Трансформация клетки вектором» означает введение вектора в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой приводит к экспрессии гена, кодирующего белок, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).
Согласно настоящему изобретению, «бактериальная клетка - продуцент предшественника рекомбинантного белка» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению предшественника рекомбинантного белка, содержащего декагистидиновый кластер и сайт узнавания энтерокиназы, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Указанный предшественник рекомбинантного белка может накапливаться в указанной клетке предпочтительно в виде телец включения.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.
Конкретным примером штамма - реципиента согласно настоящему изобретению является штамм Escherichia coli BL21[DE3], но круг подходящих штаммов не ограничивается им.
Способ согласно настоящему изобретению включает культивирование в подходящей питательной среде бактерии, содержащей описанный выше вектор, содержащий целевой ген, кодирующий целевой рекомбинантный белок, слитый с N-концевым пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой человека; очистку слитного белка методом металлохелатной хроматографии; и отделение пептида от целевого рекомбинантного белка с использованием сайт-специфичной протеиназы человека.
Особенности полученного вектора, экспрессионных плазмид на его основе, промежуточных плазмид и результаты их практического применения приведены на следующих Фигурах.
Краткое описание Фигур
На Фигуре 1 показана схема получения плазмид р6Е, р8Е, рМЕ, p10E, p10E-HU, р10Е-HD, p10E-HDR, p10Erop-, p10E-HUrop-, pHYP, p10E-HDRrop-. Обозначения: пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, эндонуклеазы рестрикции, использовавшиеся для клонирования указаны под названием плазмид, HS-PCR - продукт ПЦР, кодирующий участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli.
На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды р10Е. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 3 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HU. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3′-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 4 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HD. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 5 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HDR. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «laci»-последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 6 показана карта экспрессионной плазмиды p10Erop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI»-последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 7 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HUrop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 8 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HDrop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 9 показана карта экспрессионной плазмиды pHYP. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 10 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP+ плазмиды после 8 и 24 ч индукции 2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 7-12, приведены доверительные интервалы для р=0,05.
На Фигуре 11 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP+ плазмиды без вставки после 24 ч индукции 0,2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 3-4, приведены доверительные интервалы для р=0,05.
На Фигуре 12 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP- плазмиды без вставки после 24 ч индукции 0,2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 3-4, приведены доверительные интервалы для р=0,05.
Сущность и промышленная применимость настоящего изобретения иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Получение плазмиды pAL-HS
Участок hok/sok(host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli, последовательность которого депонирована в публичной базе данных GeneBank (GenBank X05813), получали методом полимеразной цепной реакции с использованием синтетических олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1); AS-HOS-F4 (SEQ ID NO:2); AS-HOS-F3 (SEQ ID NO:3); AS-HOS-F2 (SEQ ID NO:4); AS-HOS-F1 (SEQ ID NO:5); AS-HOS-R1 (SEQ ID NO:6); AS-HOS-R2 (SEQ ID NO:7); AS-HOS-R3 (SEQ ID NO:8); AS-HOS-R4 (SEQ ID NO:9); AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10) на приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). Нуклеотидные последовательности праймеров 5'-3':
Участок hok/sok плазмиды R1 E coli (GenBank X05813) представлен в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:11.
Ген hok кодирует 52 аминокислотный полипептидный токсин (SEQ ID NO:12), вызывающий диссипацию мембранного потенциала и имеющий стабильную мРНК, тогда как транскрипция гена "антитоксина" sok приводит к появлению короткоживущих коротких антисмысловых РНК, связывающихся с мРНК гена hok и препятствующих его трансляции. При потере бактериальной клеткой плазмиды, содержащей локус Hok/Sok, происходит прекращение транскрипции элемента sok и быстрый распад его мРНК и восстановление трансляции долгоживущей мРНК гена Hok, приводящее к смерти бактериальной клетки.
Последовательность ПЦР-продукта, содержащего участок hok/sok плазмиды R1 E.coli, приведена в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:13. Внешние праймеры AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10) содержат сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции PspCI, BamHI, SphI.
Продукт полимеразной цепной очищали из 1% агарозного геля набором Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США) по протоколу производителя. Очищенные продукты лигировали в плазмиду PAL-TA (ЗАО Евроген, Россия) ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва). Лигирование вели в объеме 10 или 20 мкл, при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5α и высевали на твердую агаризованную среду, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара, и помещали в термостат на 18 часов при 37 С. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды M13rev (SEQ ID NO:14) и M13dir (SEQ ID NO:15). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. Для полученных конструкций PAL-HS определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров к последовательности вектора SP6 (SEQ ID NO:16) и T7prom (SEQ ID NO:17).
Пример 2. Получение экспрессионных плазмид р6Е, р8Е, рМЕ, р10Е и сравнение свойств лидерных пептидов при металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях
Последовательности, кодирующие фрагменты N-концевых дополнительных пептидов (тэгов) 6Е (SEQ ID NO:18), 8Е (SEQ ID NO:19), 10E (SEQ ID NO:20), MAT (SEQ ID NO:21), получали методом отжига двух частично комплементарных олигонуклеотидов с образованием выступающих «липких» 5′-концов. Для этого вносили в пробирку соответствующие пары олигонуклеотидов, по 100 пмоль каждого в общем объеме 10 мкл, нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры.
Для получения тэга 6Е использовали праймеры AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:22) и AD-6H-NheR (SEQ ID NO:23); для получения тэга 8Е использовали праймеры AD-8H-NcoF (SEQ ID NO:24) и AD-8H-NheR (SEQ ID NO:25); для получения тэга 10E использовали праймеры AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:26) и AD-10H-NheR (SEQ ID NO:27); для получения тэга MAT использовали праймеры AD-MAT-NcoF (SEQ ID NO:28) и AD-MAT-NheR (SEQ ID NO:29).
Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) (Novagen, США) расщепляли последовательно эндонуклеазами NcoI и NheI. Для этого две акликвоты по 0,5 мкг очищенной плазмиды инкубировали 2 часа в водном термостате при 37°C с одной из двух эндонуклеаз рестрикции, контролировали электрофорезом в агарозном геле полноту линеаризации плазмид, после чего добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем образцы объединяли, рестриктазы инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут. Расщепленную рестриктазами плазмиду обрабатывали равным объемом смеси фенол-хлороформ 1:1 и переосаждали водную фазу тремя объемами охлажденного этанола. Центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% раствором этанола, растворяли в воде и использовали для постановки реакции дотирования в рабочей концентрации 10 нг/мкл, вставки - соответствующие дуплексы олигонуклеотидов использовали в молярном соотношении вектор:вставка 1:10. Реакцию вели с использованием Т4 ДНК лигазы (Fermentas, Литва) по методике производителя. Инактивировали лигазу прогреванием реакционной смеси 20 мин при +65°С и проводили трансформацию компетентных клеток Е.coli штамма DH5α по методике, приведенной в [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989]. Выращивали колонии трансформантов Е.coli на агаризованной среде, содержащей 30 мкг/мл канамицина и анализировали колонии методом "ПЦР с клонов", с использованием олигонуклеотидов T7t (SEQ ID NO:30) и T7prom (SEQ ID NO:17). Отобранные колонии, содержащие вставку ожидаемого размера, использовали для инокуляции жидких культур по 5 мл питательного бульона 2xYT-канамицин, выделяли плазмидные ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя и определяли нуклеотидную последовательность для области вставки методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7t (SEQ ID NO:30).
Последовательности полученных векторов р6Е, р8Е, р10Е, рМЕ представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 соответственно.
Для проверки свойств кодируемых векторами N-концевых пептидов были получены экспрессионные плазмиды, кодирующие синтетический ген делеционного варианта тканевого активатора плазминогена человека, содержащий 355 из 527 аминокислот природного ТАП человека (аминокислоты 1-3 и 176-527) и сайт расщепления энтерокиназой (SEQ ID NO:43), слитый в рамке с соответствующими пептидами.
Экспресионную плазмиду p10E-tPA получали, как описано в Справочном примере, приведенном ниже, плазмиды p6E-tPA, p8E-tPA и pME-tPA получали аналогично p10E-tPA. Для всех четырех полученных плазмид проводили секвенирование области вставки, в дальнейшей работе использовали клоны, не содержащие точечных мутаций.
Получали штаммы-продуценты слитных белков путем трансформации экспрессионных плазмид в клетки штамма BL21[DE3] (Novagen, США) методом электропорации. Проводили аналитические экспрессии целевых генов. Во всех четырех случаях большая часть целевых белков накапливалась в нерастворимой форме в составе телец включения, уровни экспрессии генов не имели существенных отличий. Препараты телец включения для четырех целевых слитных белков 6E-tPA, ME-tPA, 8E-tPA, 10Е-tPA - продуцируемых штаммами BL21[DE3]/p6E-tPA, BL21[DE3]/pME-tPA, BL21[DE3]/p8E-tPA, BL21[DE3]/p10E-tPA, соответственно, получали следующим образом. Отделяли осадки биомассы центрифугированием, осадки клеток ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис рН 7,4 2 мМ ЭДТА), добавляли лизоцим до 10 мкг/мл и Тритон X100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадки центрифугированием 10 мин при 18000 об/мин. Осадки ресуспендировали в 20 мл раствора А, добавляли детергент NP-40 до 1%, суспензии обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли тельца включения центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные осадки телец включения ресуспендировали в растворе А, добавляли NaCl до 500 мМ, суспензию обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные препараты обогащенных телец включения хранили при -70°С.
Солюбилизировали навески по 50 мг телец включения каждого из вариантов белка в растворе 6М гуанидина гидрохлорида, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ β-меркаптоэтанола, рН=8,0. Инкубировали 10% суспензии телец включения 30 мин при +37°С при перемешивании и отделяли осадок клеточного дебриса центрифугированием. Готовили к работе колонку для металлохелатной хроматографии 1 мл HisTrap (GE Healthcare, США), содержащую агарозный сорбент с привитыми группами иминодиуксусной кислоты (IDA) и иммобилизованными ионами никеля. Колонку уравновешивали раствором А, содержащим 6М гуанидина гидрохлорида, 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, рН=7,5 и наносили растворы соответствующих слитных белков на скорости потока 0,2 мл/мин. Собирали фракцию не связавшихся с колонкой белков и промывали колонку раствором А до стабилизации базовой линии детектора (около 10 объемов колонки) на скорости потока 1 мл/мин. Проводили ступенчатую элюцию белков порциями по 5 мл растворов, содержащих 50, 100, 200, 500 мМ имидазола в растворе А, рН=7,5. Собирали элюаты и удаляли иммобилизованные ионы никеля (и координированные ими белковые молекулы) с колонки 5 мл раствора А, дополнительно содержащего 50 мМ ЭДТА-Na, элюат собирали.
Проводили осаждение белков из растворов гуанидина гидрохлорида для проведения ДСН-ПААГ анализа белков, для этого к равным аликвотам всех элюатов и эквивалентной им аликвоте фракции проскока добавляли трихлоруксусную кислоту до 7%, перемешивали растворы, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, отделяли осадки белков центрифугированием, дважды промывали осадки охлажденным ацетоном и подсушивали осадки при комнатной температуре.
Проводили ДСН-ПААГ анализ белковых фракций, гель окрашивали коллоидным раствором Кумасси синего (Fermentas, Литва), отмывали избыток красителя очищенной водой и определяли содержание белков в пластине геля методом денситометрии при помощи планшетного сканера в просвечивающем режиме. Полученное цифровое изображение геля с глубиной цвета 16 бит/канал анализировали с помощью программы TotalLab (Nonlinear Dynamics, Великобритания) и определяли объемы пиков, соответствующих полосам целевого белка во фракциях. Распределение целевого белка во фракциях для исследуемых тэгов приведено в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||
| Доля целевых белков во фракциях элюции при металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях. | ||||
| Продукт экспрессии | 6E-tPA | ME-tPA | 8E-tPA | 10Е-tPA |
| Элюция 50 мМ имидазола | 37,3% | 16,0% | 2,3% | 1,2% |
| Элюция 100 мМ имидазола | 20,8% | 22,7% | 1,0% | 3,0% |
| Элюция 200 мМ имидазола | 27,7% | 29,1% | 19,5% | 15,6% |
| Элюция 500 мМ имидазола | 7,3% | 27,2% | 71,1% | 72,5% |
| Элюция ЭДТА | 6,9% | 5,0% | 6,1% | 7,7% |
Было установлено, что наибольшей устойчивостью к элюции возрастающими концентрациями имидазола обладает белок 10EtPA, при этом доля целевого белка, не элюированного 500 мМ имидазола и элюировавшаяся при удалении иммобилизованных ионов никеля при помощи ЭДТА, практически не зависит от длины и типа олигогистидинового кластера и остается незначительной. Поскольку большая часть видимых на геле белков Е.coli, связывающихся с металлохелатным сорбентом в денатурирующих условиях, элюируется при концентрации имидазола до 200 мМ включительно, предпочтительным вариантом очистки целевых белков является элюция примесных белков при концентрации имидазола 200 мМ и последующая элюция целевого белка при концентрации имидазола 500 мМ. При таком режиме хроматографии наилучший выход фиксируется для белков с тэгом 10Е.
Для верификации полученных данных был получен штамм-продуцент, кодирующий tPA без тэга, но с дополнительным остатком метионина на N-конце белка. При проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях для данного белка была установлено, что целевой белок не связывается с металлохелатным сорбентом и целиком обнаруживается во фракции несвязавшихся белков. Таким образом, собственные свойства денатурированного полипептида tPA с восстановленными дисульфидными связями не влияют значимым образом на связывание слитных белков с металлохелатной колонкой.
Предположительно, при использовании тэгов, не содержащих кластер кислых аминокислот (сайт узнавания энтерокиназы DDDDK) вблизи олигогистидинового кластера, профиль элюции полипептидов с олигогистидиновыми кластерами различной длины будет отличаться от приведенного выше и устойчивость слитных белков к элюции может возрасти вплоть до невозможности провести элюцию целевого белка раствором с 500 мМ имидазола.
Пример 3. Получение векторных плазмид p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR и сравнение их сегрегационной стабильности
Для получения вектора p10E-HU реципиентную плазмиду р10Е расщепляли эндонуклеазами BglII и SphI. Донорную плазмиду PAL-HS, расщепляли эндонуклеазами BamHI и SphI. Продукты рестрикции выделяли из 1% агарозного геля набором WizardSV Gel and PCR Cean-Up System (Promega, США), после чего лигировали Т4 ДНК лигазой и трансформировали клетки Е.coli штамма DH5a. Колонии E.coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Отобранные клоны наращивали в 5 мл 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Последовательность p10EHU определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7t (SEQ ID NO:30).
Для получения векторов p10E-HD и p10E-HDR реципиентную плазмиду р10Е расщепляли эндонуклеазой PsiI. Донорную плазмиду PAL-HS, расщепляли эндонуклеазой PspCI (Fermentas, Литва). Продукты рестрикции выделяли из 1% агарозного геля, дотировали и трансформировали клетки Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Для определения ориентации вставки при первичном скрининге клонов использовали ПЦР с праймеров T7prom (SEQ ID NO:17) и AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) или AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Плазмида p10E-HD содержала вставку в прямой ориентации, плазмида p10E-HDR - в обратной ориентации. Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором Gene JET Plasmid Miniprep Kit. Последовательность p10EHD и p10EHDR определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7prom (SEQ ID NO:17).
Последовательности полученных плазмид p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 соответственно. Плазмиды различаются между собой положением и ориентации локуса сегрегационной стабилизации Hok/Sok. Поскольку локус находится вблизи активных промоторов Т7, lac и kanR, было предположено, что инициированная этими промоторами транскрипция участков плазмидной ДНК, захватывающих область вставки локуса Hok/Sok, может существенно повлиять на относительный уровень транскрипции генов hok и sokSok и, таким образом, изменять свойства локуса.
Для сравнения сегрегационной стабильности полученных плазмид в них клонировали вставку малотоксичного для E.coli белка делеционного варианта тканевого активатора плазминогена с дополнительным N-концевым тэгом 10Е (tPA). Клонирование минигена tPA в созданные вектора проводили, как указано в примере 2. Штаммы-продуценты tPA в соответствующих векторах и штаммы, несущие исследуемые плазмиды без кодирующей белок вставки, получали путем трансформации штамма Е.coli BL21 [DE3] методом электропорации.
Вели культивацию исследуемых штаммов по следующей общей схеме:
1. Высевали штамм из замороженного музея истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой 2xYT, содержащей 30 мкг/л канамицина и 1% глюкозы. Растили культуры в течение 14-18 ч.
2. Отбирали одиночные колонии типичного для BL21 [DE3] фенотипа и переносили их в пробирки с 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 30 мкг/л канамицина и 1% глюкозы. Вели рост культуры в течение 16 ч. Переносили 1 мл культуры в стерильную микропробирку и отделяли среду с остатками антибиотика центрифугированием. Ресуспендировали осадок клеток в 1 мл среды 2xYT.
3. Инокулировали 50 мкл полученной суспензии бактериальных клеток в 5 мл среды 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы, но не содержащей канамицин, вели рост 2 ч, после чего добавляли ИПТГ до 2 мМ и продолжали культивирование в течение 24 ч.
4. Через 8 ч после начала индукции отбирали аликвоту культуры, при помощи стерильной среды 2xYT делали разведения в кратностью 10 тыс и 1 млн. Высевали по 100 мкл полученных разведении на чашки со средой 2xYT с и без добавления 30 мг/л канамицина Культуры растили в течение 14-18 ч и подсчитывали выросшие колонии.
5. Проводили отбор аликвот жидкой культуры с шага 4 через 24 ч после индукции, готовили и высевали разведения по п.4 и проводили подсчет колоний.
Результаты измерения доли клеток, сохранивших плазмиды через 8 и 24 ч после начала индукции, приведены на Фиг.10. Для всех вариантов вставки локуса Hok/Sok не наблюдалось статистически значимого изменения сегрегационной стабильности плазмиды. Измерение сегрегационной устойчивости повторили для штаммов, трансформированных плазмидами без кодирующей вставки, при этом применяли выращивание культуры без антибиотика в присутствии 0,2 мМ ИПТГ в течение 24 ч. Результаты измерения долей клеток, сохранивших плазмиду, приведены на Фиг.11. Сегрегационная стабильность плазмид, не содержавших вставки, также не имела статистически значимых различий и не имела значимых отличий от стабильности плазмид, кодирующих нетоксичный белок. Было сделано предположение о том, что уровень экспрессии гена hok недостаточен для индукции гибели клеток при потере плазмиды, либо уровень экспрессии гена антитоксина sok слишком велик, либо функционирование гена hok затруднено экспрессией генов, гомологичных sok и расположенных в геноме клеток BL21[DE3]. Наиболее очевидным способом повышения уровня экспрессии генов hok и sok, присутствующих в конструируемых плазмидах, является повышение копийности плазмид в клетках, реализуемое путем удаления генетического элемента контроля копийности ROP.
Пример 4. Получение плазмид p10Erop-, p10E-HUrop-, p10E-HDRrop-, pHYP и сравнение их сегрегационной стабильности
Удаление фрагмента ДНК, кодирующего ROP элемент, проводили рестрикцией плазмид p10E (SEQ ID NO:33), p10E-HU (SEQ ID NO:35), p10E-HD (SEQ ID NO:36), p10E-HDR (SEQ ID NO:37) двумя эндонуклеазами рестрикции, расщепляющих ДНК с образованием «тупых» концов - FspAI (Fermentas Литва) и Bst1107I (Fermentas Литва). Фрагменты после расщепления выделяли из агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США), после чего лигировали Т4 ДНК лигазой (Fermentas, Литва) по методике производителя. Продукты лигирования расщепляли теми же эндонуклеазами, после этого трансформировали Е.coli штамма DH5α. Клоны трансформантов наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan и выделяли плазмидную ДНК набором реактивов GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Идентичность клонов подтверждали рестрикционным анализом с использованием тех же эндонуклеаз FspAI и Bst1107I по отсутствию выщепления фрагмента.
Последовательности полученных плазмид p10Erop-, p10E-HUrop-, pHYP, p10E-HDRrop- представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 и SEQ ID NO:41, соответственно.
Анализ сегрегационной стабильности полученных плазмид проводили, как указано в примере 3. Результаты измерений представлены на Фигуре 12. Было установлено, что плазмида pHYP (элемент Hok-Sok в положении HD) обеспечивает приблизительно двукратное и статистически значимое (p<0,05) увеличение доли клеток, несущих плазмиду, по сравнению со всеми остальными исследованными плазмидами, при продолжительной индукции штаммов при помощи ИПТГ. Таким образом, был создан экспрессионный вектор, обеспечивающий повышенную сегрегационную стабильность при культивировании в отсутствие антибиотика и в присутствии индуктора экспрессии целевого гена, также позволяющий вести очистку целевых белков металлохелатной хроматографией в денатурирующих условиях с увеличенным выходом продукта.
Справочный пример. Получение плазмиды p10E-tPA
Последовательность, кодирующую фрагмент N-концевого лидерного пептида, включающего декагистидиновый кластер, получали методом отжига двух частично комплементарных олигонуклеотидов AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:44) и AD-10H-NheR (SEQ ID NO:45) с образованием выступающих «липких» 5'-концов. Для этого вносили в пробирку по 100 пм каждого олигонуклеотида, нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры.
Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) (Novagen) расщепляли последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и NheI. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали 2 часа при 37°C с каждой из рестриктаз, затем контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид (в пределах чувствительности метода), после чего добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, рестриктазы инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут. Рестрицированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл. Выделенные фрагменты дотировали с использованием Т-4 ДНК лигазы («Fermentas», Литва) по методике производителя. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с использованием олигонуклеотидов AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:44) и T7t (SEQ ID NO:46). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором «Gene JET Plasmid Miniprep Kit» («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Для полученных генетических конструкций р10Е определяли нуклеотидную последовательность ДНК методом ПЦР-секвенирования с праймера T7t (SEQ ID NO:46).
Реципиентную плазмиду р10Е расщепляли последовательно каждой из эндонуклеаз NheI и HindIII. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали при 37°С в течение 2 часов с каждой из рестриктаз, контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид, затем добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, ферменты инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°С в течение 20 минут. Расщепленную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл.
Реакцию лигирования предварительно расщепленного рестриктазами NheI и HindIII фрагмента SEQ ID NO:43, соответствующего минигену tPA и содержащего сайт расщепления энтерокиназы, и реципиентной плазмиды проводили, как описано выше. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Фрагмент SEQ ID NO:43, соответствующий минигену tPA и содержащий сайт расщепления энтерокиназы, получали методом ПЦР с использованием набора перекрывающихся праймеров. В качестве альтернативы указанный фрагмент может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO2005071077.
Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:47) и T7t (SEQ ID NO:46). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя. При помощи ПЦР-секвенирования для конструкции p10E-tPA определяли нуклеотидную последовательность обеих комплементарных цепей ДНК для области вставки с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:47) и T7t (SEQ ID NO:46). В результате секвенирования установили, что в полученном препарате плазмиды не содержатся мутации в области вставки, то есть кодируется корректная последовательность гена ТАП.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Claims (9)
1. Вектор для получения вектора для экспрессии в бактериальной клетке предшественника целевого рекомбинантного белка, слитого с N-концевым пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой, по существу, состоящий из:
- участка инициации репликации pBR322 ori;
- гена репрессора лактозного оперона;
- бактериального промотора;
- области, кодирующей N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;
- участка клонирования (полилинкера);
- участка терминации транскрипции, функционирующего в бактериальной клетке;
- фрагмента, кодирующего негеномную пару токсин-антитоксин, при этом ген антитоксина ориентирован таким образом, что направление его транскрипции совпадает с направлением транскрипции целевого гена; и
- гена, кодирующего бактериальный маркер селекции.
- участка инициации репликации pBR322 ori;
- гена репрессора лактозного оперона;
- бактериального промотора;
- области, кодирующей N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;
- участка клонирования (полилинкера);
- участка терминации транскрипции, функционирующего в бактериальной клетке;
- фрагмента, кодирующего негеномную пару токсин-антитоксин, при этом ген антитоксина ориентирован таким образом, что направление его транскрипции совпадает с направлением транскрипции целевого гена; и
- гена, кодирующего бактериальный маркер селекции.
2. Вектор по п.1, отличающийся тем, что указанным промотором является промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, участком терминации транскрипции является участок терминации транскрипции бактериофага Т7, сайт узнавания протеиназой представляет собой сайт узнавания энтерокиназой, фрагментом, кодирующим негеномную пару токсин-антитоксин, является система hok/sok, а геном, кодирующим маркер селекции, является ген устойчивости к канамицину.
3. Вектор по п.1, содержащий последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:40.
4. Вектор для экспрессии в бактериальной клетке предшественника целевого рекомбинантного белка, слитого с N-концевым пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой, по существу, состоящий из:
- участка инициации репликации pBR322 ori;
- гена репрессора лактозного оперона;
- бактериального промотора;
- области, кодирующей N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;
- участка клонирования (полилинкера) с введенной в него открытой рамкой считывания, кодирующей указанный целевой рекомбинантный белок, при этом, если в указанном векторе отсутствует сайт узнавания протеиназой, указанный сайт предварительно вводят перед открытой рамкой считывания;
- участка терминации транскрипции, функционирующего в бактериальной клетке;
- фрагмента, кодирующего негеномную пару токсин-антитоксин, при этом ген антитоксина ориентирован таким образом, что направление его транскрипции совпадает с направлением транскрипции целевого гена; и
- гена, кодирующего бактериальный маркер селекции.
- участка инициации репликации pBR322 ori;
- гена репрессора лактозного оперона;
- бактериального промотора;
- области, кодирующей N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;
- участка клонирования (полилинкера) с введенной в него открытой рамкой считывания, кодирующей указанный целевой рекомбинантный белок, при этом, если в указанном векторе отсутствует сайт узнавания протеиназой, указанный сайт предварительно вводят перед открытой рамкой считывания;
- участка терминации транскрипции, функционирующего в бактериальной клетке;
- фрагмента, кодирующего негеномную пару токсин-антитоксин, при этом ген антитоксина ориентирован таким образом, что направление его транскрипции совпадает с направлением транскрипции целевого гена; и
- гена, кодирующего бактериальный маркер селекции.
5. Вектор по п.4, отличающийся тем, что указанным промотором является промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, участком терминации транскрипции является участок терминации транскрипции бактериофага Т7, сайт узнавания протеиназой представляет собой сайт узнавания энтерокиназой, фрагментом, кодирующим негеномную пару токсин-антитоксин, является система hok/sok, а геном, кодирующим маркер селекции, является ген устойчивости к канамицину.
6. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia и содержащая вектор по п.4, - продуцент предшественника целевого рекомбинантного белка, содержащего N-концевой пептид, содержащий декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой.
7. Бактерия по п.6, отличающаяся тем, что сайт узнавания протеиназой представляет собой сайт узнавания энтерокиназой.
8. Способ получения рекомбинантного белка, включающий:
- культивирование бактерии по п.6 в питательной среде, подходящей для указанной бактерии,
- очистку слитного белка методом металлохелатной хроматографии и
- отделение пептида от целевого рекомбинантного белка с использованием сайт-специфичной протеиназы.
- культивирование бактерии по п.6 в питательной среде, подходящей для указанной бактерии,
- очистку слитного белка методом металлохелатной хроматографии и
- отделение пептида от целевого рекомбинантного белка с использованием сайт-специфичной протеиназы.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что сайт-специфичной протеиназой является энтерокиназа.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011150908/10A RU2496877C2 (ru) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011150908/10A RU2496877C2 (ru) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011150908A RU2011150908A (ru) | 2013-06-20 |
| RU2496877C2 true RU2496877C2 (ru) | 2013-10-27 |
Family
ID=48785141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011150908/10A RU2496877C2 (ru) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2496877C2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2201455C2 (ru) * | 1995-12-11 | 2003-03-27 | Мерк Патент Гмбх | Способ получения чужеродного протеина в клетках e.coli, плазмидный вектор и трансформированный штамм е.coli для экспрессии чужеродного протеина |
| WO2007129087A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-15 | The University Of Birmingham | Plasmid curing |
-
2011
- 2011-12-15 RU RU2011150908/10A patent/RU2496877C2/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2201455C2 (ru) * | 1995-12-11 | 2003-03-27 | Мерк Патент Гмбх | Способ получения чужеродного протеина в клетках e.coli, плазмидный вектор и трансформированный штамм е.coli для экспрессии чужеродного протеина |
| WO2007129087A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-15 | The University Of Birmingham | Plasmid curing |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Graeslund S. et al.: "Protein production and purification", Nat Methods. 2008 Feb; 5(2):135-46. * |
| Graeslund S. et al.: "Protein production and purification", Nat Methods. 2008 Feb; 5(2):135-46. Spadiut O. et al.: "A comparative summary of expression systems for the recombinant production of galactose oxidase", Spadiut et al. Microbial Cell Factories 2010, 9:68, (реферат). * |
| Spadiut O. et al.: "A comparative summary of expression systems for the recombinant production of galactose oxidase", Spadiut et al. Microbial Cell Factories 2010, 9:68, (реферат). * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011150908A (ru) | 2013-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111278852B (zh) | 重组欧氏杆菌天冬酰胺酶的生产方法 | |
| KR20190082318A (ko) | Crispr/cpf1 시스템 및 방법 | |
| JPH09510611A (ja) | ポリペプチドの分泌促進 | |
| KR20160128362A (ko) | 대장균에서 재조합 ｃｒｍ197의 향상된 생산 | |
| JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| KR20220061126A (ko) | 카스파제-2 변이체 | |
| CN112313336A (zh) | 一种用于优化抗体表达的方法 | |
| JP2023517162A (ja) | 枯草菌及びエンドヌクレアーゼを使用したヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の生成 | |
| JP5794985B2 (ja) | マンノースプロモーターを含むベクター及びマンノースプロモーター | |
| CA2983894C (en) | Uncoupling growth and protein production | |
| US20130059338A1 (en) | Artificial entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production | |
| JP2013501511A (ja) | 発酵法 | |
| JP4117033B2 (ja) | 化学物質の生合成による製造方法 | |
| CN106834252B (zh) | 一种高稳定型MazF突变体及其应用 | |
| JP2020533980A (ja) | 組換えタンパク質の分泌を増加させる方法 | |
| KR101841264B1 (ko) | 효모 자식작용 활성화 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 결정화 방법 | |
| RU2496877C2 (ru) | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА | |
| US8080387B2 (en) | Method for preparing soluble and active recombinant proteins usins PDI as a fusion partner | |
| RU2580031C2 (ru) | ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pET-His8-TrxL-Acip1, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АЦИПЕНСИНА-1 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА | |
| US20090239262A1 (en) | Affinity Polypeptide for Purification of Recombinant Proteins | |
| JP7549881B2 (ja) | 進化したプロテアーゼとプロテアーゼ切断部位の選択システム | |
| RU2817891C1 (ru) | Продуцент l-аспарагиназы e. coli и экспрессионная плазмида pet28a-asnsyn, кодирующая l-аспарагиназу | |
| RU2842532C1 (ru) | Нуклеиновая кислота для получения рекомбинантной эндонуклеазы Serratia marcescens (варианты) и генетические конструкции, её содержащие | |
| Ubeidat et al. | Expression and one-step purification of a developmentally regulated protein from Dictyostelium discoideum | |
| RU2347811C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET-KSI-Buf2, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД БУФОРИН-2, ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА БУФОРИНА-2 |