RU2448694C2 - Cпособ противодействия образованию нейротоксичных белков addl (варианты), способ модуляции нейрональной дисфункции или нейротоксичности посредством непептидного соединения и композиция (варианты) на его основе - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к медицинской химии и касается использования непептидных соединений для ингибирования олигомеризации мономерных пептидов Аβ_1-42. Предложены способы противодействия образованию нейротоксичных белков ADDL из мономерных пептидов Аβ_1-42, а также способы подавления, регуляции и/или модуляции нейрональной дисфункции или нейротоксичности, вызванной белками ADDL, в нервных клетках или нервной ткани за счет подавления образования белков ADDL, включающие контактирование мономерного Aβ_1-42 с соединением, которое выбрано из группы, включающей: (Z)-N-(2-Метокси-фенил)-2-оксо-2-{N′-[3-оксо-3-тиофен-2-ил-1-трифторметил-пропилиден]-гидразино}-ацетамид, этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидрокси-3-метокси-фенил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты, этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксинафталин-1-ил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты, этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксифенил)-метилиден-гидразино-оксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты, 2-(5-гидрокси-3-изобутил-5-(трифторметил)-4,5-дигидро-1Н-пиразол-1-ил)-N-(2-метоксифенил)-2-оксоацетамид и (Е)-2-гидрокси-N′-((1-гидроксинафталин-2-ил)метилен)бензогидразид. Также предложены композиции, содержащие эффективное количество вышеперечисленных соединений. Группа изобретений обеспечивает соединения-кандидаты для разработки лекарственных средств для лечения нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с белками ADDL, в особенности болезни Альцгеймера. 8 н. и 17 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способам подавления, регуляции и/или модуляции образования растворимых, глобулярных, нефибриллярных, нейротоксичных олигомеров Аβ_1-42 (белков ADDL) из мономерных пептидов Аβ_1-42 с использованием непептидных соединений с молекулярной массой менее 1000. Данное изобретение также относится к способам лечения больных, страдающих от болезней, связанных с образованием растворимых, глобулярных, нефибриллярных, нейротоксичных олигомеров Аβ_1-42 путем введения им непептидных соединений.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) - это постепенно развивающееся слабоумие со смертельным исходом, неизлечимое на сегодняшний день. Хотя молекулярный механизм заболевания не установлен, большое число существующих данных свидетельствуют об участии в данном механизме нейротоксинов, происходящих из бета-амилоидных (Аβ) пептидов, и, в частности, бета-амилоидного пептида, состоящего из 42 аминокислотных остатков. Аβ - это амфипатический пептид, относительное содержание которого увеличивается за счет мутации генов и факторов риска, связанных с БА. Фибриллы, образованные из Аβ, составляют стержни амилоидных сенильных бляшек, которые являются признаком головного мозга с БА. Аналогичные фибриллы, образующиеся in vitro, являются смертельными для культивированных нейронов головного мозга. Эти сведения явились основными доводами для выдвижения первичной гипотезы "амилоидного каскада" - теории, в которой предполагалось, что потеря памяти происходит из-за смерти нейронов, вызванной фибриллярным Aβ (Hardy and Higgins (1992), Science 256:184-185).

Несмотря на хорошее экспериментальное подтверждение и интуитивные доводы было доказано, что первоначальная гипотеза амилоидного каскада несовместима с ключевыми наблюдениями, включая слабую корреляцию слабоумия с массой амилоидных сенильных бляшек (Katzman (1988) Ann. Neural. 23(2):138-144). За счет использования модели БА на основе трансгенной мыши, которую лечили моноклональными антителами, получено два удивительных наблюдения касательно Аβ: (1) у вакцинированных мышей наблюдался процесс, обратный ухудшению памяти, при этом явное восстановление нормы происходило за 24 часа; и (2) происходило улучшение познавательных способностей при вакцинации, несмотря на то, что уровень сенильных бляшек оставался без изменений (Dodart и соавт. (2002) Nat. Neurosci 5:452-457; Kotilinek и соавт. (2002) J. Neurosci. 22:6331-6335). Подобные наблюдения не совмещаются с механизмом, в котором ухудшение памяти объясняется смертью нейронов, вызванной амилоидными фибриллами.

Явные недочеты первоначальной гипотезы амилоидного каскада были устранены в усовершенствованной гипотезе амилоидного каскада, в которой ключевая роль была отведена дополнительным нейроактивным молекулам, образующимся в результате самосборки Аβ. Этими молекулами являются белки, происходящие из β-амилоидов (далее - ADDL), которые собираются из мономерных бета-амилоидных пептидов, состоящих из 42 аминокислотных остатков (далее - Aβ_1-42) при низких его концентрациях (Lambert и соавт. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6448-6453). Являясь по сути недостающим звеном в первоначальной теории амилоидного каскада, ADDL быстро подавляют длительное потенцирование (Lambert и соавт. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6448-6453; Walsh и соавт. (2002) Nature 416:535-539; Wang и соавт. (2002) Brain Res. 924:133-140), классическая экспериментальная парадигма в отношении памяти и синаптической пластичности. В усовершенствованной гипотезе Аβ каскада, потеря памяти объясняется возникновением расстройства синапса до смерти нейронов, при этом расстройство вызывается ADDL, а не фибриллами (Hardy and Selkoe (2002) Science 297:353-356). Белки ADDL возникают в мозговой ткани и поразительным образом накапливаются в мозговой ткани больного БА по сравнению с контролем такой же возрастной группы (Kayed и соавт. (2002) Science 300:486-489; Gong и соавт. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10417-10422), а также накапливаются у моделей трансгенных мышей с БА (Kotilinek и соавт. (2002) J.Neurosci. 22:6331-6335; Chang и соавт. (2003) J. Mol. Neurosci. 20:305-313).

Упрощенное механистическое объяснение данной теории можно представить следующим образом:

где образование ADDL представляет собой отдельное направление, отличное от образования амилоидных сенильных бляшек, каждое из этих направлений находится в равновесии с мономерным Аβ_1-42.

В дальнейших экспериментах были показаны важные неврологические свойства ADDL. Было показано, что ADDL обладают селективной токсичностью по отношению к гиппокампальным СА1 нейронам в сравнении с САЗ нейронами, и у них полностью отсутствует токсичность по отношению к нейронам мозжечка (Kim и соавт. (2003) FASEB J. 17:118-120). На основе брюшной инъекции олигомеров Аβ_1-42 диким крысам были получены быстрые модели аномального поведения, у которых полное восстановление происходит за 24 часа (Cleary и соавт. (2005) Nat. Neurosci. 8:79-84), и такие поражения приписывают олигомерам более высокого порядка, в частности олигомерам из 12 звеньев (Lesne и соавт. (2006) Nature 440:352-357). Связывание ADDL с нейронами протекает с высокой специфичностью и локализуется на постсинаптических рецепторах из подгруппы гиппокампальных нейронов (Lacor и соавт. (2004) J.Neurosci. 24:10191-10200). Это связывание инициирует быструю и устойчивую стимулирующую регуляцию линии предранних генных продуктов, трансляция которой зависит от активности полирибосом, локализованных на подгруппе дендритных шипиков (Steward и соавт. (1998) Neuron 21:741-751; Guzowski и соавт. (2000) J.Neurosci. 20:3993-4001). Совсем недавно ADDL стали рассматривать в качестве активаторов фосфорилирования тау-белков, и было показано, что они влияют на поведение животных на фемтомолярном уровне (Matsubara и соавт. (2004) Neurobiol. Aging 25:833-841).

Обратимость процесса потери памяти у моделей мышей в сочетании с неврологическими свойствами ADDL и их содержанием в мозге пациента с БА являются хорошим доводом в отношении гипотезы, согласно которой БА - это болезнь, связанная с расстройством синапса, индуцированным ADDL (Lambert и соавт. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6448-6453; Klein и соавт. (2001) Trends Neuroscis. 24:219-220; Selkoe (2002) Science 298:789-791).

Использование антител, специфичных к ADDL, является мощным способом изменения равновесия между мономерным Аβ_1-42 и ADDL, что позволяет излечивать болезненные расстройства, опосредованные ADDL. Однако доставка антител обычно ограничивается инъецируемыми растворами, которые создают проблемы, связанные с соблюдением больным режима и схемы лечения, а также с необходимостью присутствия лечащего врача. Особенно полезными в данном случае могли бы оказаться небольшие молекулы, которые изменяют данное равновесие и могут доставляться неинъекционными средствами, в частности путем приема внутрь, трансдермальной доставкой, через легкие, носовую область и т.д.

Ряд малых молекул, разработанных изначально в качестве ингибиторов амилоидных фибрилл, как предполагается, обладают свойствами ингибирования самосборки Аβ олигомеров (ADDL). К некоторым из таких соединений относятся Alzhemed™ (Gervais (2004) Neuirobiol. Aging 25:S11-12), клиохинол (Ritchie и соавт. (2003) Arch. Neural. 60:1685-1691), замещенные β-циклодекстрины (Yu и соавт. (2002) J. Mol. Neurosci. 19:51-55), трегалоза (Lui (2005) Neurobiol. Disease 20:74-81), простые амино-, карбонил- и нитрозамещенные фенолы (De Felice и соавт. (2001) FASEB J.March 20; De Felice и соавт. (2004) FASEB J. 18:1366-1372), куркумин (Yang и соавт. (2005) J. Biol. Chem. 280(7):5892-5901), аналоги циклогексангексола (McLaurin и соавт. (2006) Nature Med. 12:801-808), спиростероидные спирты (Lecanu и соавт. (2004) Steroids 69:1-16) и трициклические пироны (Maeqawa и соавт. (2006) J. Neurochem. 98:57-67). Из вышеперечисленных, два соединения, Alzhemed™ и клиохинол, прошли клинические испытания.

Alzhemed™ (3-амино-1-пропансульфоновая кислота), так называемый "миметический аналог ГАГ (глюкозоаминогликанов)", как предполагается, понижает уровень растворимых и нерастворимых амилоидов путем связывания с Аβ_1-42, хотя и нет очевидных экспериментальных подробностей, подтверждающих предполагаемый механизм действия. Alzhemed™ недавно прошел II стадию 20-месячного открытого расширенного испытания, и сообщается о медленном ухудшении познавательных способностей у некоторых пациентов с легкой БА, однако в течение скрытой стадии исследования препарат не показал эффективность (Gervais (2004) Neuirobiol. Aging 25:S11-12).

Было показано, что второе соединение, Клиохинол, на II стадии клинического испытания стабилизирует познавательную способность пациентов по сравнению с пациентами, не прошедшими лечение, и понижает уровень Aβ_1-42 в плазме крови (Ritchie и соавт. (2003) Arch. Neurol. 60:1685-1691). Однако токсичная примесь (дийодированная форма клиохинола), появляющаяся при производстве препарата, явилась причиной прекращения исследования и замены клиохинола аналогом под названием РВТ2 (Blennow и соавт. (2006) Lancet 368:387-403).

И наконец, сообщалось о том, что неидентифицированное соединение или соединения из экстракта листьев гинкго билоба понижает уровень триммеров и тетрамеров Aβ_1-42 и повышает уровень высокомолекулярных полимеров в зависимости от дозы (Yao и соавт. (2001) Brain Res. 889:181-190). Также сообщалось о дозозависимой защите PC-12 клеток от токсичности, вызываемой ADDL.

По-видимому, только несколько соединений из тех, что, как сообщалось, ингибируют самосборку ADDL и связывание с Аβ_1-42 мономером, обладают высоким лечебным потенциалом. Принимая во внимание очень простую структуру и гидрофильные свойства Alzhemed™, весьма маловероятно, чтобы он обладал высоким и селективным сродством к Аβ_1-42 мономеру. Любое воздействие, оказываемое Alzhemed™ на агрегацию или дезагрегацию бета-амилоида (далее - АГ), вероятно связано с его взаимодействием с ионными остатками вблизи N-конца Aβ_1-42. Циклодекстрины не обладают ни свойствами прототипа, ни свойствами лекарства, так чтобы их можно было рекомендовать для разработки (Oprea и соавт. (2001) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1308-1315; Vieth и соавт. (2004) J. Med. Chem. 47:224-232), а фенолы De Felice содержат альдегидные и нитрофункциональные группы, которые часто рассматриваются химически активными и исключаются из скрининг-библиотек (Walters and Namchuk (2003) Nat. Rev. 2:259-266). О ряде молекул, содержащих фенольные функциональные группы, сообщалось как о "часто встречающихся препаратах" в скрининг-библиотеках (Roche и соавт. (2002) J. Med. Chem. 45:137-142). Таким образом, необходима дальнейшая оценка активности и селективности фенолов De Felice с целью подтверждения возможности их эффективного использования. Сообщалось, что некоторые соединения со стероидным скелетом могут выступать разнородными ингибиторами при протекании неожиданного процесса аутоагрегации (McGovern и соавт. (2002) J. Med. Chem. 45:1712-1722), чем можно объяснить неоднозначные результаты при использовании спиростероидных спиртов. Наконец, до сих пор неизвестно, что является активным ингредиентом в экстракте листьев гинкго билоба. Таким образом, большинство из предполагаемых ингибиторов сборки Аβ нельзя рассматривать в качестве соединений, подходящих для разработки в качестве лекарственных средств.

Несмотря на указанные выше мнимые результаты, анализ связывания указывает на то, что эти соединения являются в лучшем случае умеренными антагонистами образования ADDL.

Соответственно разработка малых молекул, которые бы обеспечивали улучшенное подавление, регуляцию и/или модуляцию образования ADDL, является полезной.

Раскрытие изобретения

Это изобретение связано с открытием того факта, что можно оказать противодействие образованию растворимого, глобулярного, нефибриллярного, нейротоксичного олигомера Аβ_1-42 (ADDL) путем использования практически чистых непептидных соединений с молекулярной массой менее 1500, предпочтительно менее 1000, которые противодействуют образованию ADDL на более высоком уровне по сравнению с тем, чего можно было достичь ранее. Кроме того, данное изобретение обращено к открытию факта, который установлен при исследовании большого количества структурных каркасов, проявляющих повышенный антагонизм, о том, что антагонизм не зависит от структурного каркаса.

Соответственно, в одном из аспектов указанного способа, данное изобретение обращено к способу противодействия образованию ADDL из мономерного Аβ_1-42 посредством взаимодействия мономерного Аβ_1-42 с практически чистым непептидным соединением, при этом указанное соединение характеризуется тем, что:

(a) имеет молекулярную массу менее 1000;

(b) является антагонистом образования нейротоксичных ADDL из Аβ_1-42; и

(c) его значение IC₅₀ составляет по большей мере около 5 мкМ, что установлено в анализе Примера 1, в котором определяется образование нейротоксичных ADDL.

В еще одном варианте осуществления изобретения касается способа подавления, регуляции и/или модуляции нарушения нервной деятельности или нейротоксичности, вызванной ADDL, в нервных клетках за счет подавления образования ADDL. Способ включает в себя взаимодействие Аβ_1-42, которые могут иметься при наличии нервных клеток, с эффективным количеством практически чистого непептидного соединения, при этом указанное соединение характеризуется тем, что:

(а) имеет молекулярную массу менее 1000;

(b) является антагонистом образования нейротоксичных ADDL из Аβ_1-42 мономеров; и

(с) его значение IC₅₀ составляет около 5 мкМ или менее, что установлено в анализе Примера 1, в котором определяется образование нейротоксичных ADDL.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу подавления олигомеризации или дальнейшей олигомеризации мономерного Аβ_1-42 в нейротоксичные ADDL, данный способ включает в себя взаимодействие мономерного Аβ_1-42 с эффективным количеством практически чистого непептидного соединения, при этом указанное соединение характеризуется тем, что:

(а) имеет молекулярную массу менее 1000;

(b) является антагонистом образования нейротоксичных ADDL из Аβ_1-42 мономеров; и

(с) его значение IC₅₀ составляет около 5 мкМ или менее, что установлено в анализе Примера 1, в котором определяется образование нейротоксичных ADDL.

В другом варианте осуществления изобретение касается способа подавления, регуляции и/или модуляции образования ADDL или активности такого лиганда в организме больного, страдающего от заболевания или имеющего риск развития заболевания, связанного с образованием Аβ_1-42 олигомеров (ADDL). Способ включает в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества практически чистого непептидного соединения, при этом указанное соединение характеризуется тем, что:

(а) имеет молекулярную массу менее 1000;

(b) является антагонистом образования нейротоксичных ADDL из Аβ_1-42 мономеров; и

(с) его значение IC₅₀ составляет по большей мере около 5 мкМ, что установлено в анализе Примера 1, в котором определяется образование нейротоксичных ADDL.

В еще одном варианте осуществления изобретение обращено к способу лечения больного, страдающего от заболевания или имеющего риск развития заболевания, связанного с ADDL, которое выбрано из группы, состоящей из болезни Альгеймера, синдрома Дауна, инсульта, умеренных когнитивных нарушений, очаговой ишемии, связанной со слабоумием, и нейрональной дистрофии. Способ включает в себя введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества практически чистого непептидного соединения, при этом указанное соединение характеризуется тем, что:

(а) имеет молекулярную массу менее 1000;

(b) является антагонистом образования нейротоксичных ADDL из Аβ_1-42 мономеров; и

(с) его значение IC₅₀ составляет по большей мере около 5 мкМ, что установлено в анализе Примера 1, в котором определяется образование нейротоксичных ADDL.

В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулярная масса соединений составляет менее 1500. В других вариантах осуществления соединения характеризуются тем, что подавляют образование нейтротоксичных ADDL, что определено в анализе Примера 1 по значению IC₅₀, которое составляет по большей мере около 2 мкм, и, более предпочтительно, по большей мере 1 мкМ.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, используемой при лечении больного, страдающего от заболевания или имеющего риск развития заболевания, которое выбрано из группы, состоящей из болезни Альгеймера, синдрома Дауна, инсульта, умеренных когнитивных нарушений, очаговой ишемии, связанной со слабоумием, нейрональной дистрофии, при этом композиция содержит терапевтически эффективное количество практически чистого непептидного соединения, которое характеризуется тем, что:

(а) имеет молекулярную массу менее 1000;

(b) является антагонистом образования нейротоксичных ADDL из Аβ_1-42 мономеров; и

(с) его значение IC₅₀ составляет по большей мере около 5 мкМ, что установлено в анализе Примера 1, в котором определяется образование нейротоксичных ADDL.

Помимо этого настоящее изобретение относится к способу производства лекарственного средства, содержащего соединение, упомянутое в вариантах осуществления данного раздела.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 отображено примерное дозозависимое подавление сборки посредством соединений, описанных в данном документе, которое определено анализом РПЭФ (резонансного переноса энергии флуоресценции). Показаны результаты анализа тестируемого соединения А, взятого в концентрации от 0,05 до 3 мкм, а также результаты для тестируемого соединения В, взятого в концентрации 30 мкМ. Также показаны положительный и отрицательный контроли.

На оси Х указано время в минутах, а на оси Y указаны относительные единицы флуоресценции (ОЕФ)×10³, определенные методом анализа РПЭФ в Примере 1.

На фиг.2 отображено примерное дозозависимое подавление сборки предполагаемым ингибитором амилоидных фибрилл Alzhemed™ (Neurochem), протестированным методом анализа РПЭФ, описанным в этом документе. Также показаны положительный и отрицательный контроли. На оси Х указано время в минутах, а на оси Y указаны относительные единицы флуоресценции (ОЕФ)×10³, определенные методом анализа РПЭФ.

Осуществление изобретения

А. Способы изобретения

Перед описанием способов надо учесть то, что изобретение не ограничивается отдельными описываемыми методиками, протоколами, клеточными линиями, методами анализа и реагентами, поскольку они могут изменяться. Также надо понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена для описания отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения и никоим образом не ограничивает объем настоящего изобретения, изложенного в прилагаемой формуле.

Следует отметить, что используемые в данном описании и формуле изобретения объекты единственного числа также относятся к объектам множественного числа, если в контексте явным образом не указано что-либо иное.

Если не указано что-либо иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значения, как правило, понятные специалисту в области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя при осуществлении или испытании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, схожие или эквивалентные тем, что описываются в данном документе, далее будут описаны предпочтительные способы, устройства и материалы. Все цитированные здесь издания включаются в данный документ по ссылке в их общем виде. Отсутствие чего-либо в данном документе не дает право противопоставлять раскрытие данного изобретения с более ранним изобретением.

Используемые в этом документе определения ограничиваются применением малых молекул в той мере, насколько они касаются агрегации или олигомеризации ADDL и связанных с этим заболеваний.

Это изобретение обращено к открытию того факта, что можно оказать противодействие образованию растворимых, олигомерных, глобулярных, нефибриллярных, нейротоксичных Аβ_1-42 пептидов (ADDL) путем использования практически чистых непептидных соединений с молекулярной массой менее 1500, предпочтительно менее 1000. Соединения противодействуют образованию ADDL на более высоком уровне по сравнению с тем, чего можно было достичь ранее.

Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений, описанных в этом документе, окажет воздействие на ключевые сборочные элементы в Аβ_1-42 мономерах или на важные элементы в Аβ_1-42 олигомерах (ADDL). Это воздействие, в свою очередь, предотвратит образование нейротоксичных ADDL или подавит активность подобных белков. Разрушение ADDL или подавление активности подобных белков обеспечивает длительное потенцирование нервных клеток, устраняя и/или уменьшая тем самым нейротоксичность, связанную с ADDL. Кроме того, это воздействие не будет препятствовать образованию сенильных бляшек Аβ.

Термин "непептидное соединение" относится к соединениям, примеры которых описаны в данном документе и не включают пептиды и/или белки. Считается, что наличие 1-10, 1-5 или 1-2 аминокислотных остатков, связанных со структурным каркасом соединений, раскрытых в данном документе, не делает такие каркасы пептидными, при условии что молекулярная масса соединения составляет менее 1500, предпочтительно менее 1000, и аминокислотные остатки не обладают какой-либо функцией связывания антигенов, а также при условии, что каркас сам по себе при отсутствии аминокислотных остатков способен ингибировать образование ADDL, как это описывается в Примере 1 данного документа. В предпочтительном варианте осуществления непептидные соединения, описанные в данном документе, не содержат аминокислотных остатков, происходящих из 1-20 природных аминокислот.

Термины "пептиды" и "белки" относятся к высокомолекулярным соединениям, содержащим множество аминокислотных остатков, связанных амидными связями -C(O)-NR-. Аминокислотные остатки, как правило, происходят из 1-20 природных аминокислот.

Термин "растворимый" подразумевает способность определенного вещества растворяться в каком-нибудь растворителе (примером такого вещества в настоящем изобретении является Аβ_1-42 олигомер). В контексте настоящего изобретения растворимые Аβ_1-42 олигомеры поддаются фракционированию посредством центрифугирования.

Термин "олигомерный" обозначает белковый комплекс определенного количества мономерных звеньев. В контексте данного изобретения олигомеры называются тримерами, олигомеры с небольшим количеством (n) звеньев, додекамеры (содержат 12 звеньев) и мультимеры с большим количеством (n) звеньев, состоящие из Аβ_1-42. Термин "олигомерный" не включает сенильные амилоидные бляшки.

Термин "глобулярный" обозначает крупный растворимый белковый комплекс, который можно отделить от фибрилл и амилоидных бляшек. Предпочтительно, глобулярная структура по размеру составляет от 4 до 12 нанометров (нм), предпочтительно от 4,7 до 11 нм, что определяется анализом с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) надосадочных фракций препаратов растворимого Аβ_1-42 олигомера (ADDL), описанных в патенте США №6218506.

Термин "нефибриллярный" обозначает Аβ_1-42 пептиды и олигомерные комплексы, которые не выстраиваются в ряд с образованием морфологически отчетливых структур, так называемых амилоидных протофибрилл или амилоидных фибрилл.

Термином "ADDL" обычно обозначаются диффундирующие лиганды, происходящие из бета-амилоида, которые обладают следующими характеристиками: они представляются собой растворимые, олигомерные, глобулярные, небриллярные, нейротоксичные Аβ_1-42 пептиды.

Термин "практически чистый" означает, что вещество практически не содержит примесей, например содержит примеси в количестве менее 20%.

В одном варианте осуществления соединение считается практически чистым, если содержит примеси в количестве менее 10%, а в другом варианте осуществления - менее 1%.

Соединения, описанные в данном документе, применяются в способе подавления, регуляции и/или модуляции сборки ADDL in vitro, либо in vivo. Термины "болезнь", "нарушение" и "расстройство" используются как включающие друг друга и относятся к любому состоянию, которое, по меньшей мере, отчасти опосредовано ADDL. В контексте данного изобретения болезнь может быть ассоциирована с нерастворимыми амилоидными фибриллами, сенильными бляшками, нейрофибриллярными клубками и/или сверхэкспрессией амилоидного β_1-42 белка. К примерам таких болезней относятся болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, легкие когнитивные нарушения, инсульт, очаговая ишемия, связанная со слабоумием, и неврональная дистрофия. К пациентам, восприимчивым к лечению, относятся индивидуумы с риском развития заболевания, но у которых не проявляются его симптомы, а также пациенты с проявлением симптомов в текущий момент. Таким образом, соединения, описанные в данном документе, можно вводить всем слоям населения с целью профилактики без необходимости в какой-либо оценке группы больных.

Термин "пациент" относится к животным, включая млекопитающих, людей и т.д. В отдельных вариантах осуществления пациентом является животное, в частности животное, выбранное из таких видов млекопитающих, как крыса, кролик, бык, овца, свинья, собака, кошка, мышь, лошадь и примат, в частности человек.

Упоминаемые способы особенно полезны для индивидуумов, у которых существует генетический риск развития болезни Альцгеймера. К таким индивидуумам относятся индивидуумы, у родственников которых было диагностировано заболевание или был определен риск его развития по анализу генетических или биохимических маркеров. К генетическим маркерам риска развития болезни Альцгеймера являются мутации гена белка-предшественника амилоида (БПА), в частности мутации в 717 положении и 670 и 671 положениях, именуемые мутациями Харди и Шведской мутацией соответственно. Другими маркерами риска являются мутации генов пресенилинов PS1 и PS2, и АроЕ4, семейный анамнез болезни Альцгеймера, гиперхолестеринемия или атеросклероз. Индивидуумы, страдающие в настоящее время от болезни Альцгеймера, могут быть распознаны по характерному слабоумию, а также по наличию факторов риска, перечисленных выше. Кроме того, доступен ряд диагностических испытаний для идентификации индивидуумов с болезнью Альцгеймера. К таким испытаниям относится измерение содержания тау-протеина и Аβ_1-42 в спинномозговой жидкости. Индивидуумов, страдающих от болезни Альцгеймера, также можно диагностировать по критерию болезни Альгеймера и связанных с ним расстройств (ADRDA) или по способу, раскрытому в данном документе.

Пациенты, у которых не обнаруживаются симптомы заболевания, могут начинать проходить лечение в любом возрасте (например, с 10-, 20-, 30-летнего возраста). Однако, как правило, необходимо начинать лечение до тех пор, пока пациент не достигнет 40-, 50-, 60- или 70-летнего возраста. Обычно курс лечения включает многократное дозирование на протяжении определенного периода времени. За курсом лечения можно наблюдать, анализируя содержание ADDL со временем.

Термин "лечение" болезни включает: (1) предотвращение заболевания, т.е. остановку развития клинических симптомов заболевания у пациента, который подвергается риску развития заболевания или предрасположен к заболеванию, но который еще не испытывает или проявляет симптомы заболевания; (2) подавление заболевания, т.е. купирование или снижение риска развития заболевания или его клинических симптомов; или (3) облегчение заболевания, т.е. стимулирование рецидива заболевания или его клинических симптомов.

Выражение "страдает" в контексте термина "лечение" относится к пациенту или индивидууму, у которого диагностируют или который предрасположен к заболеванию. Также могут говорить, что у пациента "имеется риск развития заболевания". У указанного больного еще и не проявилась характеристическая патология заболевания, однако известно, что он предрасположен к заболеванию из-за семейного анамнеза, т.е. он генетически предрасположен к заболеванию или у него диагностируют заболевание или расстройство, которое предрасполагает его к развитию заболеванию, которое необходимо излечить.

Помимо болезни Альцгеймера известно несколько других заболеваний, связанных с образованием Аβ_1-42, к которым относятся синдром Дауна, инсульт и легкие когнитивные нарушения (и перечень этим не ограничивается). Можно допустить, что, как и в случае болезни Альгеймера, лечение пациентов, страдающих или имеющих риск развития этих заболеваний, может быть осуществлено за счет параллельных механизмов заболевания.

Термин "сенильная бляшка" или "образование сенильных бляшек" относятся к внеклеточным отложениям амилоида в сером веществе мозга. Отложения связаны с вырожденными нервными структурами. Подразумевается, что сенильные бляшки отличаются от ADDL или, иначе говоря, между ними и ADDL можно провести различия.

Подобным же образом, сверхэкспрессия Аβ_1-42 связана с очаговой ишемией, ассоциированной со слабоумием, или связана с нейрональной дистрофией. Сверхэкспрессия Аβ_1-42, как полагают, является следствием накопления ADDL, которые вызывают нейротоксичность. Лечение больного, страдающего или имеющего риск развития одного из этих заболеваний, путем введения ему одного или нескольких описанных соединений будет способствовать устранению нейротоксичности сверхэкспрессированного Аβ_1-42 .

Термин "нейротоксичность" относится к токсичному воздействию ADDL на нервные клетки in vitro и/или in vivo. ADDL связывают специфичные нервные рецепторы, инициируя аномальную передачу нервных сигналов, что нарушает длительное потенцирование и вызывает ухудшение памяти. Таким образом, ADDL изменяют функцию нервной клетки таким образом, что, несмотря на сохраняющуюся ее жизнеспособность, нейроны перестают функционировать должным образом. Такая измененная функциональность называется в этом документе "нейрональной дисфункцией", которая является подвидом нейротоксичности. Продолжительное воздействие ADDL на передачу сигналов приводит к неправильной транскрипции и прогрессивному исчезновению синапсов, а при очень продолжительном воздействии и накоплении структурных патологий происходит окончательная смерть нервных клеток и тяжелая дистрофия мозга.

В лечебных целях пациенту с подозрением на наличие заболевания (или который уже страдает заболеванием), связанного с накоплением ADDL, вводят фармацевтическую композицию, содержащую одно или несколько описанных соединений, при этом указанные соединения вводят в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, для частичного подавления симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), в том числе при возникновении осложнений или промежуточных патологических фенотипов в процессе развития заболевания.

В профилактических целях фармацевтическую композицию, содержащую одно или несколько описанных соединений, вводят пациенту, восприимчивому к заболеванию или имеющему риск развития заболевания, связанного с накоплением ADDL, при этом указанные соединения вводят в количестве, достаточном для устранения или снижения риска заболевания, уменьшения остроты или задержки начала болезни. Сюда включаются биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы болезни, ее осложнения и промежуточные патологические фенотипы, проявляющиеся в процессе развития заболевания.

В некоторых способах при введении соединения снижаются или устраняются легкие когнитивные нарушения у пациентов, у которых еще не развилась характеристическая патология Альцгеймера. В отдельных вариантах осуществления под терапевтически эффективным количеством подразумевается количество одного или нескольких описанных соединений, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение. Подробное описание вариантов осуществления, относящихся к улучшению когнитивной функции, можно найти в заявке № PCT/US2007/_____ под названием "Способы улучшения когнитивной функции с помощью непептидных соединений", подданной 12 июля 2007 года, реестр поверенного №089265-1450, которая включается в данный документ по ссылке в ее общем виде.

"Эффективное количество" - это количество одного или нескольких соединений, описанных в этом документе, посредством которого лечат заболевание, опосредованное ADDL. Предпочтительно соединения данного изобретения способствуют снижению образования ADDL либо in vitro, либо in vivo, как минимум, на 10%, 25%, 40%, 60%, 80%, 90% или 95% по сравнению с контролем.

"Терапевтически эффективное количество" варьируется в зависимости от используемого соединения, типа и остроты заболевания, а также от возраста, веса и других особенностей пациента, подвергаемого лечению, при этом каждый из перечисленных параметров находится в пределах компетенции лечащего врача. Предполагается, что терапевтически эффективное количество одного или нескольких соединений, описанных в этом документе, будет влиять на образование ADDL (в том числе способствовать подавлению или изменению направления образования ADDL) у больного в сравнении с процессом связывания ADDL без проведения лечения. По сути, при этом подавляется процесс ухудшения длительного потенцирования и последующего ухудшения памяти. Терапевтически эффективное количество отличается от количества, оказывающего биологическое воздействие ("биологически эффективного количества"). Соединение настоящего изобретения оказывает один или несколько биологических эффектов in vitro или даже in vivo, например, в некоторой степени снижает образование ADDL. Однако биологическое воздействие может и не приводить к проявлению вышеописанного терапевтического эффекта на клинически заметном уровне, что определяется по методам, находящимся в пределах компетенции лечащего врача.

"Нервная клетка" или "нейрон" - это клетка, которая передает и обрабатывает сигналы в головному мозге или других органах нервной системы. Кроме того, используемые в настоящем изобретении нервные клетки могут быть отделены от ткани животного или мозговой ткани или выращены в тканевой культуре. Выделяемые клетки могут состоять из устойчивых линий нервных клеток, выбранных, например, из МС65; HCN-2; SH-SY5Y; SK-N-AS; SK-N-FI; SK-N-DZ; H19-7/IGF-IR; QNR/D; QNR/K2; C8-D30; C8-S; C8-D1A; OLGA-PH-J/92; Daoy; RSC96; SW10; RT4-D6P2T; RN33B; PC-12; DBRTG-05MG; С8-В4; SK-N-SH; B35; R3[33-10ras3]; Neuro-2A и HCN-IA или любых их генетически, химически и/или биохимически модифицированных вариаций (и перечень этим не ограничивается). Выделяемые клетки могут также состоять из зародышевых и/или астроглиальных клеток нервных тканей, выбранных, например, из гиппокампа, мозжечка, коры головного мозга, гипоталамуса, среднего мозга, спинного мозга, стриатума, лобной, височной, теменной, затылочной доли головного мозга и их любых генетически, химически и/или биохимически модифицированных вариаций. Выделяемые, культивируемые животные клетки могут состоять из нервных стволовых клеток или любых видоизмененных, генетически, химически и/или биохимически модифицированных вариаций этих клеток.

Используемый в этом документе термин "нервная ткань" относится к любой части центральной нервной системы, включая, в частности, головной или спинной мозг. Нервная ткань может состоять, по меньшей мере, отчасти из нервных клеток.

Термин "амилоидные фибриллы" обозначает белковые массы, обладающие особыми структурными признаками. В гистопатологических методах обычно устанавливаются структуры за счет двойного лучепреломления светло-зеленого света при окрашивании их красителем конго красный с последующим просматриванием под поляризованным светом.

Термин "клубки" обозначает нейрофибриллярные клубки, образующиеся внутри вырожденных нейронов при связывании спаренных спиралевидных фрагментов, которые собираются из гиперфосфорилированных форм белков, ассоциированных с микротрубочками, под названием "тау".

В. Соединения

Соединения, применяемые в описанных способах, представляют собой практически чистые непептидные соединения с молекулярной массой менее 1000. В одном варианте осуществления соединения, применяемые в способах изобретения, предпочтительно, обладают одной или несколькими из следующих характеристик: (1) низкое или субмикромолярное содержание в лекарственном препарате при испытании их в анализе РПЭФ, описываемом в этом документе; (2) отсутствие агрегации; (3) небольшая или нулевая нейротоксичность при введении пациенту; (4) удобная растворимость в водной среде; (5) поддаются химической обработке; (6) имеют дозозависимые характеристики; (7) обратимое связывание с Аβ белком; (7) способность связывать β-амилоидный мономер; (8) способность связывать растворимые β-амилоидные олигомеры.

В одном варианте осуществления изобретения соединения, применяемые для лечения пациентов, пригодны для приема внутрь. В этом варианте осуществления соединения соответствуют правилу Липински 5, которое обеспечивает критерий оценки лекарственных свойств. В этом правиле, в общем, утверждается, что лекарство, проявляющее активность при пероральном введении, имеет: не более 5 доноров водородных связей (групп ОН и NH); не более 10 акцепторов водородных связей (в частности, атомов N и О); молекулярную массу менее 500 г/моль и коэффициент распределения log P менее 5.

1. Выбор соединения

Предпочтительный способ выбора соединений с целью использования их в способах изобретения включает анализ соединений на резонансный перенос энергии флуоресценции (РПЭФ). Метод РПЭФ используют для измерения, обнаружения, идентификации, оценки, анализа и характеризации различных взаимодействий и процессов в биологических системах (см., например, Mitra и соавт. (1996) Gene 173:13-17; De Angelis (1999) Physiol. Genomics. 21:93-99; Latif and Graves (2000) Thyroid 10(5):407-412; Rye (2001) Methods 24(3):278-288; Kenworthy (2001) Methods 24 (3):289-296; Periasamy (2001) J. Biomed. Opt. 6(3):287-291; Truong and Ikura (2001) Curr. Opin. Struct. Biol. 11(5):573-578; Zhang и соавт. (2002) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3(12):906-918; Sitte and Freissmuth (2003) Eur. J. Pharmacol. 479:229-236; Milligan (2004) Eur. J. Pharm. Sci. 21(4):397-405; Herman и соавт. (2004) Methods Mol. Biol. 261:351-370; Roda и соавт. (2004) Trends Biotechnol. 22(6):295-303; Wallrabe and Periasamy (2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16(1):19-27; Milligan and Bouvier (2005) FEBS J. 272(12):2914-2915; а также ссылки в любом из перечисленных документов и т.п.).

Способы, протоколы, методики, оценки и другие подобные процедуры, используемые в анализе РПЭФ, описаны в общем и в частности в ряде патентов и заявок на патент, в том числе в: патенте США №6908769; патенте США №6824990; патенте США №6762280; патенте США №6689574; патенте США №6661909; патенте США №6642001; патенте США №6639078; патенте США №6472156; патенте США №6456734; патенте США №6376257; патенте США №6348322; патенте США №6323039; патенте США №6291201; патенте США №6280981; патенте США №5914245; патенте США №5661035; и в ссылках любого из перечисленных документов и т.п.

Подобным же образом, для измерения, обнаружения, идентификации, оценки, анализа и характеризации различных взаимодействий и процессов в биологических системах использовали метод флуоресцентной поляризации (ФП) (см., например, Lundblad и соавт. (1996) Mol. Endocrinol. 10(6):607-612; Nasir and Jolley (1999) Comb. Chem. High Throughput Screen. 2(4):177-190; Park and Raines (2004) Methods Mol. Biol. 261:161-166; а также ссылки в любом из вышеперечисленных документов и т.п.).

Способы, протоколы, методики, оценки и другие подобные процедуры, используемые в методе ФП, описаны в общем и в частности в ряде патентов и заявок на патент, в том числе в: патенте США №6794158; патенте США №6632613; патенте США №6630295; 6596546; патенте США №6569628; 6555326; патенте США №6511815; патенте США №6448018; патенте США №6432632; патенте США №6331392; патенте США №6326142; патенте США №6284544; патенте США №6207397; патенте США №6171807; патенте США №6066505; патенте США №5976820; патенте США №5804395; патенте США №5756292; патенте США №5445935; патенте США №5427960; патенте США №5407834; патенте США №5391740; патенте США №5315015; патенте США №5206179; патенте США №5070025; патенте США №5066426; патенте США №4952691; патенте США №4863876; патенте США №4751190; патенте США №4681859; патенте США №4668640; патенте США №4614823; патенте США №4585862; патенте США №4510251; патенте США №4476229; патенте США №4429230; патенте США №4420568; патенте США №4203670; а также в ссылках любого из перечисленных документов и т.п.

Методы РПЭФ и ФП используют в области исследования амилоидов (см., например, патент США №6927401; патент США №6906104; патент США №6905827; патент США №6881546; патент США №6864290; патент США №6864103; патент США №6858383; патент США №6846813; патент США №6828106; патент США №6803188; патент США №6770448; патент США №6713276; патент США №6600017; патент США №6515113; патент США №6495664; патент США №6323039; патент США №6294330; патент США №6280981; патент США №6197928; патент США №5981200; Kim and Lee (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 316(2):393-397; Bacskai и соавт. (2003) J. Biomed. Opt. 8(3):368-375; Gorman, P.M. и соавт. (2003) J. Mol. Biol. 325(4):743-757; Garzon-Rodrequez и соавт. (1997) J. Biol. Chem. 272(34):21037-21044; Lindgren и соавт. (2005) Biophys. J. 88 (6): 4200-4212; Lewis и соавт. (2004) Neurobiol. Aging 25(9):1175-1185; Leissring и соавт. (2003) J. Biol. Chem. 278(39):37314-37320; Taylor и соавт. (2003) J. Protein Chem. 22(1):31-40; Allsop и соавт. (2001) Biochem. Soc. Symp. 67:1-14; Allsop и соавт. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 285(1):58-63; Huang и соавт. (2000) J. Biol. Chem. 275(46):36436-36440; а также ссылки в вышеперечисленных документах и т.п.).

2. Приложения метода РПЭФ для поиска подходящего соединения

Методом анализа РПЭФ в Примере 1 исследовали различные соединения из коммерчески доступных библиотек на предмет специфичного ингибирования образования растворимых олигомеров Аβ_1-42. Идентифицировали соединения-прототипы и при этом получены библиотеки соединений. Помимо этого установлена зависимость активности соединений-прототипов от структуры, что позволило дополнительно повысить их активность.

3. Примерные соединения, используемые в способах изобретения

Конкретные примеры соединений, используемых в изобретении, представлены далее в Таблице 1. Подразумевается, что иллюстрация этих соединений никоим образом не ограничивает изобретение соединениями, перечисленными в таблицах, и поэтому предполагается, что и другие соединения пригодны для применения в данном изобретении.

В таблице также представлены значения IC₅₀ соединений, протестированных методом анализа, описанным в Примере 1. В каждом случае перечисленные соединения в равной степени доступны для приобретения от компаний, указанных в таблице. Следует отметить, что следующие соединения имеют пространственные изомеры (т.е. Е и Z изомеры), и изобретение предполагает использование любого из возможных изомеров либо их смесей.

Таблица 1
Примерные соединения
№	Структура соединения	Название соединения	IC50 (мкМ)	Источник
1		(Z)-N-(2-Метокси-фенил)-2-оксо-2-{N'-[3-оксо-3-тиофен-2-ил-1-трифторметил-пропилиден]-гидразино}-ацетамид	3,9	deCODE
2		Этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидрокси-3-метокси-фенил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты	3,5	Aldrich
3		Этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксинафталин-1-ил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты	4,4	Aldrich
№	Структура соединения	Название соединения	IC50 (мкМ)	Источник
4		Этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксифенил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты	1,1	Aldrich
5		2-(5-Гидрокси-3-изобутил-5-(трифторметил)-4,5-дигидро-1H-пиразол-1-ил)-N-(2-метоксифенил)-2-оксоацетамид	3,2	Chem Div
6		(Е)-2-Гидрокси-N'-((1-гидроксинафталин-2-ил)метилен)бензогидразид	3,8	deCODE

С. Испытание и введение

Эффективные дозы композиций настоящего изобретения, используемых для лечения вышеперечисленных заболеваний, могут варьироваться в зависимости от различных факторов, в том числе от способов введения, физиологического состояния пациента, других вводимых лекарственных препаратов, от того, является ли пациент человеком или животным, и от того, с какой целью проводится лечение: профилактической или терапевтической. Обычно пациентом является человек, но в отдельных вариантах осуществления пациентом является животное, в частности животное, выбранное из млекопитающих, включая крысу, кролика, быка, овцу, свинью, собаку, кошку, мышь, лошадь и примата.

Соединения можно вводить многократно, при этом интервалы между одиночными дозами могут составлять дни, недели, месяцы или годы. Интервалы могут быть также неодинаковыми, что определяется путем измерения содержания Аβ_1-42 белка ADDL, или комплексов ADDL в крови пациента. В качестве альтернативы, одно или несколько соединений изобретения можно вводить в виде состава с замедленным высвобождением, в таком случае введение препарата проводится с меньшей частотой. Дозировка и частота введения могут варьироваться в зависимости от периода полувыведения соединений изобретения. В лечебных целях иногда требуется вводить относительно высокую дозу за сравнительно короткие промежутки времени до тех пор, пока не снизится или прекратится развитие заболевания, а предпочтительно до тех пор, пока у пациента не будет наблюдаться частичное или полное устранение симптомов заболевания. После этого пациент может быть переведен на профилактический режим.

Введение фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь соединения, можно осуществлять различными способами, в частности через рот, легкие, местным, ректальным, подкожным, интрадермальным, интраназальным, внутричерепным, внутримышечным, внутриглазным способами, внутрисуставной инъекцией и другими подобными способами. Наиболее предпочтительным способом введения является прием препарата внутрь, хотя в равной степени эффективными могут быть и другие способы. Одно или несколько описанных здесь соединений можно необязательно вводить в комбинации с другими биологическими или химическими агентами, которые, как минимум, отчасти эффективны при лечении заболеваний, ассоциированных с Аβ_1-42. Примером таких агентов являются антитела против Аβ_1-42, описанные в международных заявках №№ WO 2003/253673, WO 2006/014478, патенте США №2489195, публикации патента США №2007-0048312 и заявке на патент США №11/571532, которые включаются в данный документ по ссылке.

Описанные здесь соединения можно вводить пациенту в количестве, достаточном для подавления, регуляции и/или модуляции образования нейротоксичных ADDL или активности подобных лигандов в организме упомянутого пациента. Квалифицированный врач может легко установить подходящие количества описанных здесь соединений, которые бы эффективно подавляли, регулировали и/или модулировали образование нейротоксичных ADDL или активность подобных лигандов в организме упомянутого пациента. Предполагаемые количества описанных здесь соединений составляют, например, от 0,05 до 2000 мг/(м²/день) для одного или нескольких соединений.

Как отмечено выше, описанные здесь соединения можно вводить, к примеру, через рот, местно, через легкие, прямую кишку, подкожно, интрадермально, через нос, внутричерепным, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным и другими подобными способами. Носителем или наполнителем, или смесью наполнителей в лекарственном препарате может являться растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, различные полярные или неполярные растворители, их подходящие смеси или масла. Используемый в этом документе термин "носитель" или "наполнитель" обозначает фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель и включает все без исключения растворители, диспергирующие средства или среды, покрытия, противомикробные средства, изо/гипо/гипертонические вещества, вещества, изменяющие поглощение, и т.п. Использование таких веществ и средств для фармацевтически активных соединений общеизвестно в данной области техники. Более того, в конечную композицию можно включать любые другие или вспомогательные активные ингредиенты.

К заболеваниям, лечимым описанными здесь способами, относятся болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, инсульт, легкие когнитивные нарушения, очаговая ишемия, связанная со слабоумием, и неврональная дистрофия.

D. Фармацевтические составы и способы введения

При использовании в качестве лекарственных средств соединения данного изобретения обычно вводят в форме фармацевтических композиций. Эти соединения можно вводить различными способами, в том числе через рот, местно, через легкие, прямую кишку, подкожным, подкожным, интрадермальным, интраназальным, внутричерепным, внутримышечным, внутриглазным способами или внутрисуставной инъекцией. Эти соединения проявляют эффективность в композициях, вводимых как инъекцией, так и через рот. Такие композиции готовят по методике, хорошо известной в фармацевтике, и содержат, по меньшей мере, одно активное соединение. Это изобретение также включает фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента одно или несколько описанных здесь соединений наряду с фармацевтически приемлемыми носителями. При приготовлении композиций изобретения активный ингредиент обычно смешивают с наполнителем, разбавляют наполнителем или помещают внутрь носителя, который может находиться в виде капсулы, пакета-саше, листа бумаги или какого-либо иного контейнера. Используемый наполнитель, как правило, пригоден для введения пациенту. В том случае, если наполнитель выполняет роль разбавителя, то им может являться твердый, полутвердый или жидкий материал, который служит в качестве переносчика, носителя или среды для активного ингредиента. Таким образом, композиции могут находиться в форме таблеток, пилюль, порошков, лепешек, пакетов-саше, крахмальных капсул, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердого вещества или внутри жидкой среды), мазей, содержащих, например, активное соединение в количестве до 10% по массе, мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных инъецируемых растворов и стерильных упакованных порошков.

При приготовлении состава может понадобиться измельчить активное соединение для получения подходящего размера частиц с целью смешения его с другим ингредиентами. Если активное соединения является по существу нерастворимым, то обычно его измельчают до получения частиц с размером менее 200 меш. Если активное соединение является по существу водорастворимым, то размер частиц обычно регулируют путем дробления состава до получения практически равномерного распределения, например, получая частицы размером около 40 меш.

K некоторым примерам подходящих наполнителей относятся лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмалы, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, панитилпирролидон, целлюлоза, вода, сироп и метилцеллюлоза. Составы могут, кроме того, включать: смазочные вещества, такие как тальк, стеарат магния и минеральное масло, увлажняющие средства, эмульгирующие и суспендирующие агенты, предохраняющие средства, такие как метил- и пропилгидроксибензоаты, подсластители и вкусовые добавки. Композиции изобретения могут быть составлены так, что обеспечивают быстрое, устойчивое и замедленное высвобождение активного ингредиента после введения их пациенту по методикам, известным в данной области техники.

Внутривенное введение терапевтических средств общеизвестно в фармацевтической промышленности. Составы для внутривенного введения должны обладать определенными свойствами, не говоря уже о том, что терапевтическое средство должно растворяться в них. Например, состав должен способствовать общей устойчивости активного(ых) ингредиента(ов), а производство состава должно быть рентабельным. Все эти факторы в конечном итоге определяют общий успех применения и полезность внутривенного состава.

В фармацевтические составы с соединениями настоящего изобретения можно включать и другие вспомогательные добавки, такие как растворители: этанол, глицерин, пропиленгликоль; стабилизаторы:

этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), лимонная кислота; противомикробные консерванты: бензиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен; буферные вещества: лимонная кислота/цитрат натрия, битартрат калия, битартрат натрия, уксусная кислота/ацетат натрия, малеиновая кислота/малеат натрия, гидрофталат натрия, фосфорная кислота/дигидрофосфат калия, фосфорная кислота/гидрофосфат динатрия; модификаторы тоничности: хлорид натрия, маннит, декстроза.

Буфер может понадобиться для поддержания рН водного раствора в диапазоне от 4 до 8 и, более предпочтительно, в диапазоне от 4 до 6. Буферная система обычно представляет собой смесь слабой кислоты и ее растворимой соли, например смесь цитрата натрия и лимонной кислоты; либо однокатионную или двухкатионную соль двухосновной кислоты, например битартрат калия, битартрат натрия, смесь фосфорной кислоты и дигидрофосфата калия и смесь фосфорной кислоты и гидрофосфата динатрия.

Используемое количество буферной системы зависит (1) от требуемого рН и (2) от количества лекарства. Обычно используемое в составе количество буфера в молярном отношении к лекарству составляет от 0,5:1 до 50:1 (количество буфера взято в расчете на общее количество молей буферных ингредиентов, например, цитрата натрия и лимонной кислоты), для поддержания рН в диапазоне от 4 до 8 молярное отношение буфера (общее) к лекарству должно составлять от 1:1 до 10:1.

Одним из буферов, подходящих для изобретения, является смесь цитрата натрия и лимонной кислоты в количестве 5-50 мг/мл цитрата натрия на 1-15 мг/мл лимонной кислоты, достаточном для поддержания рН водной композиции на уровне 4-6.

Буферное вещество можно также добавлять для предотвращения осаждения лекарства при образовании растворимого металлокомплекса под действием растворенных ионов металлов, например ионов Са, Mg, Fe, Al, Ba, которые могут вымываться из стеклянных сосудов или резиновых пробок, или могут содержаться в обычной водопроводной воде. Добавка может выступать также в роли комплексообразователя, конкурирующего с лекарством, и давать растворимый металлокомплекс, приводя к образованию нежелательных частиц.

Помимо этого может потребоваться присутствие какой-либо добавки, например хлорида натрия в количестве 1-8 мг/мл для регулирования тоничности на уровне тоничности человеческой крови, для предотвращения разбухания или сжатия эритроцитов при введении внутривенного состава, что приводит к нежелательным побочным эффектам, таким как тошнота и диарея, и даже к сопутствующим заболеваниям крови. В общем, тоничность состава соответствует тоничности человеческой крови, которая составляет от 282 до 288 мОсм/кг и, как правило, 285 мОсм/кг, что эквивалентно осмотическому давлению, создаваемому 0,9% раствором хлорида натрия.

Внутривенный состав можно вводить прямой внутривенной инъекцией, через внутривенный болюс или путем вливания подходящего инфузионного раствора, например 0,9% раствора хлорида натрия или другого совместимого инфузионного раствора.

Композиции могут быть составлены в виде дозированной лекарственной формы для приема внутрь. Термин "дозированные лекарственные формы" относится к физически дискретным единицам, используемым в качестве стандартных доз для пациента, при этом каждая доза содержит наряду с подходящим фармацевтическим наполнителем заранее определенное количество активного материала, рассчитанного на получение желаемого терапевтического эффекта.

Активное соединение проявляет эффективность в широком диапазоне дозировок и обычно вводится в фармацевтически эффективном количестве. Однако подразумевается, что фактически вводимое количество соединения будет опредяться врачом с учетом соответствующих условий, включая условия лечения, выбранный способ введения, тип соединения, вводимого в данный момент, возраст, вес и реакцию отдельного пациента, остроту симптомов больного и т.п.

При приготовлении твердых композиций в виде таблеток главный активный ингредиент смешивают с фармацевтическим наполнителем, получая твердый предварительный состав, содержащий гомогенную смесь соединения настоящего изобретения. При упоминании гомогенных предварительных композиций имеется в виду, что активный ингредиент равномерно диспергирован по всей композиции так, что ее можно легко разделить на дозированные лекарственные формы с одинаковой эффективностью, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Далее твердый предварительный состав делят на описанные выше дозированные лекарственные формы, содержащие, например, от 0,05 до 2000 мг активного ингредиента настоящего изобретения.

Таблетки или пилюли настоящего изобретения можно покрывать или составлять иным образом, получая лекарственную форму пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний или внешний лекарственный компонент, при этом последний находится в оболочке, покрывающей внутренний компонент. Указанные два компоненты могут быть отделены энтеросолюбильным слоем, который противодействует процессу измельчения в желудке и позволяет внутреннему компоненту поступать в двенадцатиперстную кишку в цельном виде либо задерживаться при высвобождении. Для подобных энтеросолюбильных слоев или покрытий можно использовать различные материалы, включая ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими веществами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

К жидким лекарственным формам, в состав которых входят новые композиции настоящего изобретения и которые могут вводиться через рот или инъекцией, относятся водные растворы, ароматизированные подходящим образом сиропы, водные или масляные суспензии и ароматизированные эмульсии с пищевыми маслами, такими как хлопковое, сезамовое, кокосовое или растительное арахисовое масло, а также эликсиры и схожие фармацевтические основы.

К композициям, вводимым ингаляцией или вдуванием, относятся растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях, или в их смесях, а также порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые наполнители, описанные выше. Предпочтительно композиции вводят через рот или дыхательные пути для оказания местного или системного эффекта. Композиции в предпочтительных фармацевтически приемлемых растворителях могут быть распылены с использованием инертных газов. Распыляемые растворы можно выпускать прямо из распыляющего устройства, либо возможно прикрепление распыляющего устройства к опоре защитной маски или дыхательному аппарату с положительным перемежающимся давлением. Растворенные, суспензионные или порошковые композиции можно предпочтительно вводить через рот или нос из устройств, с помощью которых осуществляется надлежащая доставка состава.

Следующие примеры составов иллюстрируют предполагаемые фармацевтические композиции настоящего изобретения.

Пример состава 1

Готовят жесткие желатиновые капсулы, содержащие следующие ингредиенты:

Ингредиент	Количество (мг/капсулу)
Активный ингредиент	30.0
Крахмал	305.0
Стеарат магния	5.0

Смешивают вышеперечисленные ингредиенты и заполняют полученной смесью жесткие желатиновые капсулы в количестве 340 мг.

Пример состава 2

Состав таблетки готовят с использованием нижеуказанных ингредиентов:

Ингредиент	Количество (мг/таблетку)
Активный ингредиент	25.0
Целлюлоза, микрокристаллическая	200.0
Коллоидальный диоксид кремния	10.0
Стеариновая кислота	5.0

Смешивают компоненты, и полученную смесь сжимают, получая таблетки массой 240 мг каждая.

Пример состава 3

Ингаляционный состав сухого порошк готовят с использованием следующих компонентов:

Ингредиент	% по массе
Активный ингредиент	5
Лактоза	95

Активный ингредиент смешивают с лактозой, и полученную смесь добавляют в приспособление для ингаляции сухого порошка.

Пример состава 4

Таблетки, каждая из которых содержит по 30 мг активного ингредиента, готовят следующим образом:

Ингредиент	Количество (мг/таблетку)
Активный ингредиент	30,0 мг
Крахмал	45,0 мг
Микрокристаллическая целлюлоза	35,0 мг
Поливинилпирролидон (в виде 10% раствора в стерильной воде)	4,0 мг
Натрий-карбоксиметил целлюлоза	4,5 мг
Стеарат магния	0,5 мг
Тальк	1,0 мг

Активные ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито с размером пор 20 меш (по стандарту США) и тщательно перемешивают. Раствор поливинилпирролидона смешивают с полученными порошками, и полученную смесь пропускают через сито с размером пор 16 меш. Полученные таким образом гранулы высушивают при 50-60°С и пропускают через сито с размером пор 16 меш. Натрий-карбоксиметилцеллюлозу, стеарат магния и тальк пропускают через сито с размером пор 30 меш, а затем добавляют к гранулам, которые после смешения сжимают на таблетировочной машине, получая таблетки массой 120 мг.

Пример состава 5

Капсулы, каждая из которых содержит по 40 мг активного ингредиента, получают следующим образом:

Ингредиент	Количество (мг/капсулу)
Активный ингредиент	40,0 мг
Крахмал	109,0 мг
Стеарат магния	1,0 мг
Общее количество	150,0 мг

Смешивают активный ингредиент, крахмал и стеарат магния, пропускают смесь через сито с размером пор 20 меш и заполняют ей твердые желатиновые капсулы в количестве по 150 мг.

Пример состава 6

Суппозитории, каждый из которых содержит по 25 мг активного ингредиента, получают следующим образом:

Ингредиент	Количество
Активный ингредиент	25 мг
Глицериды насыщенных жирных	до 2000 мг
кислот

Активный ингредиент пропускают через сито с размером пор 60 меш и суспендируют в глицеридах насыщенных жирных кислот, предварительно расплавленных при минимальном нагреве. Затем смесь заливают в форму для суппозитория с номинальной емкостью 2,0 г и оставляют охлаждаться.

Пример состава 7

Суспензии, каждая из которых содержит по 50 мг лекарственного вещества на 5,0 мл дозу, получают следующим образом:

Ингредиент	Количество
Активный ингредиент	50,0 мг
Ксантановая камедь	4,0 мг
Натрий-карбоксиметил целлюлоза
(11%)
Микрокристаллическая целлюлоза	50,0 мг
(89%)
Сахароза	1,75 г
Ингредиент	Количество
Бензоат натрия	10,0 мг
Вкусовая добавка и краситель	достаточное
	количество
Очищенная вода	до 5,0 мл

Смешивают активный ингредиент, сахарозу и ксантановую камедь, смесь пропускают черзе сито с размером пор 10 меш, а затем смешивают с заранее приготовленным раствором микрокристаллической целлюлозы и натрий-карбоксиметилцеллюлозы в воде. Бензоат натрия, вкусовую добавку и краситель разбавляют небольшим количеством воды и добавляют при к первой смеси при перемешивании. Затем доводят объем раствора до требуемого значения добавлением воды.

Пример состава 8

Ингредиент	Количество (мг/капсулу)
Активный ингредиент	15,0 мг
Крахмал	407,0 мг
Стеарат магния	3,0 мг
Общее количество	425,0 мг

Смешивают активный ингредиент, крахмал и стеарат магния, пропускают смесь через сито с размером пор 20 меш и заполняют ею твердые желатиновые капсулы в количестве по 425,0 мг.

Пример состава 9

Подкожный состав можно приготовить следующим образом:

Ингредиент	Количество
Активный ингредиент	5,0 мг
Кукурузное масло	1,0 мл

Пример состава 10

Внутривенный состав можно приготовить следующим образом:

Ингредиент	Количество
Активный ингредиент	250 мг
Изотонический раствор	1000 мл

Для другого состава, используемого в способах настоящего изобретения, применяются устройства для трансдермальной доставки ("пластыри"). Такие трансдермальные пластыри можно использовать для обеспечения непрерывного или прерывистого вливания соединений настоящего изобретения в заданном количестве. Строение и применение трансдермальных пластырей для доставки фармацевтических средств общеизвестно в данной области техники. См., например, патент США №5023252, выданный 11 июня 1991 года и включаемый в данный документ по ссылке. Подобные пластыри могут предназначаться для непрерывной, пульсирующей доставки фармацевтических средств или для доставки их при возникающей необходимости.

Часто требуется или необходимо вводить фармацевтическую композицию в головной мозг прямым или косвенным способом. Прямые способы обычно включают помещение катетера для доставки лекарства в вентрикулярную систему организма больного при шунтировании гематоэнцефалического барьера. Одна из таких имплантируемых систем доставки, используемых для переноса биологических факторов в особые анатомические участки тела, описывается в патенте США №5011472, который включается в данный документ по ссылке.

Косвенные способы обычно включают составление композиций для придания лекарству скрытости путем превращения гидрофильных лекарств в липидорастворимую форму. Скрытость обычно достигается за счет блокировки гидроксильных, карбонильных, сульфатных и первичных аминогрупп, имеющихся в лекарстве, с целью удержания лекарства в более липидорастворимом и доступном состоянии при транспортировки его через гемоэнцефалический барьер. В качестве альтернативы, доставка гидрофильных лекарств может быть улучшена путем внутриартериального вливания гипертонических растворов, которые могут кратковременно открывать гемоэнцефалический барьер.

Другие составы, пригодные для использования в настоящем изобретении, можно найти в Remington′s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985).

Как отмечено выше, описанные здесь соединения пригодны для использования в различных системах лекарственной доставки, описанных выше. Кроме того, с целью повышения in vivo периода полувыведения вводимого лекарства из сыворотки крови соединения можно заключать в капсулу, вводить в полость липосом, приготавливать в виде коллоида или можно использовать другие способы увеличения периода полувыведения соединений из сыворотки крови. Доступны разнообразные способы получения липосом, описанные, например, Szoka и соавт. в патентах США №№4235871, 4501728 и 4837028, каждый из которых включается в этот документ по ссылке.

В профилактических целях композиции вводят пациенту с риском развития БА (что определяется, например, изучением генома пациента или наследственных особенностей) в количестве, достаточном для подавления начальных симптомов заболевания. Количество, удовлетворяющее этому условию, называется "профилактически эффективной дозой". Количества, эффективные для данной цели, зависят от предписаний лечащего врача, который определяет его с учетом таких факторов, как возраст, вес и общее состояние пациента и т.п.

Как отмечено выше, соединения, вводимые пациенту, находятся в форме фармацевтических композиций, описанных выше. Эти композиции могут быть простерилизованы по обычным методикам стерилизации или могут быть подвергнуты стерилизующему фильтрованию. Получающиеся в результате водные растворы можно упаковывать и использовать их в том виде, в котором они имеются, либо их можно высушивать в вакууме, при этом перед введением лиофилизированный препарат смешивают со стерильным водным носителем. рН препаратов соединений обычно находится в диапазоне от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9, и наиболее предпочтительно от 7 до 8. Подразумевается, что при использовании конкретных вышеперечисленных наполнителей, носителей или стабилизаторов будут образовываться фармацевтические соли.

Следующие примеры даны с целью иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают объем данного изобретения. Если не оговорено что-либо иное, то все температурные значения даны в градусах Цельсия.

ПРИМЕРЫ

Данное изобретение будет более понятно со ссылкой на следующие примеры, которые предназначены только для иллюстрации изобретения. Объем настоящего изобретения не ограничивается приведенными вариантами осуществления, которые являются лишь иллюстрациями отдельных аспектов изобретения. Любые функционально эквивалентные способы находятся в пределах объема изобретения. Различные модификации изобретения, помимо описанных здесь, будут очевидны специалистам в данной области техники из вышеизложенного описания и прилагаемых чертежей. Такие модификации попадают в пределы объема прилагаемой формулы изобретения.

В примерах и других местах данного документа аббревиатуры имеют следующие значения:

мкл = микролитр

ДМСО = диметилсульфоксид

г = грамм

ч = час

Гц = герц

М = моль на литр

мг = миллиграмм

мин = минута

мл = миллилитр

мМ = миллимоль на литр

мм = миллиметр

ммоль = миллимоль

мол. = моли

МС = масс-спектроскопия

Н = нормальность

нм = нанометр

мкМ = микромоль на литр

Пример 1. Анализ РПЭФ

Резонасный перенос энергии флуоресценции (РПЭФ) по Ферстеру - это зависящий от межъядерных расстояний, безызлучательный переход энергии, при котором девозбуждение одного флуорофора (донора) взаимосвязано с возбуждением другого флуорофора (акцептора). РПЭФ происходит, если (1) квант энергии, испускаемый донорным флуорофором, соответствует энергии возбуждения акцепторного флуорофора, (2) направления дипольных моментов переходов для донора и акцептора являются почти параллельными и (3) спектр испускания флуоресценции донора частично совпадает со спектром поглощения акцептора.

В данном анализе за образованием сборки Аβ_1-42 олигомера наблюдают по РПЭФ, используя N-концевые конъюгаты флуоресцеин-Аβ_1-42 в качестве донорного и акцепторного флуорофора (для конъюгата флуоресцеин-флуоресцеин R_O ~ 45 Å). Сборка Аβ_1-42 мономеров в олигомерные частицы приводит к уменьшению флуоресценции, поскольку Аβ_1-42, меченные флуоресцеином, приближаются друг к другу, а также к увеличению эффективности РПЭФ. Ингибирование сборки олигомеров Аβ_1-42 (ADDL) проявляется по отсутствию или ослаблению гашения флуоресценции.

Анализы РПЭФ и ФП проводят на 384-луночном черном, непрозрачном микротитрационном планшете из кальций-борофосфатного стекла с несвязывающей поверхностью, а буфер для анализа состоит из MOPS-Tris (3-(N-морфолин)пропансульфониевой кислоты - N-трис(гидроксиметил)-аминометана) с концентрацией 50 мМ (рН 8.0) и MgCl₂ с коцентрацией 100 мМ. Анализируемый объем, содержащий ФИТЦ-Аβ(1-42) (флуоресцеин-изотиоцианат - Aβ(1-42), концентрация 0,2 мкМ) и Aβ(1-42) (0,8 мкМ), составляет 50 мкл, а температура - 37°С. За сборкой ADDL наблюдают на планшет-ридере "Tecan GENios Pro" с длиной волны возбуждения 485 нм, измеряя испускание при длине волны 515 нм. Вывод о кинетических механизмах делают по измеренной интенсивности флуоресценции и путем считывания показаний поляризации через каждые пять минут на протяжении 3-6 часов. В реакциях отрицательного контроля, в которых не происходит заметной сборки в ADDL за указанный период времени, не участвует MgCl₂, но зато включаются все остальные буферные и пептидные компоненты. В реакциях положительного контроля присутствуют все буферные компоненты, при этом отсутствуют дополнительные реагенты на основе малых молекул и антител. Для испытания на предмет подавления сборки ADDL непептидное соединение выдерживают со смесью пептидов, готовя растворы с шестью различными концентрациями, которые постепенно понижают, начиная от 30 мкМ и до 0,05 мкМ.

При использовании вышеописанного метода анализа, в котором концентрация тестируемого соединения А варьировалась от 0,05 до 3 мМ, установлено, что для тестируемого соединения А характерно дозозависимое подавление сборки олигомерных Аβ_1-42 (ADDL), как показано на Фиг.1. Тестируемое соединение А представляет собой соединение 4 из Таблицы 1. В то же время, для тестируемого соединения В, анализируемого при концентрации 30 мкМ, характерно только частичное подавление сборки при очень высоких концетрациях (Фиг.1). Другие примеры соединений с молекулярной массой менее 1000, обладающих необходимой активностью, что установлено данным методом анализа, представлены в Таблице 1.

Пример 2. Сравнительный пример предполагаемого ингибитора сборки олигомеров Аβ_1-42 (ADDL)

С помощью вышеописанного метода анализа РПЭФ испытывают несколько соединений, разработанных изначально в качестве ингибиторов амилоидных фибрилл, на предмет подавления сборки мономера Аβ_1-42 в Аβ олигомеры. К тестируемым соединениям относятся Alzhemed™ (Neurochem), сцилло-инозит, также известный под названием AZD-103 (Ellipsis), SP-235 (Samaritan), бензофураны (GE), 9-акридиноны (Warner-Lambert), циклодекстрины (Универститет штата Иллинойс, Чикаго), RS-406 (Sankyo), клиохинол (Prana) и куркумин (UCLA/UCI). Используются стандартные для анализа РПЭФ условия, описанные в примере 1. Неспособность соединения Alzhemed™ подавлять сборку Аβ_1-42 мономера в Аβ олигомеры отображена на Фиг.2. Такие результаты характерны для всех соединений, перечисленных выше, которые изначально разрабатывались в качестве ингибиторов амилоидных фибрилл.

Пример 3. Модель на основе крысы, осуществляющей поочередные нажатия на рычаги по циклической последовательности

Препараты Аβ_1-42 олигомеров (ADDL) и потенциального терапевтического соединения испытывают на модели крысы с БА, осуществляющей поочередные нажатия на рычаги по циклической последовательности (ALCR), с целью оценки in vivo эффективности. С помощью этой восприимчивой модели возможно обнаружение когнитивных расстройств при прямой инъекции Аβ олигомеров клеточного происхождения в головной мозг крысы. Таким способом можно протестировать прямую инъекцию ADDL, состоящую из синтетических Аβ_1-42 и предполагаемого терапевтического соединения, исследуемого по методике ALCR.

Было доказано, что тест на модели ALCR является намного более чувствительным, чем ранее опубликованные способы измерения воздействия лекарственного препарата на когнитивную функцию. При выполнении данной задачи крыс следует приучить к сложной последовательности запросов по нажатию на рычаг, при которых они получают пищевое подкрепление в экспериментальной камере с двумя рычагами. Субъекты должны производить нажатия на два рычага поочередно, причем переключение на второй рычаг должно осуществляться только после достаточного нажатия на первый рычаг, за которое они получают пищевое вознаграждение. Замену пищи проводят после определенного числа нажатий, которое вначале повышается от 2 до 56 откликов за одну питательную таблетку, а потом обратно уменьшается до 2 откликов за одну питательную таблетку. Промежуточные значения рассчитывают по квадратичной функции х² - х. Один цикл представляет собой общую последовательность возрастания и уменьшения количества запросов по нажатию на рычаг (например, 2, 6, 12, 20, 30, 42, 56, 56, 42, 30, 20, 12, 6 и 2 нажатий за одно пищевое вознаграждение). За один дневной сеанс проводится шесть полных циклов подобного типа. Ведут подсчет ошибок, к которым относятся те случаи, когда субъект упорно продолжает нажимать на рычаг после первоначального нажатия, достаточного для получения пищевого вознаграждения, т.е. он не переходит на другой рычаг (персеверативная ошибка), или когда субъект переходит от одного рычага к другому до полного выполнения запроса по нажатию на первый рычаг (ошибка перехода).

Материалы и способы

Синтетический порошок Аβ_1-42 растворяют в 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропаноле (ГФИП), получая раствор Аβ_1-42 в ГФИП с концентрацией около 1 мМ, который выдерживают при температуре окружающей среды в течение 1 ч. Полученный раствор охлаждают на ледяной бане в течение 5-10 минут, а затем отбирают алликвоты в пробирки Эппендорфа в количестве по 50 мкл раствора на одну пробирку. Затем пробирки помещают в химический вытяжной шкаф и оставляют отстаиваться на ночь для того, чтобы дать возможность ГФИП испариться под слабым током азота. Для удаления оставшихся следов ГФИП пробирки вакуумируют при комнатной температуре и давлении 15-25 мм рт.ст. за два быстрых цикла продолжительностью 15 мин. Получающиеся в результате пленки мономерного Аβ_1-42 пептида хранят над осушителем при -80°С до использования.

Пробирку с мономерным Аβ_1-42 пептидом нагревают до комнатной температуры и растворяют Аβ_1-42 в безводном ДМСО, получая маточный раствор Аβ_1-42 пептида в ДМСО с концентрацией от 10 до 100 мкМ. К 998 мкл невральной базальной среды (без красителя фенолового красного, Gibco 12348-017) добавляют 2 мкл 20 мМ маточного раствора тестируемого соединения в безводном ДМСО, получая, таким образом, 40 мМ раствор тестируемого соединения в невральной базальной среде.

При проведении лечения только Аβ_1-42 пептидом маточный раствор пептида в ДМСО добавляют при температуре 37°С к невральной базальной среде, доводя концентрацию Аβ_1-42 пептидного мономера до требуемого значения, при условии, что максимальная концентрация в ДМСО составляет 1% или менее, затем содержимое пробирки перемешивают на вортексе в течение 30-60 секунд, после чего за короткое время замедляют вращение в микроцентрифуге и выдерживают раствор при 37°С в течение 15 минут перед началом введения инъекций.

При проведения лечения Аβ_1-42 пептидом и тестируемым соединением маточный раствор пептида в ДМСО добавляют при 37°С к раствору соединения в невральной базальной среде, доводя концентрацию Аβ_1-42 пептидного мономера до требуемого значения, при условии что максимальная концентрация в ДМСО составляет 1% или менее, затем содержимое пробирки перемешивают на вортексе в течение 30-36 секунд, после чего за короткое время замедляют вращение в микроцентрифуге и выдерживают раствор при 37°С в течение 15 минут перед началом введения инъекций.

При инъекции контроля раствор соединения в невральной базальной среде выдерживают при 37°С в течение 15 мин перед началом введения инъекций.

Крысы: Крыс обычают процедуре ALCR до тех пор, пока частота появления ошибок не станет постоянной. После перехода крыс к конечной продедуре ALCR проводят ежедневные обучающие занятия до окончания исследования.

Хирургия: Всем крысам вводят одиночную канюлю 28 размера, фиксируя ее на черепе и направляя в область бокового желудочка. Половине крыс канюлю вводят в область правого желудочка, а другой половине - в область левого желудочка. Крысам дают 5 дней на восстановление от хирургической операции, после чего возобновляют тренировку.

Инъекция тестируемого вещества и испытание ALCR: Испытание проводят во время каждого пятого дня. Животным вводят 20 мкл инъекцию контроля, пептида или раствора пептида вместе с раствором соединения через имплатнированную канюлю на протяжении 3-4 минут. Животных исследуют примерно через 3 часа после ввода инъекции.

Анализ частоты появления ошибок: Все частоты появления ошибок сопоставляют с базисной линией для частоты ошибок, состоящей, по меньшей мере, из 3-дневного периода отсутствия лечения, который по времени следует сразу после инъекции. При анализе эффектов используют критерий Стьюдента для статистического вывода.

Предполагаемые результаты

Предполагается, что значительное увеличение частоты появления персеверативных ошибок будет проявляться в интервале между базовой частотой появления ошибок и частотой появления ошибок, возникающих под воздействием олигомерных Аβ_1-42 (ADDL). Также предполагается, что отдельное добавление одного или нескольких соединений, описанных в этом документе, не приведет к повышению частоты появления ошибок, тогда как при добавлении их вместе с олигомерными Аβ_1-42 (ADDL) будет исключение увеличение персеверативных ошибок. Таким образом, предполагается, что ошибки, возникающие из-за олигомерных Аβ_1-42 (ADDL), будут устранены за счет, по меньшей мере, одного или нескольких соединений, описанных в данном документе.

При прочтении вышеизложенного описания специалистам в данной области техники будут очевидны разлиные модификации и изменения, которые можно осуществить над композициями или в способах изобретения. Подразумевается, что все подобные модификации, попадающие в пределы объема прилагаемой формулы, включаются в данное изобретение.

Claims (25)

1. Способ противодействия образованию нейротоксичных белков ADDL из мономерных пептидов Аβ_1-42, включающий контактирование мономерного Аβ_1-42 с практически чистым непептидным соединением, которое выбрано из группы соединений, включающей:
(Z)-N-(2-метокси-фенил)-2-оксо-2-{N′-[3-оксо-3-тиофен-2-ил-1-трифторметил-пропилиден]-гидразино}-ацетамид,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидрокси-3-метокси-фенил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксинафталин-1-ил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксифенил)-метилиден-гидразино-оксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
2-(5-гидрокси-3-изобутил-5-(трифторметил)-4,5-дигидро-1Н-пиразол-1-ил)-N-(2-метоксифенил)-2-оксоацетамид и
(Е)-2-гидрокси-N′-((1-гидроксинафталин-2-ил)метилен)бензогидразид.

2. Способ по п.1, в котором указанное соединение подавляет образование нейротоксичных белков ADDL с IC₅₀, составляющим, по большей мере, около 2 мкМ.

3. Способ подавления, регуляции и/или модуляции нейрональной дисфункции или нейротоксичности, вызванной белками ADDL, в нервных клетках или нервной ткани за счет подавления образования белков ADDL, включающий взаимодействие мономерных пептидов Аβ_1-42, которые могут иметься при наличии нервных клеток, с эффективным количеством практически чистого непептидного соединения, которое выбрано из группы соединений, включающей:
(Z)-N-(2-метокси-фенил)-2-оксо-2-{N′-[3-оксо-3-тиофен-2-ил-1-трифторметил-пропилиден]-гидразино}-ацетамид,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидрокси-3-метокси-фенил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксинафталин-1-ил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксифенил)-метилиден-гидразино-оксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
2-(5-гидрокси-3-изобутил-5-(трифторметил)-4,5-дигидро-1Н-пиразол-1-ил)-N-(2-метоксифенил)-2-оксоацетамид и
(Е)-2-гидрокси-N′-((1-гидроксинафталин-2-ил)метилен)бензогидразид.

4. Способ по п.3, в котором указанное соединение подавляет образование нейротоксичных белков ADDL с IC₅₀, составляющим, по большей мере, около 2 мкМ.

5. Способ противодействия образованию нейротоксичных белков ADDL из мономерных пептидов Аβ_1-42, включающий контактирование мономерного Аβ_1-42 с эффективным количеством соединения, охватываемого структурной формулой А

где R представляет собой фенил или гетероарил, содержащий серу, каждый из которых замещен в положение 2 заместителем, выбранным из группы, включающей гидрокси, метокси, и -С(О)О-С₁-С₂-алкил,
R₁ представляет собой водород или трифторметил,
R₂ представляет собой гетероарил, содержащий серу, или С₆-С₁₀арил, где указанный арил необязательно замещен 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей, включающей гидрокси и метокси,
L представляет собой ковалентную связь или -NHC(O)-, и
L′ представляет собой ковалентную связь или -СН₂С(О).

6. Способ противодействия образованию нейротоксичных белков ADDL из мономерных пептидов Аβ_1-42, включающий контактирование мономерного Aβ_1-42 с эффективным количеством соединения, охватываемым структурной формулой А

где R представляет собой фенил или 4,5,6,7-тетрагидробензотиазол, каждый из которых замещен в положение 2 заместителем, выбранным из группы, включающей гидрокси, метокси, и -С(О)О-С₁-С₂-алкил, и где указанный 4,5,6,7-тетрагидробензотиазол замещен метилом в положение 7,
R₁ представляет собой водород или трифторметил,
R₂ представляет собой гетероарил, содержащий серу, или С₆-С₁₀арил, где указанный арил необязательно замещен 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей, включающей гидрокси и метокси,
L представляет собой ковалентную связь или -NHC(O)-, и
L′ представляет собой ковалентную связь или -СН₂С(О).

7. Композиция для противодействия образованию нейротоксичных белков ADDL из мономерного пептида Аβ_1-42, которая содержит эффективное количество практически чистого непептидного соединения, которое выбрано из группы соединений, включающей:
(Z)-N-(2-метокси-фенил)-2-оксо-2-{N′-[3-оксо-3-тиофен-2-ил-1-трифторметил-пропилиден]-гидразино}-ацетамид,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидрокси-3-метокси-фенил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксинафталин-1-ил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксифенил)-метилиден-гидразино-оксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
2-(5-гидрокси-3-изобутил-5-(трифторметил)-4,5-дигидро-1Н-пиразол-1-ил)-N-(2-метоксифенил)-2-оксоацетамид и
(Е)-2-гидрокси-N′-((1-гидроксинафталин-2-ил)метилен)бензогидразид.

8. Композиция по п.7, в которой указанное соединение подавляет образование нейротоксичных белков ADDL с IC₅₀, составляющим, по большей мере, около 2 мкМ.

9. Композиция по п.7, в которой практически чистое непептидное соединение вводят в количестве от 0,05 до 1000 мг, по меньшей мере, один раз в день.

10. Композиция по п.7, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель.

11. Композиция по п.7, в которой белки ADDL ассоциированы с нерастворимыми амилоидными фибриллами, сенильными бляшками или клубками.

12. Композиция по п.7, в которой белки ADDL ассоциированы с болезнью, выбранной из группы болезней, включающей болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, инсульт и умеренное когнитивное нарушение.

13. Композиция по п.7, в которой белки ADDL ассоциированы с болезнью, выбранной из группы болезней, включающей очаговую ишемию, связанную со слабоумием, и нейрональную дистрофию.

14. Композиция по п.7, в которой белки ADDL являются ассоциированы со сверхэкспрессией амилоидного β1-42 белка.

15. Композиция для подавления, регуляции или модуляции нейрональной дисфункции или нейротоксичности, вызванной белками ADDL, в нервных клетках путем подавления образования белков ADDL, содержащая эффективное количество практически чистого непептидного соединения, которое выбрано из группы соединений, включающей:
(Z)-N-(2-метокси-фенил)-2-оксо-2-{N′-[3-оксо-3-тиофен-2-ил-1-трифторметил-пропилиден]-гидразино}-ацетамид,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидрокси-3-метокси-фенил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксинафталин-1-ил)-метилиден-гидразинооксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
этиловый эфир (Е)-2-{[1-(2-гидроксифенил)-метилиден-гидразино-оксалил]-амино}-6-метил-4,5,6,7-тетрагидро-бензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты,
2-(5-гидрокси-3-изобутил-5-(трифторметил)-4,5-дигидро-1Н-пиразол-1-ил)-N-(2-метоксифенил)-2-оксоацетамид и
(Е)-2-гидрокси-N′-((1-гидроксинафталин-2-ил)метилен)бензогидразид.

16. Композиция по п.15, в которой указанное соединение подавляет образование нейротоксичных белков ADDL, со значением IC₅₀, по большей мере, около 2 мкМ.

17. Композиция по п.15, в которой практически чистое непептидное соединение вводят в количестве от 0,05 до 1000 мг один или несколько раз за день.

18. Композиция по п. 15, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель.

19. Композиция по п.15, в которой белки ADDL, если они вообще имеются, ассоциированы с нерастворимыми амилоидными фибриллами, сенильными бляшками или клубками.

20. Композиция по п.15, в которой белки ADDL, если они вообще имеются, ассоциированы с болезнью, выбранной из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, синдрома Дауна, инсульта и умеренных когнитивных нарушений.

21. Композиция по п.15, в которой белки ADDL, если они вообще имеются, ассоциированы с болезнью, выбранной из группы, состоящей из очаговой ишемии, связанной со слабоумием, и нейрональной дистрофии.

22. Композиция по п.15, в которой белки ADDL, если они вообще имеются, ассоциированы со сверхэкспрессией амилоидного β1-42 белка.

23. Композиция по п.15, в которой указанные нервные клетки выделяют из мозговой ткани животного и выращивают в тканевой культуре.

24. Композиция для противодействия образованию нейротоксичных белков ADDL из мономерного пептида Aβ_1-42, которая содержит эффективное количество практически чистого непептидного соединения, охватываемого структурной формулой А

где R представляет собой фенил или гетероарил, содержащий серу, каждый из которых замещен в положение 2 заместителем, выбранным из группы, включающей гидрокси, метокси, и -С(О)О-С₁-С₂-алкил,
R₁ представляет собой водород или трифторметил,
R₂ представляет собой гетероарил, содержащий серу, или С₆-С₁₀арил, где указанный арил необязательно замещен 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей, включающей гидрокси и метокси,
L представляет собой ковалентную связь или -NHC(O)-, и
L′ представляет собой ковалентную связь или -СН₂С(О).

25. Композиция для противодействия образованию нейротоксичных белков ADDL из мономерного пептида Aβ_1-42, которая содержит эффективное количество практически чистого непептидного соединения, охватываемого структурной формулой А

где R представляет собой фенил или 4,5,6,7-тетрагидробензотиазол, каждый из которых замещен в положение 2 заместителем, выбранным из группы, включающей гидрокси, метокси, и -С(О)О-С₁-С₂-алкил, и где указанный 4,5,6,7-тетрагидробензотиазол замещен метилом в положение 7,
R₁ представляет собой водород или трифторметил,
R₂ представляет собой гетероарил, содержащий серу, или С₆-С₁₀арил, где указанный арил необязательно замещен 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей, включающей гидрокси и метокси,
L представляет собой ковалентную связь или -NHC(O)-, и
L′ представляет собой ковалентную связь или -СН₂С(О).

Images