RU2422508C1

RU2422508C1 - Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom FUNGUS STRAIN - SHERININE PRODUCER

Info

Publication number: RU2422508C1
Application number: RU2010127061/10A
Authority: RU
Inventors: Михаил Викторович Пивкин (RU); Михаил Викторович Пивкин; Юлия Владимировна Худякова (RU); Юлия Владимировна Худякова; Ольга Федоровна Сметанина (RU); Ольга Федоровна Сметанина; Татьяна Алексеевна Кузнецова (RU); Татьяна Алексеевна Кузнецова
Priority date: 2010-07-01
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2011-06-27

Abstract

FIELD: medicine. ^ SUBSTANCE: Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom fungus strain is recovered from sea ground collected at depth 11 m of Amur Bay of the Sea of Japan; and it is deposited in the Russian National Collection of Microorganisms of G.K.Skryabin Institute of Microbial Biochemistry and Physiology of the Russian Academy of Sciences, registration No. VKM F-4116D. The strain is cultivated with using a nutrient medium not containing sugars. Total yield of sherinines is 55 mg/l of the nutrient medium made of liquid wort and sea water, and 36.5 g in 1 kg of the nutrient medium containing millet. ^ EFFECT: strain is characterised by high-efficiency sherinines exhibiting anticancer activity. ^ 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма гриба - продуцента шерининов D, Е и F, обладающих противораковой активностью.The invention relates to biotechnology and relates to a new strain of the fungus - producer of sherinins D, E and F, with anticancer activity.

Известен штамм Penicillium sp., продуцирующий шеринины А, В, С [Belofsky G.N., Gloer J.B., Wicklow D.T., Dowd J.B. Antiinsectan alkaloids: sherinines A-С and a new paxilline derivative from the ascomata of Eupenicillium shearii. II Tetrahedron. 1995. Vol.51. N 14. P.3959-3968]. Недостатком известного штамма является низкий выход целевого продукта.A known strain of Penicillium sp. Producing sherinins A, B, C [Belofsky G.N., Gloer J.B., Wicklow D.T., Dowd J.B. Antiinsectan alkaloids: sherinines A-C and a new paxilline derivative from the ascomata of Eupenicillium shearii. II Tetrahedron. 1995. Vol. 51. N 14. P.3959-3968]. A disadvantage of the known strain is the low yield of the target product.

В качестве прототипа выбран известный продуцент шерининов D - К, обладающих блокирующей активностью кальций активируемых калиевых каналов, штамм гриба Penicillium sp. (strain HKI0459), поскольку этот штамм, как и заявляемый штамм, получают в культуре [Xu М., Gessner G., Groth I., Lange С., Christner А., В. Torsten, e Deng Z., Li X., Heinemann S.H., Grabley S., Bringmann G., Sattlerb I.,* and Lina W. Shearinines D-K, new indole triterpenoids from an endophytic Penicillium sp. (strain HKI0459) with blocking activity on large-conductance calcium-activated potassium channels. // Tetrahedron. 2007. V.63. P.435-444]. К недостаткам известного штамма можно отнести его низкую продуктивность в отношении биологически активных веществ - 0,123 мг/л среды.As a prototype, a well-known producer of sherinins D - K, with a blocking activity of calcium activated potassium channels, a strain of the fungus Penicillium sp. (strain HKI0459), since this strain, like the claimed strain, is obtained in culture [Xu M., Gessner G., Groth I., Lange C., Christner A., B. Torsten, e Deng Z., Li X. , Heinemann SH, Grabley S., Bringmann G., Sattlerb I., * and Lina W. Shearinines DK, new indole triterpenoids from an endophytic Penicillium sp. (strain HKI0459) with blocking activity on large-conductance calcium-activated potassium channels. // Tetrahedron. 2007. V.63. P.435-444]. The disadvantages of the known strain include its low productivity in relation to biologically active substances - 0.123 mg / l of the medium.

В связи с тем, что шеринины, относящиеся к группе индольных алкалоидов, обладают противораковой активностью, и поэтому представляют значительный интерес, как перспективные противораковые препараты, ставится задача получения продукта с более высоким выходом.Due to the fact that sherinins, belonging to the group of indole alkaloids, have anticancer activity, and therefore are of considerable interest as promising anticancer drugs, the task is to obtain a product with a higher yield.

Поставленная задача решена выявлением нового штамма гриба Penicillium simplicissimum, продуцирующего шеринины, обладающие противораковой активностью.The problem is solved by identifying a new strain of the fungus Penicillium simplicissimum producing sherinins with anticancer activity.

Штамм Penicillium simplicissimum выделен из морского грунта, собранного на глубине 11 м Амурского залива (Японское море), и хранится в Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) Учреждения Российской академии наук Тихоокеанский института биоорганической химии ДВО РАН под номером 4635.The Penicillium simplicissimum strain was isolated from sea soil collected at a depth of 11 m of the Amur Bay (Sea of Japan) and is stored in the Collection of Marine Microorganisms (CMM) of the Institution of the Russian Academy of Sciences, Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences under number 4635.

Штамм Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ F-4116D.The strain Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom is deposited with the All-Russian Collection of Microorganisms IBPM named after G.K.Skryabin RAS under registration number VKM F-4116D.

Штамм характеризуется следующими свойствами.The strain is characterized by the following properties.

Культуральные и морфологические признаки.Cultural and morphological characters.

Колонии, выращенные на среде Чапека, 5-7 см в диаметре, слегка войлочные, морщинистые в центре, по краю радиально-складчатые, с широким растущим краем, сначала белые, затем оранжево-красные, в конидиальной зоне зеленовато-серые; экссудат в мелких каплях, оранжевый или красный. Обратная сторона колонии оранжево-красная. Конидиеносцы поднимаются от субстрата 400-500×3,5 мкм, или от воздушных гиф 10-15×2-2,5 мкм, фиалиды 8-10×2 мкм, с длинной конидиогенной шейкой. Конидии эллипсоидные, шероховатые, 3-3,5 мкм длинной, в расходящихся или спутанных цепочках.Colonies grown on the Chapek medium, 5-7 cm in diameter, slightly felt, wrinkled in the center, radially folded along the edge, with a wide growing edge, first white, then orange-red, greenish-gray in the conidial zone; exudate in small drops, orange or red. The reverse side of the colony is orange-red. Conidiophores rise from a substrate of 400-500 × 3.5 microns, or from air hyphae 10-15 × 2-2.5 microns, phialids 8-10 × 2 microns, with a long conidiogenic neck. Conidia are ellipsoidal, rough, 3-3.5 microns long, in diverging or tangled chains.

Колонии гриба при выращивании на среде «сусло-агар на натуральной морской воде» серые, зеленовато-серые. Реверзум не окрашенный или оранжевый. Микроскопические признаки те же, что и на среде Чапека.The fungal colonies grown on the "must-agar in natural sea water" medium are gray, greenish-gray. Reverse is not colored or orange. Microscopic signs are the same as on the Chapek medium.

Физиолого-биохимические признаки.Physiological and biochemical characteristics.

Штамм хорошо растет и образует конидии как на агаризованных средах (картофельно-сахарозный (глюкозный), приготовленной на натуральной морской воде агар, агар Чапека), так и на жидких средах того же состава (в стационарной культуре и на качалке). На среде Чапека максимальный рост отмечен на среде с мальтозой, на втором месте по усвояемости находятся сахароза и глюкоза. Из источников азота лучше всего усваиваются нитрат натрия и пептон. Среди источников углерода наибольшая интенсивность конидиобразования (1,6-2,8×10⁵ конидий/см²) отмечена на средах с мальтозой сахарозой и глюкозой (таблица).The strain grows well and forms conidia both on agarized media (potato-sucrose (glucose) prepared on natural seawater agar, Chapek agar), and on liquid media of the same composition (in stationary culture and on a rocking chair). On Chapek’s environment, maximum growth was noted on maltose-containing medium, followed by sucrose and glucose in the second digestibility. Sodium nitrate and peptone are best absorbed from nitrogen sources. Among carbon sources, the highest intensity of conid formation (1.6–2.8 × 10 ⁵ conidia / cm ² ) was noted on media with maltose sucrose and glucose (table).

Штамм хранится на картофельно-морковной среде (20 г картофеля, 20 г моркови, 1 л натуральной морской воды, 10 г агар-агара) под минеральным маслом [Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник - М.: Агропромиздат, 1990. - 240 с.]. Время пересева - раз в три года.The strain is stored in a potato-carrot medium (20 g of potatoes, 20 g of carrots, 1 l of natural sea water, 10 g of agar-agar) under mineral oil [S. Semenov Laboratory media for actinomycetes and fungi. Handbook - M .: Agropromizdat, 1990. - 240 p.]. Reseeding time - once every three years.

Новый штамм продуцирует суммарное количество шерининов, обладающих противораковой активностью, с выходом 55±2,4 мг/л питательной среды «жидкое сусло на морской воде» и 36,5±0,12 г на 1 кг питательной «просяной» среды.The new strain produces the total amount of sherinins with anticancer activity, with a yield of 55 ± 2.4 mg / l of nutrient medium “liquid wort on seawater” and 36.5 ± 0.12 g per 1 kg of nutrient millet environment.

Технический результат штамма гриба Penicillium simplicissimum ВКМ F-4116D заключается в его более высокой продуктивности. Продуктивность этого штамма в десять раз превосходит продуктивность известного грибного штамма. Кроме того, преимуществом заявляемого штамма по сравнению с прототипом является то, что для его выращивания требуется среда с меньшим числом компонентов и, что особенно важно, не включает в себя сахаров. Затраты на сахара составляют основную статью расходов на выращивание культур в промышленных масштабах. Таким образом, производство штамма гриба Penicillium simplicissimum ВКМ F-4116D с экономической точки зрения более выгодно по сравнению с производством штамма-прототипа.The technical result of the strain of the fungus Penicillium simplicissimum VKM F-4116D is its higher productivity. The productivity of this strain is ten times higher than the productivity of the known mushroom strain. In addition, the advantage of the claimed strain compared with the prototype is that for its growth requires an environment with fewer components and, most importantly, does not include sugars. The cost of sugar is the main cost item for growing crops on an industrial scale. Thus, the production of the strain of the fungus Penicillium simplicissimum VKM F-4116D from an economic point of view is more profitable in comparison with the production of the strain of the prototype.

Новый штамм может использоваться для промышленного получения шерининов, обладающих противораковой активностью.The new strain can be used for the industrial production of sherinins with anticancer activity.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Штамм Penicillium simplicissimum ВКМ F-4116D выращивают методом глубинного культивирования на питательной среде «жидкое сусло на морской воде» следующего состава: сусло пивное неохмеленное, разбавленное натуральной морской водой до 4 градусов по Баллингу (в трипликате) (pH 7,8-8,2). Культивирование осуществляют при 22°С в колбах на качалке 180-200 об/мин в течение 168 часов.Example 1. The strain Penicillium simplicissimum VKM F-4116D is grown by the method of deep cultivation in a nutrient medium "liquid wort on seawater" of the following composition: unsweetened beer wort diluted with natural seawater to 4 degrees Balling (in triplicate) (pH 7.8- 8.2). Cultivation is carried out at 22 ° C in flasks on a rocking chair 180-200 rpm for 168 hours.

Мицелий с культуральной жидкостью экстрагируют 24 часа этилацетатом. После выпаривания проводят делипидизацию путем приготовления эмульсии в системе вода-этанол (4:1) и последующей переэкстракцией 1:1 последовательно гексаном, затем хлороформом. Хлороформенный экстракт выпаривают и очищают на колонке с силикагелем в градиенте гексан - этилацетат 100:0; 95:5; 90:10; 87:13; 85:15; 80:20. Фракции 2, 4, 5 и 7 содержат шеринины. Суммарный выход шерининов после выпаривания составляет 55 мг/л среды.The mycelium with the culture fluid is extracted 24 hours with ethyl acetate. After evaporation, delipidization is carried out by preparing an emulsion in a water-ethanol system (4: 1) and subsequent re-extraction of 1: 1 sequentially with hexane, then chloroform. The chloroform extract is evaporated and purified on a column of silica gel in a gradient of hexane - ethyl acetate 100: 0; 95: 5; 90:10; 87:13; 85:15; 80:20. Fractions 2, 4, 5, and 7 contain sherinins. The total yield of sherinins after evaporation is 55 mg / l of medium.

Пример 2. Штамм Penicillium simplicissimum ВКМ F-4116D выращивают методом твердофазного культивирования в течение трех недель при температуре 30°С на «просяной» питательной среде следующего состава: пшено 1 кг, натрий виннокислый 0,067 г, КН2Р04 0,067 г, MgSO₄×7H₂O 0,067 г, FeSO₄×7H₂O 0,007 г, натуральная морская вода 134 мл. Выделение шерининов проводят описанным в примере 1 способом. Суммарный выход шерининов составляет 36,5±0,12 г на 1 кг среды.Example 2. The strain Penicillium simplicissimum VKM F-4116D is grown by solid-phase cultivation for three weeks at a temperature of 30 ° C on a millet nutrient medium of the following composition: millet 1 kg, sodium tartrate 0.067 g, KH2P04 0.067 g, MgSO ₄ × 7H ₂ O 0.067 g, FeSO ₄ × 7H ₂ O 0.007 g, natural sea water 134 ml. Isolation of sherinins is carried out as described in example 1. The total yield of sherinins is 36.5 ± 0.12 g per 1 kg of medium.

Полученные шеринины были исследованы на противораковую активность. Шеринины A, D и Е индуцировали апоптоз клеток лейкемии линии HL-60 в концентрации 100 µM на 10%, 39% и 34% соответственно.The resulting sherinins were tested for anticancer activity. Sherinins A, D, and E induced apoptosis of HL-60 leukemia cells at a concentration of 100 μM at 10%, 39%, and 34%, respectively.

Claims

The fungus strain Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom BKM F-4116D is a producer of sherinins.