RU2469093C2 - ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2469093C2 RU2469093C2 RU2008150348/10A RU2008150348A RU2469093C2 RU 2469093 C2 RU2469093 C2 RU 2469093C2 RU 2008150348/10 A RU2008150348/10 A RU 2008150348/10A RU 2008150348 A RU2008150348 A RU 2008150348A RU 2469093 C2 RU2469093 C2 RU 2469093C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proc
- protein
- human protein
- pcid
- plasmid dna
- Prior art date
Links
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 title claims abstract description 19
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 4
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims abstract description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 abstract description 44
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 abstract description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 20
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 abstract description 7
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 abstract description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000001994 activation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 2
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 abstract 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 17
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 16
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 15
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 13
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 101150108812 proC gene Proteins 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010042546 GCGGCCGC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 201000005660 Protein C Deficiency Diseases 0.000 description 3
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 3
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 3
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 3
- 241000425571 Trepanes Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 3
- 208000013746 hereditary thrombophilia due to congenital protein C deficiency Diseases 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 3
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 3
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 3
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101100245125 Homo sapiens PROC gene Proteins 0.000 description 2
- 101001125402 Homo sapiens Vitamin K-dependent protein C Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 101710140994 Secreted protein C Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 102100029477 Vitamin K-dependent protein C Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709704 Human poliovirus 2 Species 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000907337 Modoc virus Species 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- DASQOOZCTWOQPA-GXKRWWSZSA-L methotrexate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C([O-])=O)C=C1 DASQOOZCTWOQPA-GXKRWWSZSA-L 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000020964 regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к плазмидной ДНК pCID-PROC для экспрессии рекомбинантного протеина С человека, линии клеток яичника китайского хомячка DG-CID-PROC-1 и способу получения рекомбинантного протеина С человека. Предложенное изобретение может быть использовано для получения рекомбинантного протеина С человека. Плазмидная ДНК pCID-PROC для экспрессии рекомбинантного протеина С человека содержит последовательность полноразмерной кДНК гена протеина С человека, представленную в Перечне последовательностей как последовательность SEQ ID NO:1. Плазмидную ДНК pCID-PROC характеризуют физической картой, приведенной на Фиг.1. Линию клеток яичника китайского хомячка DG-CID-PROC-1 получают путем трансформации линии клеток яичника китайского хомячка DG-44 указанной экспрессионной плазмидной ДНК pCID-PROC. Способ получения рекомбинантного протеина С человека включает культивирование в питательной среде указанной линии клеток DG-CID-PROC-1 и выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости. Предложенное изобретение позволяет увеличить продуктивность системы экспрессии протеина С и упростить выделение, активацию и очистку рекомбинантного активированного протеина С человека. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения активированного и интактного (зимогенного) протеина С человека.
Протеин С является витамин К-зависимым белком плазмы крови. Он входит в систему гемостаза и играет исключительно важную роль при регулировании свертывания крови. Протеин С синтезируется в виде неактивной молекулы предшественника, проходит многостадийный посттрансляционный процессинг в клеточных компартментах и секретируется в виде интактной (зимогенной) формы. Активация белка С происходит в кровотоке при участии тромбомодулин-тромбинового комплекса. Активированный протеин С вместе с кофактором - протеином S выполняет антикоагулянтную функцию. Активированный белок С может предотвращать внутрисосудистый тромбоз и подавлять рост имеющихся тромбов. Механизм действия активированного протеина С и механизм активации зимогена в активную протеазу подробно изложен в работе (Gardiner I.E., Griffin I.H., Progress in Hematology, vol XIII. pp.265-278, ed Elmer B.Brown. Grime and Strattom Inc., 1983,).
Активация протеина С непосредственно осуществляется тромбином, последней сериновой протеиназой каскада свертывания крови, и опосредована связанным с мембраной эндотелиальных клеток гликопротеином тромбомодулин. Тромбомодулин образует прочный нековалентный комплекс состава 1:1 с тромбином и полностью меняет функциональные свойства тромбина. Свободный тромбин в нормальных условиях активирует тромбоциты, конвертирует фибриноген до фибрина и факторы свертывания крови V и VIII до активных формы Va и VIIIa. В то же время тромбин в комплексе с тромбомодулином теряет все вышеуказанные свойства, но эффективно активирует интактный протеин С при физиологических концентрациях ионов кальция.
Активированный протеин С, в свою очередь, избирательно инактивирует активированные формы факторов свертываемости крови V и VIII, но не их исходные формы. Следует отметить, что основные события при запуске каскада свертывания крови происходят на поверхности клеток и требуют участия мембранно-связанных белков и фосфолипидов, в то время как факторы V и VIII свободно циркулируют в кровотоке и участвуют в петле положительной обратной связи при работе системы свертывания. При их активации тромбином они ускоряют активацию фактора Х и протромбина на 5 порядков и резко ускоряют генерацию тромбина в месте запуска каскада свертывания.
Таким образом, физиологическая роль активированного протеина С может быть описана как ограничение области запуска системы свертывания крови.
Основным кофактором активированного протеина С является протеин S, другой витамин К-зависимый белок плазмы крови. Протеин S более чем в 10 раз усиливает вызываемую активированным протеином С деградацию факторов Va и VIIIa.
Протеин С является важным терапевтическим агентом (ЕР 215549, ЕР 0191606) в качестве специфического антикоагулянта, имеющего потенциально более широкую область применения, чем традиционные антикоагулянты гепарин, варфарин (оксикумарин) или производные последнего. В отличие от традиционных антикоагулянтов, активированный или интактный протеин С не воздействует на систему свертывания крови до момента появления тромбина и не вызывает падения концентрации зимогенных белков системы свертывания. Вследствие этого, антикоагулянтая терапия протеином С потенциально является более безопасной, поскольку не вызывает постоянного риска возникновения кровотечений. Экзогенный интактный протеин С также может использоваться для заместительной терапии при наследственном дефиците протеина С, вызывающего смерть в младенческом возрасте при гомозиготном дефиците и частые тромбоэмболические состояния при гетерозиготной форме дефицита.
Основной областью клинического применения активированного протеина С являются опасные для жизни тромботические состояния, в первую очередь синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), возникающий, в том числе при развитии острого сепсиса.
Активированный протеин С является маркером сепсиса, а его уровень и дефицит коррелируют с тяжестью течения заболевания. Так, дефицит протеина С наблюдается более чем у 85% больных с тяжелым сепсисом; а также дефицит протеина С коррелирует с неблагоприятными клиническими исходами, такими как септический шок (тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием артериальной гипотонии), ДВС-синдромом и полиорганной недостаточностью.
Поскольку концентрация протеина С в плазме крови очень мала и его отделение от других витамин К-зависимых белков системы гемостаза представляется весьма затруднительным, единственным способом получения активированного протеина С для медицинского применения является биосинтез, активация и очистка рекомбинатного белка. Наличие у протеина С так называемого Gla-домена, то есть кластера близкорасположенных остатков гамма-карбоксилированной глютаминовой кислоты, необходимо для нормального функционирования белка. Пост-трансляционное превращение остатков глютамина в остатки гамма-карбоксилированной глютаминовой кислоты возможно только в клетках млекопитающих и опосредовано сложной ферментной системой, использующей в качестве кофактора витамин К. Таким образом, единственным надежным источником рекомбинатного протеина С могут быть только культивируемые клетки млекопитающих.
Генетический вектор, содержащий полную кДНК протеина С человека, был получен путем скрининга фаговой библиотеки кДНК и описан в патентах США US4968626 и US 5302529.
Базовый способ экспрессии минигена протеина С в клетках млекопитающих описан в патенте США US 4959318. Он состоит в конструировании плазмиды, содержащей промотор вируса SV40, целевой ген и ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), котрансфекции данной плазмиды и вспомогательной плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотику неомицин, в клетки млекопитающих линий COS, BHK, A293, получению колоний стабильно трансфецированных клеток и их росту на селекционной среде, содержащей метотрексат. При использовании данного способа уровень секреции протеина С в культуральную среду оставался весьма низким и составлял около 0,05 мг/л. Кроме того, степень превращения интактного протеина С в нестабильную активированную форму была довольно значительной и при использовании линии клеток 293 достигала 90%.
Для увеличения уровня секреции протеина С были применены различные способы. В патенте США US 5618714 приведены данные об увеличении уровня секреции протеина С на 56-215% при увеличении температуры культивации клеток с 37°C до 39°C. Данный способ имеет ограниченную практическую пригодность, поскольку увеличение температуры культивации может приводить к падению жизнеспособности клеточной культуры и загрязнению секретированного протеина С продуктами распада клеток.
Другим способом увеличения продуктивности является использование систем экспрессии, основанных на введении в геном культивируемых клеток множественных копий гена протеина С. Такой подход был описан в патенте США US 5516650: при ко-трансфекции клеток линии BHK плазмидами pSV2-DHFR и pDX/PC962, содержащими ген DHFR и искусственный ген протеина С, соответственно, и последующем культивировании в присутствии метотрексата были получены клоны клеток-продуцентов, секретирующие протиеин С в культуральную среду с уровнем от 0,55 до 2,5 мг/л.
Наиболее близким по технической сущности аналогом настоящего изобретения является плазмида pL141, трансфецированная в клетки линии СНО-K1 (dhfr-), описанная в патенте США US 4775624. Использование данной системы позволяет достичь уровня секреции целевого белка в 1,8 мг/л культуры, но требует использования эмбриональной сыворотки в составе культуральной среды, что приводит к очень высокому загрязнению целевого белка посторонними полипептидами, в первую очередь бычьим сывороточным альбумином. Кроме того, уровень секреции протеина С оставался достаточно низким, что может быть связано с отсутствием полной сцепленности признаков устойчивости к метотрексату и секреции протеина С, вызванной использованием вектора с отдельными промоторами для целевого гена и гена DHFR.
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии получения активированного и интактного протеина C с более высоким выходом.
Технический результат достигался путем создания новой экспрессионной плазмидной ДНК pCID-PROC, кодирующей интактный протеин С человека и создание на ее основе линии-продуцента.
В основе данной технологии лежит разработанная авторами плазмидная ДНК pCID-PROC длиной 6174 п.о., содержащая последовательность, кодирующую белок С человека. Она состоит из фрагмента ДНК длиной 1792 п.о., содержащего последовательность полноразмерной кДНК гена белка С человека, и фрагмента 4382 п.о. плазмиды pCID, содержащего
- регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию протеина C: конститутивный промотор вируса CMV, последовательность Козак (сайт связывания рибосом) и сигнал полиаденилирования вируса простого герпеса (HSV);
- последовательность фактора устойчивости трансфецированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR) и регуляторные элементы для экспрессии DHFR - последовательность IRES вируса энцефаломиокардита. (EMCV), обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках и сигнал полиаденилирования;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллин и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli.
Плазмида pCID-PROC содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции - PvuI (5640) SpeI (54) Hind III (2772).
Имеет молекулярную массу 3,82 мДа.
Плазмида была введена в клетки DG-44 методом липосомальной трансфекции (Straus S.E. et al. J Virol. 1981 Jul:390):290-4), был получен пул стабильно трансфицированных клеток при помощи культивирования в среде, не содержащей гипоксантина и тимидина. Амплификация кассеты в геноме клеток была проведена путем последовательных культивирований в присутствии возрастающих концентраций метотрексата. Был получен пул клеток, устойчивых к высокой концентрации метотрексата, и использован для клонирования методом предельного разведения. Полученные клоны клеток-продуцентов были проанализированы методом иммуноферментного анализа и были отобраны клоны, дающие максимальный уровень экспрессии протеина C. Среди них был выбран клон DG-CID-PROC-1, при культивировании которого в суспензионной форме в бессывороточной среде уровень секреции протеина С составлял не менее 4 мг/л.
Особенности созданной конструкции, линии клеток и результаты практического применения изобретения приведены на следующих фигурах.
Фиг.1. Схематическая карта pCID-PROC, где используются следующие обозначения:
Pvul (5640) Spel (54) Hind 111 (2773) - уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции;
Ampicillin (bla) resistance gene - ген устойчивости к ампициллину;
bla promoter - бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину;
CMYPromoter - эукариотический промотор цитомегаловируса;
Kozak - сайт связывания рибосом - последовательность Козак;
Start ATOprotein С - первый кодон рамки считывания белка С;
PROC - область, кодирующая открытую рамку считывания белка С;
polyA - область, соответствующая поли-А тракту кДНК PROC;
ЕСМУ IRES - сайт связывания рибосом - последовательность IRES энцефаломиокардита, обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках;
DHFR - последовательность фактора устойчивости трансфецированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR);
ТК polyA signal - сигнал полиаденилирования.
Фиг.2. Первичная нуклеотидная последовательность фрагмента NotI-NotI плазмиды pCID-PROC, содержащего кДНК человека (длина 1792 п.о.)
Фиг.3. Аминокислотная последовательность полипептида, транслирующегося с плазмиды pCID-PROC (длина 461 аминокислота; молекулярный вес 52078.06 Да).
Клеточная линия DG-CID-PROC-1 была депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур в Институте цитологии РАН 16.03.2010 г. под номером РККК (П) 732Д.
При этом зафиксированы следующие характеристики.
1. Наименование организации, где была получена линия культивируемых клеток животных: Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный центр «Новые технологии и материалы»"
2. Автор или авторский коллектив, дата получения штамма: Ковнир СВ., Орлова Н.А., Воробьев И.И.; 25.06.2009
3. Адрес депозитора:
Юридический: 115093, г.Москва, ул. Большая Серпуховская 44, офис 33.
Почтовый: Гематологический Научный Центр РАМН, Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, д.4а.
4. Регистрационный номер; авторское наименование штамма:
PKKK(H)732D; DG-CID-PROC-1.
5. Причины депонирования: продуцент рекомбинантного белка; штамм, перспективный для биотехнологии.
6. Происхождение штамма:
Родительские клетки: китайский хомячок, яичник, линия СНО DG44 (Invitrogen cGMP banked, США; Mol Cell Biol 5, 1750-1759 Kaufman RJ et al. 1985).
Трансфекция, клонирование: стабильная трансфекция выполнена в Лаборатории Медицинской Биотехнологии ГУ ГНЦ РАМН,
Трансфекционный агент: Unfectine-56sp.
Трансфецированная плазмида: pCID-PROC.
Система селекции: dhff knockout/метотрексат
Кратность клонирования: 2
7. Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования:
36 пассажей от трансфекции родительской клеточной линии СНО DG44
8. Стандартные условия выращивания (состав питательной среды, температура и т.д.):
Среда: бессывороточная, определенного химического состава, CD Opti СНО (Invitrogen, США).
Температура: +37°С.
Концентрация СО2: 8%.
Скорость перемешивания: 120-130 об/мин.
9. Культуральные свойства (способ культивирования, посевная доза, кратность рассева, время субкультивирования и другие ростовые характеристики и особенности штамма):
Способ культивирования: суспензионный, в колбах Эрленмейра на орбитальной качалке 130-135 об/мин.
Посевная доза: 300000 на 1 мл.
Кратность рассева: 1:2-1:6
Другие ростовые характеристики и особенности штамма:
Селективная среда - бессывороточная, определенного химического состава, CD Opti CHO (Invitrogen, США) с добавлением L-глутамина 8 мМ + метотрексат натрия 500 нМ.
Процедура пересева: - центрифугирование суспензии на скорости 1200 об/мин, 5 мин, ресуспендирование в новой ростовой среде.
Оптимальная плотность: 1,0-1,2×106 клеток/мл.
10. Характеристика культивирования в организме животного:
не предусмотрена при использовании клеточной линии в качестве продуцента.
11. Данные по видовой принадлежности:
китайский хомячок Cricetulus griseus, яичник.
Контроль видовой идентичности: кариологический, изоферментный (ЛДГ и Г6ФДГ).
12. Маркерные признаки и методы их оценки: иммунологические, цитогенетические, биохимические, физиологические:
Морфология: эпителиоподобная.
Кариология: 2п=22, пределы изменчивости по числу хромосом 10-28, модальное число хромосом 22, псевдодиплоид, имеются микрохромосомы, количество полиплоидов 9,0%.
Биохимия: Дигидрофолатредуктазная активность по резистентности к метотрексату.
13. Контроль контаминации бактериями, микоплазмами, грибами и вирусами: бактерии, грибы методом прямого посева на питательные среды LB и Сабуро-Эммонса не обнаружены; микоплазма по ПЦР и флуоресцентному анализу не обнаружена; вирусы - нет данных.
14. Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом (для иммуноглобулинов указание класса, специфичности и методов ее оценки):
рекомбинантный белок - активированный протеин С человека,
определение методами ИФА, вестерн-блоттинг с хемилюминесцентной детекцией.
15. Характеристика биосинтеза полезных продуктов, выход продукта в среду, уровень активности и метод определения с указанием сохранения полезного свойства при длительном культивировании:
Содержание активированного протеина С в культуральной среде (при суточном культивировании клеточной суспензии плотностью 1 млн кл./мл) не менее 4 мг/л, уровень постоянен в течение 12 последовательных пассажей.
16. Способ криоконсервирования (среда, криопротектор, режим замораживания и отгрева, условия длительного хранения, жизнеспособность после криоконсервирования с указанием методов ее оценки)
Среда: бессывороточная, определенного химического состава, CD
Opti CHO (Invitrogen, США).
Криопротектор: 10% ДМСО.
Режим замораживания и отгрева: замораживание клеточной суспензии в среде с добавлением криоконсерванта, скорость падения температуры не более 1°С/мин (теплоноситель - изопентанол); разморозка быстрая, на водяной бане при 37°С.
Условия длительного хранения: 10 клеток/мл в ампуле в жидком азоте. Жизнеспособность после криоконсервирования: 81% (окраска трепановым синим).
17. Другие особенности штамма (онкогенность, присутствие вирусов и т.д.)
Онкогенность: -
Чувствительность: везикулярный стоматит (Индиана), арбовирус Гета.
Устойчивость: полиовирус 2 типа, флавивирус Модок MODV, арбовирус Батон Виллоу.
Амплифицирванный ген: dhfr.
Копия справки о депонировании прилагается.
Практическая применимость заявляемого изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение генетической конструкции pCID-PROC, кодирующей протеин С человека, для трансфекции линии клеток DG-44
В качестве источника кДНК для клонирования минигена протеина С использовали клон pCMY6-XL41NM_000312 (проприетарная коллекция компании Origene), содержащий полностью секвенированную последовательность полноразмерной кДНК гена PROC, совпадающую с теоретически определенной кДНК гена PROC человека по данным HUGO (депонирована в публичной базе данных GeneBank (http://www.ncbl.nlin.nih.gov/sites/entrez NM_000312).
Фрагмент ДНК длиной 1792 п.о., содержащий ген протеина С, получали из очищенной плазмиды pCMY6-XL41NM_000312, рестриктированной препаративно эндонуклеазой рестрикции NotI. Продукты рестрикции смешивали с 1 мкл буферного раствора для нанесения и проводили разделение в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации, визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл и проводили выделение ДНК, используя набор реактивов "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) согласно протоколу фирмы-производителя.
Реципиентную плазмиду pCID получили на основе коммерчески доступной линеаризованной плазмидной ДНК pOptivec-TOPO при инкубации в деионизованной воде 30 минут с последующим лигированием ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва), проводившимся в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli штамма DH5ά, с генотипом F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°С на 60 секунд и инкубировали на льду 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOC (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 250 мМ КСl, 10 мМ MgCl2) и инкубировали при 37°С 60 мин. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-агар (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 18 г/л агара), содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и помещали в термостат на 18 часов при 37°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 37°С и проводили выделение плазмидной ДНК с использованием набора реактивов "Wizard Plus SV Minipreps" («Promega», США) по стандартному протоколу фирмы-производителя..
Очищенную плазмиду pCID рестрицировали эндонуклеазой NotI, после чего проводили дефосфорилирование вектора щелочной фосфатазой (Fermentas, Литва) согласно рекомендациям производителя. Шелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°С в течение 20 минут. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду обрабатывали равным объемом смеси фенол-хлороформ 1:1 и переосаждали водную фазу 3 объемами этанола. Центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл.
Реакцию лигирования очищенного фрагмента, соответствующего кДНК гена PROC человека, и реципиентной плазмиды проводили с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва). Лигирование вели в объеме 10 или 20 мкл, при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli штамма DH5ά, как описано выше, переносили суспензию трансформированных клеток на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-агар, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и помещали в термостат на 18 часов при 37°С.
Колонии Е.coli анализировали на наличие вставки в правильной ориентации методом полимеразной цепной реакции (ПНР) клонов с использованием праймерных олигонуклеотидов CMVfor и PROC-AS к последовательности вектора (прямой) и вставки (обратный), поскольку сайт узнавания эндонуклеазы NotI является палиндромным. Первичные нуклеотидные последовательности праймеров CMVfor - 5'CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG3'; PROC-AS - 5'CCGTCGACGTGCTTGGACCA3'.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе Терцик МС2 («ДИК-технология», Россия) в объеме 12,5 мкл. Готовили инкубационную ПЦР-смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; 10 пМ каждого праймерного олигонуклеотида; 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 1-2 ед. термостабильной ДНК-полимеразы с 0.1-0.2 мкг ДНК.
Бактериальные колонии переносили петлей в пробирки и одновременно делали штрихи на свежей, размеченной чашке Петри с твердой питательной средой 2xYT-агар с добавлением селективного антибиотика, которую затем помещали в воздушный термостат на 5-7 часов при 37°С.
Поверх ПЦР-смеси наслаивали 50 мкл легкого минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация - 94°С, 3 мин; 25 циклов - денатурация 94°С, 30 сек, отжиг Х°С 30 сек, достройка 72°С, 45-60 сек; 1 цикл - достройка 72°С, 7 мин, где расчет температуры отжига (X) производили по формуле: Х=2°С×n (А/Т)+4°С×n (Г/Ц) - 5°С, где n - число соответствующих нуклеотидов. Продукты ПЦР смешивали с 1 мкл буфера для нанесения и проводили разделение в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл).
Отобранные клоны, содержащие вставку в корректной ориентации наращивали 18 часов в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл и проводили выделение плазмидной ДНК с использованием набора реактивов "Wizard Plus SV Minipreps" («Promega», США) по стандартному протоколу фирмы-производителя. Полученные плазмиды анализировали методом рестрикции эндонуклеазой NotI и отбирали клоны, несущие 1 копию вставки.
3 отобранных таким образом плазмидных клона дополнительно исследовали методом ПЦР-секвенирования ДНК в области вставки с использованием стандартных и специфических праймеров CMVfor, PROC-AS, 1RESrev; PROC_DS1; PROC_DS2; PROC_DS3; PROC_DS4; PROC_C01; PROC_C02; PROC_C03; PROC_C04; первичные нуклеотидные последовательности праймеров:
CMVfor - 5'СОСАААТОООСООТАООСОТО3';
PROC-AS - 5'ССОТСОАСОТОСТТООАССА3';
1RESrev - 5'CGAAGCCGCTTGGAATAAGG3'
PROC_DS1 - 5'CCCTACAGGTGCCAGTGCC3';
PROC_DS2 - 5'TGGGAGGGCCGCTTCTG3';
PROC_DS3 - 5'TGCATGGATGAGTCCAAGAAGC3';
PROC_DS4 - 5'ATCCTCGGGGACCGGC3';
PROC_C01 - 5'GGCCTCCTCGAAGTCACAGATC3';
PROC_C02 - 5'CCGCGGATCTACTTGGTCTTC3';
PROC_C03 - 5'CACGAGGGTCTCCTGGCC3';
PROC_C04 - 5'AAGCCCAGCCCTGCAGG3').
Для дальнейшей работы использовалась плазмида pCID-PROC, длиной 6174 п.о., не содержавшая мутаций, для которой были полные данные секвенирования. Методом ПЦР-секвенирования с использованием указанных выше праймерных олигонуклеотидов, для конструкции pCID-PROC определяли нуклеотидную последовательность обоих комплементарных цепей ДНК для области вставки кДНК гена PROC. Данные определения первичной нуклеотидной последовательности по двум цепям, полученные с прибора для автоматического капиллярного электрофореза, экспортировались в приложение ContigExpress программного пакета VectorNTI Suite (Invitrogen, США). С использованием стандартного алгоритма производился тримминг 5'-концевых и/или 3'-концевых областей фрагментов, после чего проводили сборку контига с использованием стандартных настроек. Проводили понуклеотидное сравнение полученной консенсусной последовательности с теоретически предсказанной. Помимо кодирующей области (ОРС) кДНК гена PROC, проводилось также секвенирование областей рестриктных сайтов NotI, по которым производилось клонирование фрагмента кДНК, а также наиболее значимых регуляторных элементов экспрессионного вектора (промотор, 1RES), анализ полученных данных проводился по аналогичному алгоритму. В результате секвенирования установили, что полученный препарат плазмиды не содержат мутаций в области вставки и кодирует кДНК гена PROC. Созданную генетическую конструкцию использовали для получения линии-продуцента.
Плазмидную ДНК pCID-PROC амплифицировали в клетках бактерий в препаративных количествах, выделили при помощи щелочного лизиса бактерий и трехстадийной хроматографической очистки (сорбенты Sepharose 4B Fast Flow, PlasmidSelect Xtra, Source 15 Q, Amersham) по методике производителя сорбентов, часть полученной высокоочищенной плазмидной ДНК, не содержащей пирогенов, дополнительно перевели в линейную форму рестрикцией PvuI и очистили от рестриктазы экстракцией фенолом-хлороформом и преципитацией этанолом. Полученные формы плазмиды для трансфекции клеток перевели в фосфатно-солевой раствор при помощи диализа и стерилизовали при помощи фильтра 0,22 мкм.
Пример 2. Конструирование эукариотических продуцентов протеина С DG-CID-PROC-1 трансфицированием клеток яичника хомячка линии DG-44 цитомегаловирусным вектором с использованием плазмиды pCID-PROC
Клетки яичника китайского хомячка линии DG-44, нокаутные по гену dhfr и адаптированные к культивированию в бессывороточной среде, были получены в компании Invitrogen, Ltd. (США). Описанная ниже методика трансформирования относится к клеткам DG-44, как линии клеток-хозяев, однако методика в целом применима и к большинству клеточных линий, включая другие линии клеток яичника китайского хомячка (СНО), человеческие эмбриональные почечные клетки линии 293, фибробласты почек сирийского хомячка ВНК, также пригодные для экспрессии конструкции pCID-PROC.
Клетки DG-44 полученные в криопробирках по 1 мл, содержащих замороженную суспензию клеток приблизительно 107 клеток в среде CD DG-44 (Gibco) с 10% диметилсульфоксида (DMSO). Содержимое сосуда размораживают при 37°С и добавляют к 30 мл полной среды DG-44. Полная среда состоит из ВП-44 (Cibco) с 8 mM L-глутамина и 1,8 мл/л сурфактанта Pluronic F-68 (BASF Inc.) и содержит достаточные для роста DHFR отрицательных клеток количества гипоксантина и тимидина. Клетки культивируют в колбах Эрленмеера на орбитальной качалке при 130 об/мин в атмосфере, содержащей 8% углекислого газа, при температуре 37°С. Подсчет плотности клеточной суспензии и доли живых клеток проводится в камере Горяева, при окрашивании трепановым синим. Субкультивируют с частотой 1 раз в 24-48 часов по достижении концентрации 1.2×106. Для этого удаляют старую среду центрифугированием в течение 5 минут на скорости 1200 об/мин, ресуспендируют клеточный осадок свежей средой и распределяют в новые колбы Эрленмеера с отношением субкультивирования 1:6.
За 48 часов до трансфекции клетки высевают по описанной методике в количестве 9×106 клеток на 1 колбу. В день трансфекции доля живых клеток должна составлять не менее 95%. Клетки в день трансфекции не центрифугируя разводят до конечной концентрации 1,5×107 клеток на 30 мл среды DG-44 в колбах Эрленмеера. Стерильную, осажденную этанолом плазмидную ДНК растворяют в PBS-буфере и используют для получения трансфекционной смеси, содержащей 18 мкг плазмидной ДНК, 15 мкл трансфекционного агента FreeStyle MAX (Invitrogen) в 1,2 мл вспомогательной среды Opti-Pro SFM MAX (Invitrogen). Плазмидная ДНК, используемая для трансфекции, представляет собой смешанные в соотношении 20:1 плазмиды pCID-PROC, линеаризованной эндонуклеазой рестирикции PvuI, и сверхспирализованной pEGFP. Трансфекционную смесь осторожно перемешивают и инкубируют 10-20 минут, а затем осторожно добавляют во вращающуюся колбу, содержащую клетки DG-44, в указанной выше концентрации. Экспрессируемый в трансфецированных клетках флуоресцентный белок используется для оценки эффективности трансфекции. Для этого через 12 часов после трансфекции в пробе клеток определяют долю флуоресцирующих при анализе с помощью пары оптических фильтров EGFP. Полученное соотношение характеризует интенсивность транзиентной экспрессии в трансфецированных клетках.
Данное изобретение включает вектор экспрессии, содержащий селективный маркер для эукариотических клеток, нокаутных по гену dhfr. Известно использование дигидрофолатредуктазного (dhfr) гена или производного dhfr-гена (dhfr-mix), придающего устойчивость к метотрексату (МТХ), в качестве селективного маркера для введения гена или плазмиды в клеточные линии, лишенные dhfr, и последующее применение метотрексата для размножения копий плазмид. Клетки DG-44 являются dhfr нокаутными (негативными), поэтому трансфектанты, содержащие плазмиду pCID-PROC с последовательностью гена dhfr, селектируются на основе dhfr-позитивного фенотипа, так как способны расти в среде, лишенной гипоксантина и тимидина. Клеточные линии, нокаутные по dhfr-гену и трансформированные dhfr-содержащими плазмидами, могут быть отобраны на основе dhfr-позитивного фенотипа.
Для отбора стабильных трансформантов с включением в хромосомную последовательность генетической конструкции pCID-PROC трансфецированные клетки DG-44 пересаживают в среду OptiCHO (Invitogen), не содержащую гипоксантин и тимидин, и культивируют по следующей методике. Проводят подсчет плотности клеточной суспензии и доли живых клеток в счетной камере Горяева при окрашивании трепановым синим. Затем удаляют старую среду центрифугированием в течение 5 мин на скорости 1200 об/мин, ресуспендируют клеточный осадок свежей средой CD OptiCHO (Invitogen), с добавлением L-глутамина в конечной концентрации 8 mM, и распределяют в новые колбы Эрленмеера по 9×106 клеток на колбу. Клетки культивируют в колбах Эрленмеера на орбитальной качалке при 130 об/мин в атмосфере, содержащей 8% углекислого газа при температуре 37°С. Субкультивируют с частотой 1 раз, в 3 дня в течение 10-14 дней до достижения доли живых клеток более 90%. В качестве контроля при отборе трансфектантов, положительных по dhfr, используют клетки, трансфецированные плазмидным вектором pOptiVec, экспрессирующие дигидрофолатредуктазу без сцепленности этого признака с другими. По достижении доли живых клеток 90% и более замораживается промежуточный клеточный банк с образцами, содержащими по 107 клеток в 1 мл среды CD OptiCHO с добавлением 10% DMSO.
Для амплификации целевого признака экспрессии активированного белка С проводится селекционное культивирование в присутствии нарастающих доз метотрексата. Для этого образцы из промежуточного банка размораживаются по описанному выше протоколу с теми изменениями, что в качестве культивационной среды используется CD OptiCHO (Invitrogen), с добавлением L-глутамина в конечной концентрации 8 mM. Затем в культивационную среду добавляется метотрексат в диапазоне концентраций от 250 нМ до 4 мкМс удвоением рабочей концентрации МТХ на каждом шаге амплификации. Переход к следующему шагу амплификации осуществляют каждые 14-21 день по достижении доли живых клеток более 90%. На каждом шаге амплификации уровень экспрессии протеина С в культуре клеток определяется иммуноферментным анализом. Клетки-продуценты последнего шага амплификации клонируются методом предельных разведений и адаптируются к культивированию на твердой подложке.
Описанные в данном примере методики применимы для создания линий клеток-продуцентов активированного белка С на основе любых эукариотических клеточных линий, имеющих генетический нокаут гена dhfr-, как прикрепленных, так и суспензионных, а также трансформированных как описанным методом, так и с использованием других липосомальных агентов, а также методами кальций-фосфатной трансфекции, нуклеофекции или микроинъекции.
Claims (3)
1. Плазмидная ДНК pCID-PROC для экспрессии рекомбинантного протеина С человека, содержащая последовательность полноразмерной кДНК гена протеина С человека, представленную в Перечне последовательностей как последовательность SEQ ID NO:1, при этом указанная плазмида характеризуется физической картой, приведенной на фиг.1.
2. Линия клеток яичника китайского хомячка DG-CID-PROC-1 - продуцент рекомбинантного протеина С человека, полученная путем трансформации линии клеток яичника китайского хомячка DG-44 экспрессионной плазмидной ДНК pCID-PROC по п.1.
3. Способ получения рекомбинантного протеина С человека, включающий следующие стадии:
- культивирование в питательной среде линии клеток по п.2 - продуцента рекомбинантного протеина С человека; и
- выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.
- культивирование в питательной среде линии клеток по п.2 - продуцента рекомбинантного протеина С человека; и
- выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008150348/10A RU2469093C2 (ru) | 2008-12-19 | 2008-12-19 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008150348/10A RU2469093C2 (ru) | 2008-12-19 | 2008-12-19 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008150348A RU2008150348A (ru) | 2010-06-27 |
| RU2469093C2 true RU2469093C2 (ru) | 2012-12-10 |
Family
ID=42683125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008150348/10A RU2469093C2 (ru) | 2008-12-19 | 2008-12-19 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2469093C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2552170C2 (ru) * | 2013-05-14 | 2015-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Экспрессионный плазмидный вектор моноцистронной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, линия клеток млекопитающих-продуцентов рекомбинантного белка, способ получения рекомбинантного белка |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
| US4959318A (en) * | 1985-06-27 | 1990-09-25 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
| RU1830081C (ru) * | 1987-12-04 | 1993-07-23 | Эли Лилли Энд Компани | Способ получени рекомбинантного активированного белка С человека |
| US5302529A (en) * | 1985-08-15 | 1994-04-12 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Plasmid coding for human protein C |
| US5516650A (en) * | 1985-06-27 | 1996-05-14 | Zymogenetics, Inc. | Production of activated protein C |
-
2008
- 2008-12-19 RU RU2008150348/10A patent/RU2469093C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
| US4959318A (en) * | 1985-06-27 | 1990-09-25 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
| US5516650A (en) * | 1985-06-27 | 1996-05-14 | Zymogenetics, Inc. | Production of activated protein C |
| US5302529A (en) * | 1985-08-15 | 1994-04-12 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Plasmid coding for human protein C |
| RU1830081C (ru) * | 1987-12-04 | 1993-07-23 | Эли Лилли Энд Компани | Способ получени рекомбинантного активированного белка С человека |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2552170C2 (ru) * | 2013-05-14 | 2015-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Экспрессионный плазмидный вектор моноцистронной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, линия клеток млекопитающих-продуцентов рекомбинантного белка, способ получения рекомбинантного белка |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008150348A (ru) | 2010-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6754414B2 (ja) | ヒト細胞系における組換えヒトタンパク質の無血清安定トランスフェクションおよび製造 | |
| JP2024096417A (ja) | 改変された幹細胞メモリーｔ細胞、その作製方法およびその使用方法 | |
| JP7075463B2 (ja) | 哺乳類細胞の培養方法 | |
| AU2008205445A1 (en) | Method for producing gamma-carboxlated proteins | |
| KR20130140221A (ko) | 감마 카르복실화를 필요로 하는 단백질 생산용 벡터를 포함하는 숙주 세포 | |
| RU2500816C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАК380, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 1E6 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ | |
| EP1405910A1 (en) | Process for producing human thrombin by gene modification technique | |
| RU2469093C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА | |
| JPH022376A (ja) | 酵素前駆体型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物 | |
| RU2561466C2 (ru) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора | |
| Guarna et al. | Effect of cDNA copy number on secretion rate of activated protein C | |
| JP4157644B2 (ja) | 高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法 | |
| RU2585532C2 (ru) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свёртываемости крови ix человека и способ получения указанного фактора | |
| RU2429294C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА | |
| EP2633058B1 (en) | Method for mass production of factor vii/viia | |
| BR102017004788B1 (pt) | Método de produção de cola de fibrina de origem recombinante | |
| TWI316958B (ru) | ||
| CN120737218B (zh) | 融合蛋白、调控系统及利用该系统构建转基因细胞的方法 | |
| RU2744592C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pET21-TF7, обеспечивающая синтез модифицированного тканевого фактора, и штамм Escherichia coli BL21(DE3) pET21-TF7 - продуцент рекомбинантного тканевого фактора человека | |
| JP2005073509A (ja) | ヒトアンチトロンビンの生産方法 | |
| RU2552170C2 (ru) | Экспрессионный плазмидный вектор моноцистронной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, линия клеток млекопитающих-продуцентов рекомбинантного белка, способ получения рекомбинантного белка | |
| Zou et al. | Expression and biological activity of recombinant human coagulation factor X in HEK293 cells | |
| RU2448160C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pAP271, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ФАКТОРА VII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, И ЛИНИЯ КЛЕТОК Mesocricetus auratus ВНК 21 k.13 (2H7) - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА | |
| CN118879784A (zh) | 一种gs双等位基因敲除的cho-k1单克隆细胞株的制备方法 | |
| RU2500818C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАР227, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 2H5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161220 |