RU2474617C1

RU2474617C1 - OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR GENETIC TYPING B. mallei BY POLYMERASE CHAIN REACTION

Info

Publication number: RU2474617C1
Application number: RU2012102751/10A
Authority: RU
Inventors: Сергей Сергеевич Савченко; Валерий Алексеевич Антонов; Ольга Сергеевна Ульянова; Виктория Владимировна Алексеева; Ольга Викторовна Зинченко; Галина Александровна Ткаченко
Priority date: 2012-01-26
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2013-02-10

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: primers are complementary to a differentiation fragment BMA10247-A1008 of an equinia agent genome possess activity of upstream and downstream primers in an amplification reaction and has the following structure: 5'-CGAACCCACACGAGCCTA-3' - BmVAT9-Ch2s 5'-GCGAAGATTCCGAAGATGC-3' - BmVAT9-Ch2as. The presented invention may be used in practical healthcare for detection of the differentiation DNA fragment BMA 10247_A1008 of the equinia agent.

EFFECT: higher primer activity.

3 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярной эпидемиологии и может быть использовано в медицине для обнаружения дифференцирующего фрагмента ДИК ВМА10247_А1008 в составе схемы генотипирования возбудителя сапа Burkholderia mallei как для практического здравоохранения, службы Роспотребнадзора, так и для научных исследований.The invention relates to biotechnology, molecular biology, molecular epidemiology and can be used in medicine to detect a differentiating fragment of DIC ВМА10247_А1008 as part of the genotyping scheme of the causative agent of glanders Burkholderia mallei both for practical health care, the Rospotrebnadzor service, and for scientific research.

Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia и относящаяся к потенциальным агентам биотерроризма группы В. Сап - особо опасная зоонозная инфекция. Необходимость исследований, направленных на генотипирование штаммов В.mallei, связана с сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций, обусловленных возникновением техногенных катастроф, природных катаклизмов и возможных террористических актов с использованием этого возбудителя.The causative agent of glanders (Burkholderia mallei) is an aerobic gram-negative non-fermenting bacterium belonging to the genus Burkholderia and belonging to potential agents of Group B bioterrorism. Sap is a particularly dangerous zoonotic infection. The need for research aimed at the genotyping of B. mallei strains is associated with the continued threat of biological emergencies caused by technological disasters, natural disasters and possible terrorist attacks using this pathogen.

Генотипирование - комплексный анализ уникального для каждого живого организма генотипа на основе изучения его ДНК. Метод генотипирования на основе анализа вариабельных ампликонов (VAT - variable amplicon typing) заключается в серии полимеразных цепных реакций с праймерами, фланкирующими фрагменты уникальных ДНК-мишеней, существующих только у определенных штаммов, что позволяет проводить внутривидовую дифференциацию.Genotyping is a complex analysis of a genotype unique to each living organism based on the study of its DNA. The method of genotyping based on analysis of variable amplicons (VAT - variable amplicon typing) consists of a series of polymerase chain reactions with primers flanking fragments of unique DNA targets that exist only in certain strains, which allows for intraspecific differentiation.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления целевых участков ДНК. В основе метода ПНР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.The polymerase chain reaction method is a direct method for identifying target DNA sites. The PNR method is based on the natural process of DNA replication - the complementary completion of the matrix DNA, carried out using the DNA polymerase enzyme.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных штаммов определенного вида микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генотипирования возбудителя сапа.The nucleic acid doubling process can be used to obtain copies of short sections of DNA specific for specific strains of a certain type of microorganism, i.e. to carry out a targeted search for such specific sites, which is the goal of genotyping the glanders pathogen.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для определенных штаммов возбудителя сапа. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах дифференцирующего фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.For effective PCR, primers are needed - synthetic oligonucleotides of a certain size, specific for certain strains of the glanders pathogen. The primers are complementary to the DNA sequences on the left and right borders of the differentiating fragment and are oriented in such a way that the completion of a new DNA chain proceeds only between them. As a result of PCR, there is a multiple increase in the number of copies (amplification) of a specific region of the gene, catalyzed by the DNA polymerase enzyme. The choice of a specific fragment and the selection of primers plays a crucial role in the specificity of the amplification, which affects the quality of the analysis of the studied microorganisms.

Наиболее близким аналогом является схема генотипирования с использованием амплификации дифференцирующих фрагментов для возбудителя мелиоидоза, предложенная Kwanjit Duangsonk с соавторами в 2006 г. [Use of a Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Duangsonk, Daniel Gal, Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie, and Craig Winstanley]. Для возбудителя сапа подобных исследований ранее не проводилось.The closest analogue is the genotyping scheme using amplification of differentiating fragments for the causative agent of melioidosis, proposed by Kwanjit Duangsonk et al. In 2006 [Use of a Variable Amplicon Typing Scheme Reveals Considerable Variation in the Accessory Genomes of Isolates of Burkholderia pseudomallei, Kwanjit Daniel , Mark Mayo, C. Anthony Hart, Bart J. Currie, and Craig Winstanley]. For the causative agent of glanders, such studies have not been previously conducted.

Целью настоящего изобретения является получение олигонуклеотидных праймеров для идентификации дифференцирующего фрагмента генома ВМА10247_А1008 В.mallei методом полимеразной цепной реакции.The aim of the present invention is to obtain oligonucleotide primers for identifying a differentiating fragment of the B. mallei BMA10247_A1008 genome by polymerase chain reaction.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации вариабельного фрагмента ДНК штаммов возбудителя сапа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:The goal is achieved by the construction of specific oligonucleotides to identify a variable DNA fragment of strains of the pathogen glanders with direct and reverse primers in the amplification reaction, having the following structure:

5'-CGAACCCACACGAGCCTA-3'-BmVAT9-Ch2s5'-CGAACCCACACGAGCCTA-3'-BmVAT9-Ch2s

5'-GCGAAGATTCCGAAGATGC-3'-BmVAT9-Ch2as5'-GCGAAGATTCCGAAGATGC-3'-BmVAT9-Ch2as

Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.Characterization of oligonucleotide primers and amplified DNA site.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные BMVAT9-CH2S/BMVAT9-CH2AS, комплементарные дифференцирующему фрагменту ВМА10247_А1008 для внутривидового типирования В.mallei. Расчетная длина специфического фрагмента составляет 472 п.н.Based on the data presented in the GenBank NCBI database (National Center for Biotechnology Information, USA), primers designated BMVAT9-CH2S / BMVAT9-CH2AS complementary to the differentiating fragment BMA10247_A1008 for intraspecific typing of B. mallei were selected. The estimated length of the specific fragment is 472 bp

Апробация праймеров и зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя сапа коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.Testing of the primers and the probe was carried out on a set of strains of the pathogen glanders of the collection center of the SLC of the Volgograd Research Anti-Plague Institute.

Примеры конкретного выполнения.Examples of specific performance.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для обнаружения дифференцирующего фрагмента ВМА10247_А1008 ДНК возбудителя сапа методом ПЦР.Example 1. The method of designing oligonucleotide primers to detect the differentiating fragment of BMA10247_A1008 DNA of the pathogen glanders by PCR.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей четырех штаммов возбудителя сапа, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования праймеров был выбран фрагмент вариабельной последовательности ВМА10247_А1008, обнаруженной in silico на второй хромосоме штаммов В.mallei NCTC 10247 и В.mallei NCTC 10229. В составе генома штамма В.mallei SAVP1 и В.mallei АТСС 23344 данного фрагмента обнаружено не было. Данный факт позволил рассматривать участок последовательности ВМА10247_А1008 в качестве дифференцирующего фрагмента, пригодного для генотипирования возбудителя сапа. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 472 п.н.Based on a theoretical study of the sequenced nucleotide sequences of the four glanders pathogen strains present in the databases (EMBL, Genbank, DDBJ), a fragment of the variable sequence BMA10247_A1008, found in silico on the second chromosome of B.mallei NCTC 10247 and B.mallei strains, was selected for primer design. NCTC 10229. This fragment was not found in the genome of strain B.mallei SAVP1 and B.mallei ATCC 23344. This fact made it possible to consider a portion of the BMA10247_A1008 sequence as a differentiating fragment suitable for genotyping of glanders. The estimated length of the DNA fragment flanked by the proposed primers is 472 bp

При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.Using computer programs, the structure of the selected pairs of primers (the formation of dimers, hairpins, and other secondary structures) was analyzed and their theoretical suitability for the successful initiation of the amplification reaction was shown.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для внутривидовой дифференциации возбудителя сапа.Example 2. Amplification of specific DNA fragments using designed primers for intraspecific differentiation of the pathogen glanders.

В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Tag-полимераза. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. Для отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды. Амплификацию продолжительностью 40 циклов проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г. Москва) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».The composition of the reaction mixtures included primers complementary to the specific fragment, deoxyribonucleoside triphosphates, buffer solution and Tag polymerase enzyme. To prevent evaporation during amplification on the Tertsik multicycle, 20 μl of mineral oil was layered on the surface of the mixture. For negative control, the same volume of distilled water was added to the tube instead of the sample. Amplification lasting 40 cycles was carried out in microcentrifuge tubes (0.5 ml) on a Tertsik multicycle (ZAO NPF DNA Technology, Moscow) in a volume of 25 μl using a “hot start”.

Условия проведения реакции: этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 40 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 60°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.Reaction conditions: the stage of preliminary denaturation of DNA at 95 ° C for 5 minutes, then for 40 cycles - denaturation of DNA at 95 ° C for 10 sec; primer annealing at 60 ° С - 10 sec; chain elongation at 72 ° C for 10 sec, with final polymerization for 1 min.

Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая их подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса (рис.1). Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 100 п.н. ДНК, ООО «Интерлабсервис», Москва) и ДНК-стандарту (ДНК, выделенная из В.mallei Ц-5 в концентрации 1×10⁵ м.к./мл).PCR products were analyzed by electrophoresis on a 3% agarose gel, comparing their mobility with the mobility of the molecular weight marker bands (Fig. 1). The specificity of the amplified DNA band was confirmed by its position with respect to the control marker fragments (100 bp DNA leader, Interlabservis LLC, Moscow) and the DNA standard (DNA extracted from B. mallei C-5 at a concentration of 1 × 10 ⁵ m.k. / ml).

Пример 3. Использование олигонуклеотидных праймеров BMVAT9-CH2S/BMVAT9-CH2AS в составе схемы дифференциации штаммов возбудителя сапа на музейных штаммах коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.Example 3. The use of oligonucleotide primers BMVAT9-CH2S / BMVAT9-CH2AS as part of the differentiation scheme of strains of the pathogen glanders in museum strains of the collection center for living cultures of the Volgograd Scientific Research Anti-Plague Institute.

Специфичность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток, выращенных на плотных питательных средах в 4 мл 0,15 М NaCl в концентрации, соответствующей 1×10⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-85 П). Обеззараживание материала проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 и МУ 3.5.5.1034-01.The specificity of the amplification reaction with the developed specific primers was evaluated in the study of DNA samples isolated from bacterial suspensions of cells grown on solid nutrient media in 4 ml of 0.15 M NaCl at a concentration corresponding to 1 × 10 ⁹ MK / ml according to the standard turbidity sample GISK them. L.A. Tarasevich (OSO 42-28-85 P). Disinfection of the material was carried out in accordance with MU 1.3.1794-03 and MU 3.5.5.1034-01.

Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий осуществляли с помощью метода нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата (R.Boom et al. - 1990 г). Постановку реакции ПЦР осуществляли, как описано в примере 2.The test samples were disinfected by adding a sodium thiolate solution to a final concentration of 0.1% and heating for 40 minutes at a temperature of 56 ° C. DNA was isolated from pure cultures of burkholderia using the method of nucleosorption on silica gel in the presence of guanidine thiocyanate (R.Boom et al. - 1990 g). The PCR reaction was carried out as described in example 2.

При тестировании коллекции культур В.mallei Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался с ДНК следующих штаммов возбудителя сапа: В.mallei Ц-4, В.mallei Ц-5, В.mallei 11, В.mallei V-120, В.mallei 8, В.mallei P-1, В.mallei 10230, В.mallei Иванович, В.mallei 5584, В.mallei Z-12 и В.mallei Будапешт. Со штаммами В.mallei Муксувар, В.mallei Загреб и В.mallei Bogor в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат (рис.2).When testing the B.mallei culture collection of the Volgograd Research Anti-Plague Institute using the developed oligonucleotide primers, the amplification product was synthesized with the DNA of the following glanders: B. mallei C-4, B. mallei C-5, B. mallei 11, B. mallei V-120, B. mallei 8, B. mallei P-1, B. mallei 10230, B. mallei Ivanovich, B. mallei 5584, B. mallei Z-12 and B. mallei Budapest. With strains of B. mallei Muksuvar, B. mallei Zagreb and B. mallei Bogor, a negative result was obtained in 100% of the PCR reactions with the developed primers (Fig. 2).

На основе анализа вариабельных ампликонов нами разработана схема генотипирования возбудителя сапа, состоящая из 9 реакций амплификации. Сочетание положительных и отрицательных результатов ПЦР формирует VAT-паттерны, уникальные для каждого штамма возбудителя сапа (рис.3А).Based on the analysis of variable amplicons, we developed a genotyping scheme for the glanders pathogen, consisting of 9 amplification reactions. The combination of positive and negative PCR results in the formation of VAT patterns that are unique for each glanders pathogen strain (Fig. 3A).

Таким образом, с использованием разработанных праймеров BMVAT9-CH2S/BMVAT9-CH2AS в составе схемы внутривидовой дифференциации возбудителя сапа методом VAT удалось разделить 18 исследуемых штаммов В.mallei на 15 типов (рис.3).Thus, using the developed BMVAT9-CH2S / BMVAT9-CH2AS primers as a part of the intraspecific differentiation scheme of the glanders pathogen by the VAT method, it was possible to divide 18 studied B.mallei strains into 15 types (Fig. 3).

Claims

Oligonucleotide primers for genotyping of B. mallei by polymerase chain reaction, with forward and reverse primer activity in the amplification reaction, having the following structure:
5'-CGAACCCACACGAGCCTA-3'-BmVAT9-Ch2s
5'-GCGAAGATTCCGAAGATGC-3'-BmVAT9-Ch2as
complementary to the differentiating fragment of the genome of the causative agent of glanders ВМА10247-А1008.