RU2435860C1 - FLUORESCENT-MARKED OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS AGENTS Bpseudomallei AND Bmallei - Google Patents
FLUORESCENT-MARKED OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS AGENTS Bpseudomallei AND Bmallei Download PDFInfo
- Publication number
- RU2435860C1 RU2435860C1 RU2010126433/10A RU2010126433A RU2435860C1 RU 2435860 C1 RU2435860 C1 RU 2435860C1 RU 2010126433/10 A RU2010126433/10 A RU 2010126433/10A RU 2010126433 A RU2010126433 A RU 2010126433A RU 2435860 C1 RU2435860 C1 RU 2435860C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- glanders
- melioidosis
- dna
- agents
- fluorescence
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителей сапа и мелиоидоза В. pseudomallei и В. mallei в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.The invention relates to biotechnology, molecular biology, and can be used in medicine to identify the genetic material of glanders and melioidosis pathogens B. pseudomallei and B. mallei in samples both for diagnosis in practical health care and the Rospotrebnadzor service, and for scientific research.
Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) и возбудитель мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - аэробные грамотрицательные неферментирующие бактерии, принадлежащие к роду Burkholderia. Мелиоидоз - эндемичное для Австралии и ряда стран Юго-Восточной Азии инфекционное заболевание людей и животных. Сап - особо опасная зоонозная инфекция.The causative agent of glanders (Burkholderia mallei) and the causative agent of melioidosis (Burkholderia pseudomallei) are aerobic gram-negative non-fermenting bacteria belonging to the genus Burkholderia. Melioidosis is an infectious disease in humans and animals endemic to Australia and a number of Southeast Asian countries. Sap is a particularly dangerous zoonotic infection.
Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных патогенных буркхольдерий. И обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.The polymerase chain reaction method is a direct method for detecting the DNA of these pathogenic burkholdery. And it has high specificity and sensitivity. The PCR method is based on the natural process of DNA replication - the complementary completion of the DNA matrix, carried out using the enzyme DNA polymerase.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза.The nucleic acid doubling process can be used to obtain copies of short sections of DNA specific for specific microorganisms, i.e. to carry out a targeted search for such specific sites, which is the purpose of gene diagnostics to identify pathogens of glanders and melioidosis.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микроорганизмов.For effective PCR, primers are needed - synthetic oligonucleotides of a certain size, specific for each type of pathogen. The primers are complementary to the DNA sequences on the left and right borders of a specific fragment and are oriented in such a way that the completion of a new DNA chain proceeds only between them. As a result of PCR, there is a multiple increase in the number of copies (amplification) of a specific region of the gene, catalyzed by the DNA polymerase enzyme. The choice of a specific fragment and the selection of primers plays a crucial role in the specificity of the amplification, which affects the quality of the analysis of the studied microorganisms.
Использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и соответственно уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Существует множество флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данной работе использовались зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков» (molecular beacons).The use of special fluorescent labels allows you to abandon the electrophoresis stage, which reduces the risk of cross-contamination with PCR products and, accordingly, reduces the number of false positive results. Since the results are recorded directly during the amplification reaction, the entire analysis can be carried out in one or two rooms of the laboratory by one employee. This approach allows automatic interpretation of the results and removes the problem of subjective assessment of electrophoregrams. There are many fluorescence technologies that differ in how reporter fluorescence is generated. In this work, probes with complementary terminal sequences of the molecular beacons type were used.
Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры на основе фрагментов гена fliC флагеллярного гена B.pseudomallei, В.mallei, предложенные Tungpradabkul S., Sonthayanon P., Krasao Р. и Panyim S. в 2001 г. (PCR of flagellin-based detection of Burkholderia pseudomallei and the mixed population with Burkholderia thailandensis: an application for direct detection from soil. World Melioidosis Congress. - Western Australia, 2001. - Abstract 59). Однако эти разработки предназначались для решения вопросов экологии буркхольдерий, в частности изучения взаимоотношений между B.pseudomallei и В.thailandensis во внешней среде. Предлагаемую тест-систему не апробировали на клиническом материале, хотя авторы и рекомендовали ее использовать при проведении эпидемиологических исследований. Культуры возбудителя сапа в указанной работе не изучались. В работе L.D.Sprague с соавторами (A possible pitfall in the identification of Burkholderia mallei using molecular identification systems based on the sequence of molecular identification systems of the the flagellin fliC gene. FEMS Immunology and Med. Microbiol. - 2002. - Vol.34. - P.231-236) оценивалась возможность использования последовательности fliC для создания системы, дифференцирующей B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis. Проведенное секвенирование флагеллярного гена четырех штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза показало наличие всего лишь одной нуклеотидной замены. В ПЦР с использованием олигонуклеотидных затравок, сконструированных на основе этого региона флагеллярного гена, ампликоны размером 400 п.н. синтезировались при исследовании ДНК всех трех исследуемых микроорганизмов. Поэтому специфичность анализа достигалась дополнительным проведением рестрикционного анализа.The closest analogue is specific primers based on fragments of the fliC gene of the flagellar gene B. pseudomallei, B. mallei, proposed by Tungpradabkul S., Sonthayanon P., Krasao R. and Panyim S. in 2001 (PCR of flagellin-based detection of Burkholderia pseudomallei and the mixed population with Burkholderia thailandensis: an application for direct detection from soil. World Melioidosis Congress. - Western Australia, 2001. - Abstract 59). However, these developments were intended to address the ecology of burkholdery, in particular the study of the relationship between B. pseudomallei and B. thailandensis in the external environment. The proposed test system was not tested on clinical material, although the authors recommended it to be used in epidemiological studies. The cultures of glanders were not studied in this work. LDSprague et al. (A possible pitfall in the identification of Burkholderia mallei using molecular identification systems based on the sequence of molecular identification systems of the flagellin fliC gene. FEMS Immunology and Med. Microbiol. - 2002. - Vol. 34. - P.231-236) assessed the possibility of using the fliC sequence to create a system that differentiates B.pseudomallei, B.mallei and B.thailandensis. Sequencing of the flagellar gene of four strains of glanders and melioidosis pathogens showed the presence of only one nucleotide substitution. In PCR using oligonucleotide primers designed based on this region of the flagellar gene, 400 bp amplicons were synthesized in the study of DNA of all three investigated microorganisms. Therefore, the specificity of the analysis was achieved by additional restriction analysis.
Попытка повышения специфичности указанных выше праймеров путем использования двухстадийной ПЦР была проведена в работе R.M.Hagen с соавторами (Strategies for PCR based detection of DNA in paraffin wax embedded tissues. J. Clin. Pathol: Mol. Pathol. - 2002. - Vol.55. - P.398-400). В этом исследовании ПЦР-метод использовался для анализа чистых культур B.pseudomallei, B.mallei, и B.thailandensis, а также запаянных в парафиновые блоки биоптатов, полученных от экспериментально зараженных B.pseudomallei животных. Однако дифференцировать триаду буркхольдерий с использованием «seminested» - ПЦР не удалось и полученные ампликоны рекомендовано было секвенировать.An attempt to increase the specificity of the above primers using two-step PCR was carried out by RMHagen et al. (Strategies for PCR based detection of DNA in paraffin wax embedded tissues. J. Clin. Pathol: Mol. Pathol. - 2002. - Vol. 55. - P.398-400). In this study, the PCR method was used to analyze pure cultures of B. pseudomallei, B. mallei, and B. thailandensis, as well as paraffin-sealed biopsy specimens obtained from experimentally infected B. pseudomallei animals. However, it was not possible to differentiate the burkholderiad triad using "seminested" - PCR, and it was recommended that the amplicons obtained be sequenced.
Целью настоящего изобретения является получение высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации В.pseudomallei и В.mallei методом полимеразной цепной реакции.An object of the present invention is to provide highly specific oligonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the identification of B. pseudomallei and B. mallei by polymerase chain reaction.
Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:The goal is achieved by the construction of specific oligonucleotides for the identification of DNA of glanders and melioidosis pathogens with direct and reverse primer activity in the amplification reaction, having the following structure:
5'-ACG GTC TCC GTC GAC CTC AC-3'-bfl-1s5'-ACG GTC TCC GTC GAC CTC AC-3'-bfl-1s
5'-CGT TGA TCT GCG CAA CCA TC-3'-bfl-as25'-CGT TGA TCT GCG CAA CCA TC-3'-bfl-as2
Флуоресцентная детекция реализуется при помощи сконструированного олигонуклеотидного зонда с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка»:Fluorescence detection is carried out using the designed oligonucleotide probe with complementary terminal sequences of the type of "molecular beacon":
5'-(FAM)-CGC TGT CGA CTT CGG CAA CCA GCG-(RTQ1)-3'5 '- (FAM) -CGC TGT CGA CTT CGG CAA CCA GCG- (RTQ1) -3'
Где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм. RTQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.Where FAM is carboxyfluorescein, a fluorescent dye whose absorption wavelength is 492 nm and the fluorescence wavelength is 520 nm. RTQ1 is a fluorescence quencher with a quenching range of 470-570 nm.
Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и участка амплифицируемой ДНК.Characterization of oligonucleotide primers, probe and amplified DNA site.
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), были подобраны праймеры, обозначенные bfl-1s/bfl-2a, комплементарные фрагменту гена fliC (флагеллярный ген) для идентификации В.pseudomallei и В.mallei. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 376 п.н.Based on the data presented in the GenBank database of NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA), primers designated bfl-1s / bfl-2a complementary to the fragment of the fliC gene (flagellar gene) were identified for identification of B. pseudomallei and B. mallei. The estimated length of the specific fragment was 376 bp
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме В.pseudomallei 100, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×109 м.к./мл до 1×101 м.к./мл. Апробация праймеров и зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.As a positive control, experiments were carried out on a typical strain of B. pseudomallei 100, using disinfected microorganism suspensions at concentrations from 1 × 10 9 m.k. / ml to 1 × 10 1 m.k. / ml for DNA extraction. Testing of the primers and the probe was carried out on a set of strains of glanders and melioidosis pathogens of the collection center of the IJC of the Volgograd Research Anti-Plague Institute.
Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентной детекцией «по конечной точке» с праймерами bfl-1s/bfl-2a оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза, и составила 1×103 м.к./мл. При использовании ПЦР в режиме реального времени чувствительность реакции удалось повысить до 1×102 м.к./мл.The sensitivity of the amplification reaction with endpoint fluorescence detection with primers bfl-1s / bfl-2a was evaluated by examining DNA samples isolated from ten-fold dilutions of pure cultures of glanders and melioidosis pathogens, and amounted to 1 × 10 3 mk / ml. When using real-time PCR, the sensitivity of the reaction was increased to 1 × 10 2 m.k. / ml.
Для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией оценена возможность использования сконструированных праймеров и зондов для анализа биологического материала (кровь, печень, селезенка, легкие и лимфатические узлы) и при экспериментальной инфекции. Показано, что в реакции амплификации возбудитель детектировался в суспензиях органов от всех золотистых хомячков, зараженных культурой данных микроорганизмов, на всех сроках наблюдения.To detect glanders and melioidosis pathogens by PCR with fluorescence detection, the possibility of using designed primers and probes for the analysis of biological material (blood, liver, spleen, lungs and lymph nodes) and in experimental infections was evaluated. It was shown that in the amplification reaction, the pathogen was detected in organ suspensions from all golden hamsters infected with the culture of these microorganisms at all observation times.
Примеры конкретного выполнения.Examples of specific performance.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и гибридизационного зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР.Example 1. The method of designing oligonucleotide primers and a hybridization probe for identification of DNA pathogens glanders and melioidosis by PCR.
На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей сапа и мелиоидоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ) для конструирования праймеров была выбрана последовательность гена fliC (флагеллярный ген), размер которой составляет 1534 п.н. (GenBank NCBI, GeneID: 4793196). Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 376 п.н.Based on a theoretical study of the sequenced nucleotide sequences of glanders and melioidosis pathogens present in the databases (EMBL, Genbank, DDBJ), the sequence of the fliC gene (flagellar gene) was selected for the design of primers, the size of which is 1534 bp (GenBank NCBI, GeneID: 4793196). The estimated length of the DNA fragment flanked by the proposed primers is 376 bp.
При подборе зондов руководствовались общими требованиями к олигонуклеотидным затравкам, используемым в ПЦР. При использовании компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров и зондов (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.When selecting probes, they were guided by the general requirements for oligonucleotide primers used in PCR. Using computer programs, the structure of the selected pairs of primers and probes (the formation of dimers, hairpins, and other secondary structures) was analyzed and their theoretical suitability for the successful initiation of the amplification and hybridization reaction was shown.
Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.Primers were analyzed using the BLAST computer program on the web server of the National Center for Biotechnological Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to establish homology between them and the nucleotide sequences of closely related burkholderias and heterologous microorganisms present in databases (EMBL, GenBank, DDBJ). At the time of the computer analysis, no homology was detected.
Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров и зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза проводилась в двух форматах: с детекцией результатов ПЦР «по конечной точке» и в режиме реального времени.Example 2. Amplification of specific DNA fragments using the designed primers and probe for identifying the DNA of glanders and melioidosis pathogens was carried out in two formats: with the detection of PCR results "at the end point" and in real time.
В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту олигонуклеотидные зонды, меченные флуорофором FAM и гасителем флуоресценции (RTQ1), а также праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-полимераза. Зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. В ПЦР с детекцией «по конечной точке» использовали 5 мкл образца, с детекцией в режиме реального времени - 10 мкл. Для отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.The reaction mixtures included oligonucleotide probes complementary to the specific fragment labeled with FAM fluorophore and fluorescence quencher (RTQ1), as well as primers, deoxyribonucleoside triphosphates, buffer solution and Taq polymerase enzyme. The probe for internal control was used to test the test systems for specificity and in the analysis of DNA isolation methods. To prevent evaporation during amplification on the Tertsik multicycle, 20 μl of mineral oil was layered on the surface of the mixture. In PCR with detection at the "end point" used 5 μl of the sample, with detection in real time - 10 μl. For negative control, the same volume of distilled water was added to the tube instead of the sample.
Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в микроцентрифужных пробирках (0,5 мл) на мультициклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.Москва) и на приборах «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) и «SmartCycler» (Cepheid, США) в режиме реального времени в микроцентрифужных пробирках (0,2 мл) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».Amplification lasting 45 cycles was carried out in microcentrifuge tubes (0.5 ml) on a Tertsik multicycle (ZAO NPF DNA Technology, Moscow) and on Rotor-Gene 6000 devices (Corbett Research, Australia) and "SmartCycler" (Cepheid, USA) in real time in microcentrifuge tubes (0.2 ml) in a volume of 25 μl using a "hot start".
Анализ продуктов ПЦР осуществляли с помощью детектора флуоресценции «Gene» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.Москва) «по конечной точке» и в режиме реального времени - «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) и «SmartCycler» («Cepheid», США). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью компьютерных программ. В режиме реального времени результаты анализировали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.The analysis of PCR products was carried out using the Gene fluorescence detector (NPF DNA Technology CJSC, Moscow) at the end point and in real time, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Australia) and SmartCycler (Cepheid, USA). The results were recorded in tabular and graphical form using computer programs. In real time, the results were analyzed by the presence or absence of intersection of the fluorescence curve with the threshold line, which is determined by the value of the threshold cycle "Ct" in the corresponding column in the table of results.
Параллельно проводили анализ продуктов ПЦР методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской фрагментов ДНК этидиум бромидом и визуализацией в УФ-свете. Результаты оценивали по наличию или отсутствию в геле после электрофореза фрагментов ДНК необходимого размера.At the same time, PCR products were analyzed by gel electrophoresis in a 1.5% agarose gel with staining of DNA fragments with ethidium bromide and visualization in UV light. The results were evaluated by the presence or absence in the gel after electrophoresis of DNA fragments of the required size.
Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждалась ее положением по отношению к контрольным маркерным фрагментам (леддер 100 п.н. ДНК, ООО «Интерлабсервис», Москва) и ДНК-стандарту (ДНК, выделенная из В.mallei 10230 или В.pseudomallei 100 в концентрации 1×105 м.к./мл).The specificity of the amplified DNA band was confirmed by its position in relation to the control marker fragments (100 bp DNA leader, Interlabservis LLC, Moscow) and the DNA standard (DNA isolated from B.mallei 10230 or B. pseudomallei 100 at a concentration of 1 × 10 5 m.k. / ml).
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза.Example 3. Determination of the sensitivity and specificity of the amplification reaction using the developed oligonucleotide primers and probe for identifying DNA of glanders and melioidosis pathogens.
Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами и зондом оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток, выращенных на плотных питательных средах в 4 мл 0,15 М NaCl в концентрации, соответствующей 1×109 м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-85 П), и раститрованых до необходимых разведений (от 1×109 до 1×10 м.к./мл). Из разведения 1×103 м.к./мл делали контрольный высев по 0,1 мл каждой пробы на чашки Петри с агаром BHI для определения количества КОЕ. Обеззараживание материала проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 и МУ 3.5.5.1034-01.The sensitivity of the amplification reaction with the developed specific primers and probe was evaluated by studying DNA samples isolated from bacterial suspensions of cells grown on solid nutrient media in 4 ml of 0.15 M NaCl at a concentration corresponding to 1 × 10 9 MK / ml according to standard model turbidity GISK them. L.A. Tarasevich (OSO 42-28-85 P), and raised to the required dilutions (from 1 × 10 9 to 1 × 10 m.k. / ml). From a dilution of 1 × 10 3 MK / ml, a control sowing of 0.1 ml of each sample was done on Petri dishes with BHI agar to determine the number of CFU. Disinfection of the material was carried out in accordance with MU 1.3.1794-03 and MU 3.5.5.1034-01.
Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 30 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий осуществляют с помощью метода нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата (R.Boom et al. - 1990 г.). Постановку реакции ПЦР осуществляют, как описано в примере 2. При тестировании коллекции культур В.mallei и В.pseudomallei Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда продукт амплификации синтезировался с ДНК всех штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза с чувствительностью 1×102-1×103 м.к./мл. С другими видами близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.The disinfection of the test samples is carried out by adding a solution of sodium merthiolate to a final concentration of 0.1% and heating for 30 minutes at a temperature of 56 ° C. Isolation of DNA from pure cultures of burkholderia is carried out using the method of nucleosorption on silica gel in the presence of guanidine thiocyanate (R.Boom et al. - 1990). The PCR reaction is carried out as described in Example 2. When testing the culture collection of B.mallei and B. pseudomallei of the Volgograd Research Anti-Plague Institute using the developed oligonucleotide primers and probe, the amplification product was synthesized from DNA of all strains of glanders and melioidosis with a sensitivity of 1 × 10 2 -1 × 10 3 m.k. / ml. With other types of closely related burkholderies and heterologous microorganisms in the PCR reaction with the developed primers, a negative result was obtained in 100% of cases.
Таким образом, разработанные праймеры bfl-1s/bfl-2a и зонд могут быть использованы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителей сапа и мелиоидоза в биологическом материале и объектах окружающей среды.Thus, the developed primers bfl-1s / bfl-2a and the probe can be used to identify glanders and melioidosis pathogens and allow, in a short time, with high sensitivity and specificity to detect glanders and melioidosis pathogens in biological material and environmental objects.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010126433/10A RU2435860C1 (en) | 2010-06-28 | 2010-06-28 | FLUORESCENT-MARKED OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS AGENTS Bpseudomallei AND Bmallei |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010126433/10A RU2435860C1 (en) | 2010-06-28 | 2010-06-28 | FLUORESCENT-MARKED OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS AGENTS Bpseudomallei AND Bmallei |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2435860C1 true RU2435860C1 (en) | 2011-12-10 |
Family
ID=45405571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010126433/10A RU2435860C1 (en) | 2010-06-28 | 2010-06-28 | FLUORESCENT-MARKED OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS AGENTS Bpseudomallei AND Bmallei |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2435860C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2474620C1 (en) * | 2012-01-26 | 2013-02-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS BmVAT5-Ch2s/BmVAT5-Ch2as FOR DETECTING BMAA0107 DIFFERENTIATION FRAGMENT OF EQUINIA AGENT STRAINS |
| RU2545710C2 (en) * | 2013-07-26 | 2015-04-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Oligonucleotide primers burk1526s/burk1526as for assessment of adaptive variability of genome of pathogenic burkholderia |
| RU2545702C2 (en) * | 2013-07-26 | 2015-04-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Oligonucleotide primers burk0090s/burk0090as for assessment of adaptive variability of genome of pathogenic burkholderia |
| RU2551227C1 (en) * | 2014-03-04 | 2015-05-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | SET OF FLUORESCENTLY LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBES FOR TYPING STRAINS OF Burkholderia mallei BY METHOD OF AMPLIFICATION OF DIFFERENTIATING DNA FRAGMENTS |
| RU2556810C1 (en) * | 2014-04-22 | 2015-07-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR IDENTIFICATION OF Burkholderia pseudomallei |
-
2010
- 2010-06-28 RU RU2010126433/10A patent/RU2435860C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| АНТОНОВ В.А. Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. - Волгоград, 2009 (26.11.2009), с.20 (табл.1), с.21-23, с.32, * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2474620C1 (en) * | 2012-01-26 | 2013-02-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS BmVAT5-Ch2s/BmVAT5-Ch2as FOR DETECTING BMAA0107 DIFFERENTIATION FRAGMENT OF EQUINIA AGENT STRAINS |
| RU2545710C2 (en) * | 2013-07-26 | 2015-04-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Oligonucleotide primers burk1526s/burk1526as for assessment of adaptive variability of genome of pathogenic burkholderia |
| RU2545702C2 (en) * | 2013-07-26 | 2015-04-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Oligonucleotide primers burk0090s/burk0090as for assessment of adaptive variability of genome of pathogenic burkholderia |
| RU2551227C1 (en) * | 2014-03-04 | 2015-05-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | SET OF FLUORESCENTLY LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBES FOR TYPING STRAINS OF Burkholderia mallei BY METHOD OF AMPLIFICATION OF DIFFERENTIATING DNA FRAGMENTS |
| RU2556810C1 (en) * | 2014-04-22 | 2015-07-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR IDENTIFICATION OF Burkholderia pseudomallei |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112522429B (en) | Method and reagent set for detecting bacillus anthracis by RPA (reverse transcriptase polymerase chain reaction) combined CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) technology | |
| Smythe et al. | A quantitative PCR (TaqMan) assay for pathogenic Leptospira spp | |
| JP5763919B2 (en) | Methods for analyzing microbial populations | |
| Kumar et al. | Rapid multiplex PCR assay for the simultaneous detection of the Brucella Genus, B. abortus, B. melitensis, and B. suis | |
| Mirnejad et al. | Simultaneous detection and differentiates of Brucella abortus and Brucella melitensis by combinatorial PCR | |
| Bölske et al. | Diagnosis of paratuberculosis by PCR. | |
| RU2435860C1 (en) | FLUORESCENT-MARKED OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS AGENTS Bpseudomallei AND Bmallei | |
| AU2006209416A1 (en) | Method of quantitatively analysing microorganism targeting rRNA | |
| RU2625006C1 (en) | Method for target amplification of human reproductive organs infectors genomes for simultaneous identification of infectors with primer set | |
| Fearnley et al. | The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue | |
| Grudlewska-Buda et al. | Comparison of the intensity of biofilm formation by Listeria monocytogenes using classical culture-based method and digital droplet PCR | |
| Djadid et al. | A simple and rapid nested polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism technique for differentiation of pathogenic and nonpathogenic Leptospira spp. | |
| CN106282375A (en) | The LAMP primer group of a kind of Salmonella typhimurium and test kit and using method | |
| Yousef | Detection of bacterial pathogens in different matrices: Current practices and challenges | |
| Wu et al. | Development of a real-time PCR for the detection of pathogenic Leptospira spp. in California sea lions | |
| CN102041297B (en) | Method for establishing multiple fluorescent real-time quantitative PCR detection system with TaqMan MGB probe | |
| RU2439159C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF CAUSATIVE AGENTS OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS B. pseudomallei AND B. mallei | |
| RU2435861C1 (en) | FLUORESCENT-MARKED OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS AGENTS Bpseudomallei AND Bmallei | |
| Thongphueak et al. | Development of the rapid test kit for the identification of Campylobacter spp. Based on Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) in combination with a Lateral Flow Dipstick (LFD) and Gold Nano-DNA Probe (AuNPs) | |
| RU2740643C1 (en) | Kit of reagents for detection and identification of dna of anthrax agent by real-time polymerase chain reaction om-screen-siberian ulcer-rv | |
| Rahman et al. | TaqMan real-time PCR for detection of pathogenic spp. in canine clinical samples | |
| Chen et al. | Development of a closed-tube isothermal multiple self-matching-initiated amplification assay for visual detection of Staphylococcus aureus in milk samples | |
| RU2556810C1 (en) | SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR IDENTIFICATION OF Burkholderia pseudomallei | |
| RU2738358C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and fluorescent-labelled probes and method for detecting dna of agents of glanders and melioidosis by pcr method with product detection in real time | |
| RU2532845C1 (en) | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120629 |