RU2478713C1

RU2478713C1 - OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS BmVAT7-Ch2s/BmVAT7-Ch2as FOR DETECTING DIFFERENTIATION FRAGMENT BMAA0871 OF EQUINIA AGENT STRAINS

Info

Publication number: RU2478713C1
Application number: RU2012102757/10A
Authority: RU
Inventors: Сергей Сергеевич Савченко; Валерий Алексеевич Антонов; Ольга Сергеевна Ульянова; Виктория Владимировна Алексеева; Ольга Викторовна Зинченко; Галина Александровна Ткаченко
Priority date: 2012-01-26
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2013-04-10

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: invention refers to biotechnology, molecular biology, molecular epidemiology. There are presented oligonucleotide primers for B. mallei genetic typing by polymerase chain reaction.

EFFECT: invention may be used in medicine for detecting an equinia agent.

3 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярной эпидемиологии и может быть использовано в медицине для обнаружения дифференцирующего фрагмента ДНК ВМАА0871 в составе схемы генотипирования возбудителя сапа Burkholderia mallei как для практического здравоохранения, службы Роспотребнадзора, так и для научных исследований.The invention relates to biotechnology, molecular biology, molecular epidemiology and can be used in medicine to detect the differentiating DNA fragment of BMAA0871 as part of the genotyping scheme of the causative agent of glanders Burkholderia mallei both for practical healthcare, the Rospotrebnadzor service, and for scientific research.

Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia и относящаяся к потенциальным агентам биотерроризма группы В. Caп - особо опасная зоонозная инфекция. Необходимость исследований, направленных на генотипирование штаммов В.mallei, связана с сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций, обусловленных возникновением техногенных катастроф, природных катаклизмов, и возможных террористических актов с использованием этого возбудителя.The causative agent of glanders (Burkholderia mallei) is an aerobic gram-negative non-fermenting bacterium belonging to the genus Burkholderia and belonging to potential agents of group B bioterrorism. Cap is a particularly dangerous zoonotic infection. The need for research aimed at the genotyping of B. mallei strains is associated with the continued threat of biological emergencies caused by technological disasters, natural disasters, and possible terrorist attacks using this pathogen.

Генотипирование - комплексный анализ уникального для каждого живого организма генотипа на основе изучения его ДНК. Метод генотипирования на основе анализа вариабельных ампликонов (VAT - variable amplicontyping) заключается в серии полимеразных цепных реакций с праймерами, фланкирующими фрагменты уникальных ДНК-мишеней, существующих только у определенных штаммов, что позволяет проводить внутривидовую дифференциацию.Genotyping is a complex analysis of a genotype unique to each living organism based on the study of its DNA. The genotyping method based on analysis of variable amplicons (VAT - variable amplicontyping) consists of a series of polymerase chain reactions with primers flanking fragments of unique DNA targets that exist only in certain strains, which allows for intraspecific differentiation.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления целевых участков ДНК. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.The polymerase chain reaction method is a direct method for identifying target DNA sites. The PCR method is based on the natural process of DNA replication - the complementary completion of the DNA matrix, carried out using the enzyme DNA polymerase.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных штаммов определенного вида микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генотипирования возбудителя сапа.The nucleic acid doubling process can be used to obtain copies of short sections of DNA specific for specific strains of a certain type of microorganism, i.e. to carry out a targeted search for such specific sites, which is the goal of genotyping the glanders pathogen.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для определенных штаммов возбудителя сапа. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах дифференцирующего фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПНР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.For effective PCR, primers are needed - synthetic oligonucleotides of a certain size, specific for certain strains of the glanders pathogen. The primers are complementary to the DNA sequences on the left and right borders of the differentiating fragment and are oriented in such a way that the completion of a new DNA chain proceeds only between them. As a result of NDP, there is a multiple increase in the number of copies (amplification) of a specific gene region, catalyzed by the enzyme DNA polymerase. The choice of a specific fragment and the selection of primers plays a crucial role in the specificity of the amplification, which affects the quality of the analysis of the studied microorganisms.

Наиболее близким аналогом является схема генотипирования с использованием амплификации дифференцирующих фрагментов для возбудителя мелиоидоза, предложенная Kwanjit Duangsonk с соавторами в 2006 г. [Use of a Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Duangsonk, Daniel Gal, Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie, and Craig Winstanley]. Для возбудителя сапа подобных исследований ранее не проводилось.The closest analogue is the genotyping scheme using amplification of differentiating fragments for the causative agent of melioidosis, proposed by Kwanjit Duangsonk et al. In 2006 [Use of a Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Daniel , Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie, and Craig Winstanley]. For the causative agent of glanders, such studies have not been previously conducted.

Целью настоящего изобретения является получение олигонуклеотидных праймеров для идентификации дифференцирующего фрагмента генома ВМАА0871 В.mallei методом полимеразной цепной реакции.An object of the present invention is to provide oligonucleotide primers for identifying a differentiating fragment of B. mallei BMAA0871 genome by polymerase chain reaction.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации вариабельного фрагмента ДНК штаммов возбудителя сапа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:The goal is achieved by the construction of specific oligonucleotides to identify a variable DNA fragment of strains of the pathogen glanders with direct and reverse primers in the amplification reaction, having the following structure:

5'-СТСАССТТССТТGGAGAGCC-3'-BmVAT7-Ch2s5'-STSASSTTSSTTGGAGAGCC-3'-BmVAT7-Ch2s

5'-AGCGAATAGCCGTTGGTTTC-3'-BmVAT7-Ch2as5'-AGCGAATAGCCGTTGGTTTC-3'-BmVAT7-Ch2as

Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.Characterization of oligonucleotide primers and amplified DNA site.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные BMVA T7-CH2S/BMVAT7-CH2AS, комплементарные дифференцирующему фрагменту ВМАА0871 для внутривидового типирования В.mallei. Расчетная длина специфического фрагмента составляет 166 п.н.Based on the data presented in the GenBank NCBI database (National Center for Biotechnology Information, USA), primers designated BMVA T7-CH2S / BMVAT7-CH2AS complementary to the differentiating fragment of BMAA0871 for intraspecific typing of B. mallei were selected. The estimated length of the specific fragment is 166 bp

Апробация праймеров и зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя сапа коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.Testing of the primers and the probe was carried out on a set of strains of the pathogen glanders of the collection center of the SLC of the Volgograd Research Anti-Plague Institute.

Примеры конкретного выполнения.Examples of specific performance.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для обнаружения дифференцирующего фрагмента ВМАА0871 ДНК возбудителя сапа методом ПЦР.Example 1. The method of designing oligonucleotide primers to detect the differentiating fragment of BMAA0871 DNA of the pathogen glanders by PCR.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей четырех штаммов возбудителя сапа, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования праймеров был выбран фрагмент вариабельной последовательности ВМАА0871, обнаруженной in silico на второй хромосоме штаммов В.mallei SA VP1 и В.mallei ATCC 22344. В составе генома штамма В.mallei NCTC 10229, В.mallei NCTC 10247 данного фрагмента обнаружено не было. Данный факт позволил рассматривать участок последовательности ВМАА0871 в качестве дифференцирующего фрагмента, пригодного для генотипирования возбудителя сапа. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами - 166 п.н.Based on a theoretical study of the sequenced nucleotide sequences of four glanders pathogen strains present in the databases (EMBL, Genbank, DDBJ), a fragment of the BMAA0871 variable sequence found in silico on the second chromosome of B. mallei SA VP1 and B. mallei strains was selected for primers. ATCC 22344. This fragment was not found in the genome of strain B.mallei NCTC 10229, B.mallei NCTC 10247. This fact made it possible to consider a portion of the BMAA0871 sequence as a differentiating fragment suitable for genotyping of glanders. The estimated length of the DNA fragment flanked by the proposed primers is 166 bp

При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.Using computer programs, the structure of the selected pairs of primers (the formation of dimers, hairpins, and other secondary structures) was analyzed and their theoretical suitability for the successful initiation of the amplification reaction was shown.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для внутривидовой дифференциации возбудителя сапа.Example 2. Amplification of specific DNA fragments using designed primers for intraspecific differentiation of the pathogen glanders.

В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-полимераза. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. Для отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды. Амплификацию продолжительностью 40 циклов проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.Москва) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».The composition of the reaction mixtures included primers complementary to the specific fragment, deoxyribonucleoside triphosphates, buffer solution and Taq polymerase enzyme. To prevent evaporation during amplification on the Tertsik multicycle, 20 μl of mineral oil was layered on the surface of the mixture. For negative control, the same volume of distilled water was added to the tube instead of the sample. Amplification lasting 40 cycles was carried out in microcentrifuge tubes (0.5 ml) on a Tertsik multicycle (ZAO NPF DNA Technology, Moscow) in a volume of 25 μl using a “hot start”.

Условия проведения реакции: этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 40 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 60°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.Reaction conditions: the stage of preliminary denaturation of DNA at 95 ° C for 5 minutes, then for 40 cycles - denaturation of DNA at 95 ° C for 10 sec; primer annealing at 60 ° С - 10 sec; chain elongation at 72 ° C for 10 sec, with final polymerization for 1 min.

Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая их подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса (рис.1). Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 100 п.н. ДНК, ООО «Интерлабсервис», Москва) и ДНК-стандарту (ДНК, выделенная из В. mallei Ц-5 в концентрации 1×10⁵ м.к./мл).PCR products were analyzed by electrophoresis on a 3% agarose gel, comparing their mobility with the mobility of the molecular weight marker bands (Fig. 1). The specificity of the amplified DNA band was confirmed by its position with respect to the control marker fragments (100 bp DNA leader, Interlabservis LLC, Moscow) and the DNA standard (DNA isolated from B. mallei C-5 at a concentration of 1 × 10 ⁵ m.k. / ml).

Пример 3. Использование олигонуклеотидных праймеров BMVAT7-CH2S/BMVAT7-CH2AS в составе схемы дифференциации штаммов возбудителя сапа на музейных штаммах коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.Example 3. The use of oligonucleotide primers BMVAT7-CH2S / BMVAT7-CH2AS as part of the differentiation scheme of strains of the pathogen glanders in museum strains of the collection center of living cultures of the Volgograd Scientific Research Anti-Plague Institute.

Специфичность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток, выращенных на плотных питательных средах в 4 мл 0,15 М NaСl в концентрации, соответствующей 1×10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-85 П). Обеззараживание материала проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 и МУ 3.5.5.1034-01.The specificity of the amplification reaction with the developed specific primers was evaluated in the study of DNA samples isolated from bacterial suspensions of cells grown on solid nutrient media in 4 ml of 0.15 M NaCl in a concentration corresponding to 1 × 10 ⁹ MK / ml according to a standard turbidity sample GISK them. L.A. Tarasevich (OSO 42-28-85 P). Disinfection of the material was carried out in accordance with MU 1.3.1794-03 and MU 3.5.5.1034-01.

Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий осуществляли с помощью метода нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата (R.Boom et al. - 1990 г.). Постановку реакции ПЦР осуществляли как описано в примере 2.The test samples were disinfected by adding a sodium thiolate solution to a final concentration of 0.1% and heating for 40 minutes at a temperature of 56 ° C. DNA was isolated from pure cultures of burkholderia using the method of nucleosorption on silica gel in the presence of guanidine thiocyanate (R.Boom et al. - 1990). The PCR reaction was carried out as described in example 2.

При тестировании коллекции культур В. mallei Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался с ДНК следующих штаммов возбудителя сапа: В. mallei Ц-4, В.mallei Ц-5, В.mallei 11, В.mallei 8, В.mallei V-120, В. mallei P-1, B. mallei Иванович, В.mallei 5584, В.mallei Z-12. Co штаммами В. mallei Муксувар, В.mallei Загреб, В.mallei Bogor, B.mallei 10230 и В.mallei Будапешт в реакции ПНР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат (рис.2).When testing the culture collection of B. mallei of the Volgograd Research Anti-Plague Institute using the developed oligonucleotide primers, the amplification product was synthesized with the DNA of the following strains of glanders: B. mallei C-4, B. mallei C-5, B. mallei 11, B. mallei 8, B. mallei V-120, B. mallei P-1, B. mallei Ivanovich, B. mallei 5584, B. mallei Z-12. With strains of B. mallei Muksuvar, B. mallei Zagreb, B. mallei Bogor, B. mallei 10230 and B. mallei Budapest in the reaction of the NDP with the developed primers, a negative result was obtained in 100% of cases (Fig. 2).

На основе анализа вариабельных ампликонов нами разработана схема генотипирования возбудителя сапа, состоящая из 9 реакций амплификации. Сочетание положительных и отрицательных результатов ПЦР формирует VAT-паттерны, уникальные для каждого штамма возбудителя сапа (рис.3А).Based on the analysis of variable amplicons, we developed a genotyping scheme for the glanders pathogen, consisting of 9 amplification reactions. The combination of positive and negative PCR results in the formation of VAT patterns that are unique for each glanders pathogen strain (Fig. 3A).

Таким образом, с использованием разработанных праймеров BMVAT7-CH2S/BMVA T7-CH2AS в составе схемы внутривидовой дифференциации возбудителя сапа методом VAT, удалось разделить 18 исследуемых штаммов В.mallei на 15 типов (рис.3).Thus, using the developed BMVAT7-CH2S / BMVA T7-CH2AS primers as a part of the intraspecific differentiation scheme of the glanders pathogen by the VAT method, it was possible to divide 18 studied B.mallei strains into 15 types (Fig. 3).

Claims

Oligonucleotide primers for B. mallei genotyping by polymerase chain reaction, with forward and reverse primer activity in the amplification reaction, having the following structure:
5'-STS ACC TTS STT GGA GAG CC-3'-BmVAT7-Ch2s
5'-AGC GAA TAG CCG TTG GTT TC-3'-BmVAT7-Ch2as
complementary to the differentiating fragment of the genome of the causative agent of glanders BMAA0871.