RU2256701C1 - Strain of fungus aspergillus fumigatus as producer of indole alkaloids and method for their preparing - Google Patents
Strain of fungus aspergillus fumigatus as producer of indole alkaloids and method for their preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2256701C1 RU2256701C1 RU2003136115/13A RU2003136115A RU2256701C1 RU 2256701 C1 RU2256701 C1 RU 2256701C1 RU 2003136115/13 A RU2003136115/13 A RU 2003136115/13A RU 2003136115 A RU2003136115 A RU 2003136115A RU 2256701 C1 RU2256701 C1 RU 2256701C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- indole alkaloids
- aspergillus fumigatus
- medium
- producer
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения индольных алкалоидов, обладающих противоопухолевой активностью.The invention relates to biotechnology and can be used to obtain indole alkaloids with antitumor activity.
Известно, что микроскопические грибы рода Aspergillus являются продуцентами ряда биологически активных веществ, в том числе, органических кислот, ферментов, белковых и полисахаридных антигенов, антибиотиков.It is known that microscopic fungi of the genus Aspergillus are producers of a number of biologically active substances, including organic acids, enzymes, protein and polysaccharide antigens, and antibiotics.
Среди грибов вида Aspergillus fumigatus известны и продуценты индольных алкалоидов.Among the fungi of the species Aspergillus fumigatus, the producers of indole alkaloids are also known.
Так известно, что штамм гриба Aspergillus fumigatus DSM 790, выделенный из почвы, является продуцентом 12, 13-дигидро-фумитреморгина С. Получение 12,13-дигидро-фумитреморгина С предусматривает предварительное выращивание продуцента на среде следующего состава: 1% глюкоза, 1% пептон, 2% экстракт мальтозы и 0,3% дрожжевой экстракт. Культивирование проводится в течение 48 часов при 27° С и скорости перемешивания 100 об/мин. Полученный мицелий отфильтровывается, дважды промывается Трис -буфером (0,05 М, рН 7,0) и снова суспендируется в 200 мл того же буфера, содержащего 0,5% глюкозы. После 10 дней культивирования мицелий отделяется фильтрованием, мицелий и культуральный фильтрат трижды экстрагируются этилацетатом. Экстракт упаривается, а остаток наносится на RP-8 колонку в системе Н2O-МеОН, 30:70. Выход 12,13-дигидро-фумитреморгина С составляет всего 1,5 мг/л [Arfmann, H. - A. 12,13-dihydroxy-fumitremorgin С from Aspergillus fumigatus. Phytochemistry 1990, 29, 1025-1026].It is well known that a strain of the fungus Aspergillus fumigatus DSM 790 isolated from the soil is a producer of 12,13-dihydro-fumitremorgin C. The preparation of 12,13-dihydro-fumitremorgin C involves pre-growing the producer on a medium of the following composition: 1% glucose, 1% peptone, 2% maltose extract and 0.3% yeast extract. Cultivation is carried out for 48 hours at 27 ° C and a stirring speed of 100 rpm. The resulting mycelium is filtered off, washed twice with Tris buffer (0.05 M, pH 7.0) and again suspended in 200 ml of the same buffer containing 0.5% glucose. After 10 days of cultivation, the mycelium is separated by filtration, the mycelium and the culture filtrate are extracted three times with ethyl acetate. The extract was evaporated, and the residue was applied to an RP-8 column in a H 2 O-MeOH system, 30:70. The yield of 12,13-dihydro-fumitremorgin C is only 1.5 mg / L [Arfmann, H. - A. 12,13-dihydroxy-fumitremorgin C from Aspergillus fumigatus. Phytochemistry 1990, 29, 1025-1026].
Недостатками известного штамма гриба и способа получения является низкий выход целевого продукта.The disadvantages of the known strain of the fungus and the production method is the low yield of the target product.
Наиболее близкими к заявляемым штамму и способу получения индольных алкалоидов является штамм гриба Aspergillus fumigatus BM 939, выделенный из морских донных осадков Японского моря с глубины 760 м, продуцирующий циклопростатины А, В, С и D и способ их получения. Для получения этих алкалоидов предусматривается культивирование микроскопического гриба при 28° С в течение 28 часов методом глубинного культивирования на среде следующего состава: глюкоза 3%, растворимый крахмал 2%, соевая мука 2%, К2НРO4 0,5% и MgSO4· 7H2O 0,05, с непрерывным перемешиванием при 350 об/мин, и аэрацией 200 л/мин, и последующее извлечение продукта из культуральной жидкости. Для этого мицелий отделяется фильтрованием, экстрагируется 90%-ным водным ацетоном, экстракт упаривается до водного раствора. Водный раствор и культуральный фильтрат экстрагируются этилацетатом, а объединенный экстракт упаривается до маслообразного остатка. Остаток дважды распределяется между хлороформом и гексаном, а хлороформный экстракт очищается на колонке с силикагелем. Выделенные алкалоиды разделяются методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонках CAPCELL РАК С-18. Выход циклопростатина А - 2,5 мкг/л культуральной жидкости, циклопростатина В - 11 мкг/л, выходы циклопростатинов С и D незначительны [Cui, C.-B., Kakeya, H., Osada, H. Novel Mammalian Cell Cycle Inhibitors, Cycloprostatins A-D, Produced by Aspergillus fumigatus, Which Inhibit Mammalian Cell Cycle at G2/M Phase. Tetrahedron 1997, 53, 59-72].Closest to the claimed strain and method for producing indole alkaloids is a strain of the fungus Aspergillus fumigatus BM 939, isolated from marine bottom sediments of the Sea of Japan from a depth of 760 m, producing cycloprostatins A, B, C and D and a method for their preparation. To obtain these alkaloids, it is envisaged to cultivate a microscopic fungus at 28 ° C for 28 hours by the method of deep cultivation on a medium of the following composition: glucose 3%, soluble starch 2%, soy flour 2%, K 2 HPO 4 0.5% and MgSO 4 · 7H 2 O 0.05, with continuous stirring at 350 rpm, and aeration of 200 l / min, and subsequent extraction of the product from the culture fluid. For this, the mycelium is separated by filtration, extracted with 90% aqueous acetone, the extract is evaporated to an aqueous solution. The aqueous solution and the culture filtrate are extracted with ethyl acetate, and the combined extract is evaporated to an oily residue. The residue is partitioned between chloroform and hexane twice, and the chloroform extract is purified on a silica gel column. The isolated alkaloids are separated by high performance liquid chromatography (HPLC) on CAPCELL PAK S-18 columns. The output of cycloprostatin A is 2.5 μg / l of culture fluid, cycloprostatin B is 11 μg / l, the yields of cycloprostatin C and D are negligible [Cui, C.-B., Kakeya, H., Osada, H. Novel Mammalian Cell Cycle Inhibitors , Cycloprostatins AD, Produced by Aspergillus fumigatus, Which Inhibit Mammalian Cell Cycle at G2 / M Phase. Tetrahedron 1997, 53, 59-72].
Известный штамм Aspergillus fumigatus BM 939 также при определенных условиях культивирования продуцирует 12,13-дигидро-фумитреморгин С. Для этого культивирование осуществляется в ферментере (30 л), содержащем 18 литров культуральной жидкости, на среде следующего состава: глюкоза 3%, растворимый крахмал 2%, соевая мука 2%, К2НРO4 0,5%, MgSO4· 7H2O 0,05. Культивирование проводится при 28° С в течение 72 часов, при скорости перемешивания 350 об/мин, и скорости аэрации 7 л/мин. Извлечение продукта осуществляется также, как при получении циклопростатинов. Выход 12,13-дигидро-фумитреморгина С - 1,8 мг/л [Cui, C.-B., Kakeya, H., Okada, G., Onose, R., Osada, H. Novel Mammalian Cell Cycle Inhibitors, Tryptostatins А, В and Other Diketopiperazines Produced by Aspergillus fumigatus. J. Antibiotics 1996, 49, 527-533].The well-known Aspergillus fumigatus BM 939 strain also produces, under certain cultivation conditions, 12,13-dihydro-fumitremorgin C. For this, cultivation is carried out in a fermenter (30 L) containing 18 liters of culture liquid, on an medium of the following composition: glucose 3%, soluble starch 2 %, soy flour 2%, K 2 HPO 4 0.5%, MgSO 4 · 7H 2 O 0.05. Cultivation is carried out at 28 ° C for 72 hours, with a stirring speed of 350 rpm, and an aeration speed of 7 l / min. The extraction of the product is carried out as in the preparation of cycloprostatins. The yield of 12,13-dihydro-fumitremorgin C is 1.8 mg / L [Cui, C.-B., Kakeya, H., Okada, G., Onose, R., Osada, H. Novel Mammalian Cell Cycle Inhibitors, Tryptostatins A, B and Other Diketopiperazines Produced by Aspergillus fumigatus. J. Antibiotics 1996, 49, 527-533].
К недостаткам известного штамма Aspergillus fumigatus BM 939 можно отнести его низкую продуктивность в отношении индольных алкалоидов.The disadvantages of the known strain Aspergillus fumigatus BM 939 include its low productivity in relation to indole alkaloids.
Способ получения, предусматривающий культивирование штамма на жидкой питательной среде требует больших энергозатрат на перемешивание и аэрацию, так как выращивание продуцентов проводится методом глубинного культивирования. Последующее выделение и очистка целевых продуктов характеризуются длительностью и трудоемкостью, так как включают несколько стадий экстракции мицелия разными растворителями, и довольно сложный процесс очистки алкалоидов.The method of obtaining, involving the cultivation of the strain in a liquid nutrient medium requires large energy consumption for mixing and aeration, since the cultivation of the producers is carried out by the method of deep cultivation. Subsequent isolation and purification of the target products are characterized by duration and laboriousness, since they include several stages of extraction of mycelium with different solvents, and a rather complicated process of purification of alkaloids.
В связи с тем, что индольные алкалоиды такие, как циклопростатины А и В, 12,13-дигидрокси-фумитреморгин С, фумитреморгин С и веррукулоген, обладают противоопухолевой активностью и потому представляют значительный интерес как перспективные противораковые препараты, ставится задача получения продуктов с высоким выходом.Due to the fact that indole alkaloids such as cycloprostatins A and B, 12,13-dihydroxy-fumitremorgin C, fumitremorgin C and verruculogen have antitumor activity and therefore are of significant interest as promising anticancer drugs, the task is to obtain products with high yield .
Поставленная задача решена выявлением нового штамма гриба Aspergillus fumigatus, обладающего способностью продуцировать индольные алкалоиды, и разработкой нового способа получения индольных алкалоидов, предусматривающий культивирование продуцента на питательной среде, экстракцию мицелия и среды органическим растворителем и выделение целевых продуктов посредством их хроматографической очистки на силикагеле и разделения методом ВЭЖХ, в котором в качестве продуцента используют штамм гриба Aspergillus fumigatus KMM 4631, а культивирование осуществляют на твердой питательной среде.The problem is solved by identifying a new strain of the fungus Aspergillus fumigatus with the ability to produce indole alkaloids, and by developing a new method for producing indole alkaloids, which involves cultivating the producer on a nutrient medium, extracting mycelium and the medium with an organic solvent and isolating the target products by chromatographic purification on silica gel and separation by method HPLC, in which Aspergillus fumigatus KMM 4631 strain of fungus is used as producer, and cultivation is carried out on t Verdi nutrient medium.
В способе используют питательные среды RM или MM (Monaghan R.L, Can. J. Bot. 1995. V. 73. Supl. I.Sect. E-H. Р. 925-931), модифицированные авторами, в которых вместо пресной воды в качестве источника минеральных солей используют натуральную морскую воду. Эти среды авторы обозначили, как RMM или МММ. Питательная среда RMM характеризуется следующим составом: рис - 1,0 кг, натуральная морская вода - 2,0 л, дрожжевой экстракт - 1,0 г, натрий виннокислый - 0,5 г, KH2РО4 - 0,5 г. Питательная среда МММ характеризуется следующим составом: пшено - 1,5 кг, натуральная морская вода - 2,0 л, натрий виннокислый - 0,5 г, КН2РO4 - 0,1 г, MgSO4· 7H2O - 0,1 г, FeSO4· 7H2O - 0,01 г.The method uses nutrient media RM or MM (Monaghan RL, Can. J. Bot. 1995. V. 73. Supl. I. Sect. EH. P. 925-931), modified by the authors, in which instead of fresh water as a source mineral salts use natural sea water. The authors designated these media as RMM or MMM. The nutrient medium RMM is characterized by the following composition: rice - 1.0 kg, natural sea water - 2.0 l, yeast extract - 1.0 g, sodium tartrate - 0.5 g, KH 2 PO 4 - 0.5 g. Nutrient MMM medium is characterized by the following composition: millet - 1.5 kg, natural sea water - 2.0 l, sodium tartrate - 0.5 g, KH 2 PO 4 - 0.1 g, MgSO 4 · 7H 2 O - 0.1 g, FeSO 4 · 7H 2 O - 0.01 g.
Оптимум температуры при выращивании гриба на этих средах 20-22° С.The optimum temperature when growing the fungus on these media is 20-22 ° C.
Экстракцию мицелия и среды осуществляют смесью хлороформ-этанол 2:1. Разделение целевых продуктов осуществляют последовательно на силикагеле Силасорб Si (12 мкм, колонка 4× 250 мм, производитель фирма ELSICO, HPLC&LC COMPANY, г. Москва) и на обращенно-фазном силикагеле Диасфер-110-С18 (6 мкм, колонка 4,0× 250 мм, производитель АО БиоХимМакСТ, г. Москва).The extraction of mycelium and medium is carried out with a mixture of chloroform-ethanol 2: 1. The separation of the target products is carried out sequentially on silica gel Silabsorb Si (12 μm, column 4 × 250 mm, manufacturer ELSICO, HPLC & LC COMPANY, Moscow) and reverse phase silica gel Diasfer-110-C18 (6 μm, column 4.0 × 250 mm, manufacturer BioChemMakST JSC, Moscow).
Новый штамм Aspergillus fumigatus выделен из мягкого коралла Sinularia sp., собранного на глубине 52 м возле побережья острова Кунашир (Курильские острова).A new strain of Aspergillus fumigatus was isolated from the soft coral Sinularia sp., Collected at a depth of 52 m off the coast of Kunashir Island (Kuril Islands).
Штамм Aspergillus fumigatus хранится в Коллекции Морских Микроорганизмов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (КММ ТИБОХ) под №4631.The strain Aspergillus fumigatus is stored in the Collection of Marine Microorganisms of the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry FEB RAS (KMM TIBOKH) under No. 4631.
Штамм Aspergillus fumigatus KMM 4631 характеризуются следующими свойствами.The strain Aspergillus fumigatus KMM 4631 is characterized by the following properties.
Культуральные и морфологические признаки.Cultural and morphological characters.
На среде Чапека колонии 3,7-4,2 см в диаметре за две недели роста, широко распростертые, ровные, бархатистые, в центральной части войлочные, сначала белые, по мере формирования конидий становятся серо-зелеными, до серо-голубовато-зеленых в центре колоний. Конидиальные головки колонковидные, компактные, варьирующие в размерах от 40 до 400 мкм длины. Конидиеносцы отходят прямо от погруженных гиф или как очень короткие веточки воздушного мицелия, или как короткие, 300-400× 5-8 мкм, постепенно расширяющиеся к верхушке, с гладкой оболочкой зеленых оттенков, особенно интенсивных в верхней части. Апикальная часть конидиеносца бутылковидная, 20-30 мкм в диаметре. Стеригмы одноярусные, формируются только в центре апикальной части, занимая не более 2/3 ее поверхности, скученные, располагаются по оси, параллельной оси конидиеносца; 6-8× 2-4 мкм. Конидии шаровидные, 2,5-3 мкм, в массе темно-зеленые, гладкие или неясно шероховатые. Реверзум желтый, по мере старения культуры становится красно-коричневым.On Chapek’s environment, colonies are 3.7–4.2 cm in diameter over two weeks of growth, widely spread, even, velvety, felt in the central part, first white, with the formation of conidia they turn gray-green, to gray-bluish-green in the center of the colonies. Conidial heads are columnar, compact, varying in size from 40 to 400 microns in length. Conidiophores depart directly from submerged hyphae either as very short branches of aerial mycelium, or as short 300-400 × 5-8 microns, gradually expanding to the apex, with a smooth shell of green shades, especially intense in the upper part. The apical part of the conidiophore is bottle-shaped, 20-30 microns in diameter. Sterigms are single-tier, formed only in the center of the apical part, occupying no more than 2/3 of its surface, crowded, located on an axis parallel to the axis of the conidiophore; 6-8 × 2-4 microns. Conidia are spherical, 2.5-3 microns, dark green in mass, smooth or obscurely rough. Reversum is yellow; as the culture ages, it becomes red-brown.
На среде сусло-агар колонии 3,8-4,6 см в диаметре за две недели роста, широко распростертые, ровные, войлочные, до пушистых, сначала белые, по мере формирования конидий становятся серо-голубовато-зеленые. Микроскопические признаки такие же, как и при выращивании на среде Чапека. Реверзум неокрашенный.On the wort-agar medium, the colonies are 3.8-4.6 cm in diameter for two weeks of growth, widely spread, even, felt, up to fluffy, initially white, with the formation of conidia they become gray-blue-green. Microscopic signs are the same as when grown on Chapek's medium. The reverse is unpainted.
На среде картофельно-декстрозный агар колонии 3,2-4,0 см в диаметре за две недели роста, широко распростертые, ровные, бархатистые, сначала белые, по мере формирования конидий становятся темно серо-зелеными, до темно оливково-серых в центре колоний. Микроскопические признаки идентичны характеристикам штамма, выращенного на вышеназванных средах. Реверзум неокрашенный или желтый.On medium, potato-dextrose agar colonies are 3.2-4.0 cm in diameter in two weeks of growth, widely spread, even, velvety, initially white, with the formation of conidia they turn dark gray-green to dark olive-gray in the center of the colonies . Microscopic features are identical to the characteristics of the strain grown on the above media. The reverse is unpainted or yellow.
Новый штамм Aspergillus fumigatus продуцирует индольные алкалоиды: циклопростатины А и В с выходом 115,0 мг на 1 кг питательной среды RMM, фумитреморгин С с выходом 42,0 мг/кг питательной среды RMM и 102,0 мг/кг питательной среды МММ, а также продуцирует 12,13-дигидро-фумитреморгин С с выходом 98,0 мг/кг питательной среды RMM и 125,0 мг/кг питательной среды МММ и веррукулоген с выходом 70,0 мг/кг питательной среды RMM и 100,0 мг/кг питательной среды МММ.The new Aspergillus fumigatus strain produces indole alkaloids: cycloprostatins A and B with a yield of 115.0 mg per 1 kg of RMM culture medium, fumitremorgin C with a yield of 42.0 mg / kg of RMM culture medium and 102.0 mg / kg of MMM culture medium, and also produces 12,13-dihydro-fumitremorgin C with a yield of 98.0 mg / kg of culture medium RMM and 125.0 mg / kg of culture medium MMM and verruculogen with a yield of 70.0 mg / kg of culture medium RMM and 100.0 mg / kg of nutrient medium MMM.
Заявляемый способ получения индольных алкалоидов: циклопростатинов А и В (1 и 2), фумитреморгина С (3), 12,13-дигидро-фумитреморгина С (4) и веррукулогена (5), отличается от известного способа использованием нового, более продуктивного штамма Aspergillus fumigatus KMM 4631, который выращивается на питательной среде методом поверхностного твердофазного культивирования, и менее длительными и трудоемкими процедурами экстракции и очистки целевых продуктов. Выходы индольных алкалоидов: 12,13-дигидро-фумитреморгина С, циклопростатинов А и В в заявляемом способе превышают выходы в способах-аналогах в 60-25000 раз. Кроме того, исключаются затраты на аэрацию культуры и дорогостоящие сахара, что снижает затраты на получение продукта в 10-20 раз, по сравнению с получением продукта на жидких питательных средах в известных способах.The inventive method for producing indole alkaloids: cycloprostatin A and B (1 and 2), fumitremorgin C (3), 12,13-dihydro-fumitremorgin C (4) and verruculogen (5), differs from the known method using a new, more productive strain of Aspergillus fumigatus KMM 4631, which is grown on a nutrient medium by the method of surface solid-phase cultivation, and less lengthy and laborious procedures for the extraction and purification of target products. The outputs of indole alkaloids: 12,13-dihydro-fumitremorgin C, cycloprostatins A and B in the present method exceed the outputs in the methods of analogues in 60-25000 times. In addition, the costs of aeration of the culture and expensive sugars are excluded, which reduces the cost of obtaining the product by 10-20 times, compared with obtaining the product on liquid nutrient media in known methods.
Технический результат штамма Aspergillus fumigatus KMM 4631, выращенного на твердых питательных средах, заключается в его высокой продуктивности. Новый штамм может использоваться для промышленного получения индольных алкалоидов, обладающих противоопухолевой активностью.The technical result of the strain Aspergillus fumigatus KMM 4631, grown on solid nutrient media, is its high productivity. The new strain can be used for industrial production of indole alkaloids with antitumor activity.
Авторами предлагаемого изобретения проведено сравнительное исследование количества продуцируемых штаммом гриба KMM 4631 индольных алкалоидов на жидкой и твердых питательных средах. Использовалась жидкая питательная среда, содержащая натуральную морскую воду, глюкозу - 30,0 г/л, пептон - 1,0 г/л, дрожжевой экстракт 0,5 г/л, КН2РO4 - 1,0 г/л, MgSO4· 7H2O - 0,5 г/л, FeSO4· 7H2O - 0,02 г/л. Культивирование проводили в колбах на качалке 180-200 об/мин в течение 168 час, при температуре 20° С и рН 7,8. Культуральную жидкость хроматографировали на колонке с полихромом-1, элюируя фракции последовательно водой и 50%-ным этиловым спиртом. Водно-спиртовый элюат упарили, остаток экстрагировали этилацетатом. Экстракт концентрировали в вакууме до минимального объема и делили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на силикагеле в системе этилацетат-гексан, 4;1. Полученные данные сведены в таблицу.The authors of the present invention conducted a comparative study of the amount produced by the strain of the fungus KMM 4631 indole alkaloids in liquid and solid nutrient media. We used a liquid nutrient medium containing natural sea water, glucose - 30.0 g / l, peptone - 1.0 g / l, yeast extract 0.5 g / l, KH 2 PO 4 - 1.0 g / l, MgSO 4 · 7H 2 O - 0.5 g / l, FeSO 4 · 7H 2 O - 0.02 g / l. Cultivation was carried out in flasks on a rocking chair 180-200 rpm for 168 hours, at a temperature of 20 ° C and a pH of 7.8. The culture fluid was chromatographed on a polychrome-1 column, eluting the fractions successively with water and 50% ethyl alcohol. The water-alcohol eluate was evaporated, the residue was extracted with ethyl acetate. The extract was concentrated in vacuo to a minimum volume and partitioned by high performance liquid chromatography (HPLC) on silica gel in ethyl acetate-hexane, 4; 1. The data obtained are summarized in a table.
В примерах 1 и 2 представлены данные по получению алкалоидов в результате их продуцирования заявляемым штаммом на твердых питательных средах и выделения заявляемым способом. Полученные данные сведены в таблицу.In examples 1 and 2 presents data on the production of alkaloids as a result of their production by the claimed strain on solid nutrient media and isolation of the claimed method. The data obtained are summarized in a table.
вания (час.)Cultural time
vania (hour)
среды)The yield of alkaloids (mg / l for liquid medium and mg / kg for solid
Wednesday)
твердой среды)Total alkaloids (mg / L for liquid media and mg / kg for
solid medium)
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Штамм Aspergillus fumigatus KMM 4631 выращивают методом поверхностного твердофазного культивирования при температуре 20° С на питательной среде RMM следующего состава: рис - 1,0 кг; натуральная морская вода - 2,0 л, дрожжевой экстракт - 1,0 г, натрий виннокислый - 0,5 г, КН2РO4 - 0,5 г, при комнатной температуре в течение 504 часов. Мицелий вместе со средой измельчают и дважды экстрагируют смесью хлороформ-этанол 2:1. Экстракт упаривают, остаток хроматографируют на колонке с силикагелем L (40/100 мкм), элюируя последовательно хлороформом и системами хлороформ-этанол 10:1, 5:1 и 2:1. Фракции, элюируемые системой хлороформ-этанол 2:1, объединяют, концентрируют в вакууме до минимального объема и разделяют методом ВЭЖХ на колонках Силасорб Si (этилацетат-гексан, 4:1) и Диасфер-110-С18 (55% МеОН).Example 1. The strain Aspergillus fumigatus KMM 4631 is grown by surface solid-phase cultivation at a temperature of 20 ° C on a nutrient medium RMM of the following composition: rice - 1.0 kg; natural seawater - 2.0 l, yeast extract - 1.0 g, sodium tartrate - 0.5 g, KH 2 PO 4 - 0.5 g, at room temperature for 504 hours. The mycelium is ground together with the medium and extracted twice with a mixture of chloroform-ethanol 2: 1. The extract was evaporated, the residue was chromatographed on a silica gel column L (40/100 μm), eluting successively with chloroform and chloroform-ethanol systems 10: 1, 5: 1 and 2: 1. The fractions eluted with the chloroform-ethanol 2: 1 system are combined, concentrated in vacuo to a minimum volume, and separated by HPLC on a Silabsorb Si (ethyl acetate-hexane, 4: 1) and Diasfer-110-C18 (55% MeOH) columns.
Выход циклопростатина А (65,0 мг/кг), циклопростатина В (50 мг/кг), 12,13-дигидрокси-фумитреморгина С (98 мг/кг), фумитреморгина С (42 мг/кг) и веррукулогена (70 мг/кг). Строение выделенных алкалоидов установлено на основании данных МС-, 1H и 13С ЯМР спектроскопии.The yield of cycloprostatin A (65.0 mg / kg), cycloprostatin B (50 mg / kg), 12,13-dihydroxy-fumitremorgin C (98 mg / kg), fumitremorgin C (42 mg / kg) and verruculogen (70 mg / kg). The structure of the selected alkaloids was established based on the data of MS-, 1 H and 13 C NMR spectroscopy.
Пример 2. Штамм Aspergillus fumigatus KMM 4631 выращивают методом поверхностного твердофазного культивирования при температуре 22° С на питательной среде МММ следующего состава: пшено - 1,5 кг; натуральная морская вода - 2,0 л, натрий виннокислый - 0,5 г, KH2PO4 - 0,1 г, MgSO4· 7H2O - 0,1 г, FeSO4· 7H2O - 0,01 г при комнатной температуре в течение 504 часов. Далее процесс выделения целевых продуктов осуществляют так, как описано в примере 1. Выход 12,13-дигидрокси-фумитреморгина С (125,0 мг/кг), фумитреморгина С (102,0 мг/кг) и веррукулогена (100,0 мг/кг). Строение выделенных алкалоидов установлено на основании данных МС-, 1H и 13С ЯМР спектроскопии.Example 2. The strain Aspergillus fumigatus KMM 4631 is grown by surface solid-phase cultivation at a temperature of 22 ° C on a nutrient medium MMM of the following composition: millet - 1.5 kg; natural sea water - 2.0 l, sodium tartrate - 0.5 g, KH 2 PO 4 - 0.1 g, MgSO 4 · 7H 2 O - 0.1 g, FeSO 4 · 7H 2 O - 0.01 g at room temperature for 504 hours. Next, the process of isolation of the target products is carried out as described in example 1. The yield of 12,13-dihydroxy-fumitremorgin C (125.0 mg / kg), fumitremorgin C (102.0 mg / kg) and verruculogen (100.0 mg / kg). The structure of the selected alkaloids was established based on the data of MS-, 1 H and 13 C NMR spectroscopy.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003136115/13A RU2256701C1 (en) | 2003-12-11 | 2003-12-11 | Strain of fungus aspergillus fumigatus as producer of indole alkaloids and method for their preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003136115/13A RU2256701C1 (en) | 2003-12-11 | 2003-12-11 | Strain of fungus aspergillus fumigatus as producer of indole alkaloids and method for their preparing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2256701C1 true RU2256701C1 (en) | 2005-07-20 |
Family
ID=35842562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003136115/13A RU2256701C1 (en) | 2003-12-11 | 2003-12-11 | Strain of fungus aspergillus fumigatus as producer of indole alkaloids and method for their preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2256701C1 (en) |
-
2003
- 2003-12-11 RU RU2003136115/13A patent/RU2256701C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CUI СВ, KAKEYA H, OKADA G ет al. Novel mammalian cell cycle inhibitors, tryprostatins А, В and other diketopiperazines produced by Aspergillus fumigatus. I. Taxonomy, fermentation, isolation and biological properties. J. Antibiot. (Tokyo), 1996 Jun; 49(6): 527-33. CUI C.B., KAKEYA H., OSADA H. Novel mammalian cell cycle inhibitors, tryprostatins А, В and other diketopiperazines produced by Aspergillus fumigatus. II. Physicochemical properties and structures. J. Antibiot. (Tokyo), 1996, Jun; 49(6): 534-40. LIU J., YANG Z.J., MENG Z.H. The isolation, purification and identification of fumitremorgin В produced by Aspergillus fumigatus. Biomed. Environ. Sci. 1996 Mar; 9(1): 1-11. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU1836425C (en) | A way of obtaining the complex antibiotic cyclosporin and/or its components as well as the fungus strain tolypocladium varium | |
| CN102329735B (en) | Method for preparing curvularin and indolizidine alkaloid and application | |
| JP2802097B2 (en) | Novel anticancer antibiotic MI43-37F11 and method for producing the same | |
| US5407826A (en) | Isolated cultures of microorganisms of Clonostachys Cylindrospora, Gliocladium and Nectria Gliocladioides | |
| FR2458551A1 (en) | NOVEL ANTIBIOTICS, THEIR PREPARATION AND THEIR USE | |
| CN103724290A (en) | Cyclopeptide compound clavatustide A as well as producing strain, preparation method and application thereof | |
| RU2256701C1 (en) | Strain of fungus aspergillus fumigatus as producer of indole alkaloids and method for their preparing | |
| US5447854A (en) | Production of cyclosporin A and/or C with a strain of NECTRIA | |
| CA1109406A (en) | Production of monorden | |
| US7939081B2 (en) | Method for producing cercosporamide | |
| US3847742A (en) | Process for deacetoxycephalosporin c | |
| CN102168020B (en) | Marine-source fungus and application thereof | |
| CN101186938B (en) | Method for preparing dextral biotin intermediate lactone | |
| US6423530B1 (en) | Process for preparing FR900482 and compounds analogous thereto | |
| SU582772A3 (en) | Method of preparing deacetoxycephalosporinc | |
| RU2422508C1 (en) | Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom FUNGUS STRAIN - SHERININE PRODUCER | |
| JPH0494693A (en) | Production of aphidicolin | |
| JPH0246294A (en) | Production of angnocyclinone from streptomyces microorganism and production thereof | |
| US5510501A (en) | Saintopin derivatives | |
| JP3237722B2 (en) | Novel antibiotics Mer-NF8054A and Mer-NF8054X and methods for producing them | |
| JP3145200B2 (en) | New isochroman carboxylic acid derivatives | |
| JP3067904B2 (en) | A new penicillium mold | |
| JPH0515385A (en) | Novel antibiotic allithamycin and method for its production | |
| ITMI950865A1 (en) | PURPOROGALLINA DERIVATIVES | |
| JPH0592967A (en) | Novel natural substance with 10-membered ring lactone structure |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151212 |