RU2417373C1 - НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ α-АМИЛАЗЫ - Google Patents

НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ α-АМИЛАЗЫ Download PDF

Info

Publication number
RU2417373C1
RU2417373C1 RU2009135209/15A RU2009135209A RU2417373C1 RU 2417373 C1 RU2417373 C1 RU 2417373C1 RU 2009135209/15 A RU2009135209/15 A RU 2009135209/15A RU 2009135209 A RU2009135209 A RU 2009135209A RU 2417373 C1 RU2417373 C1 RU 2417373C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
reagent
mmol
water
reagents
amylase
Prior art date
Application number
RU2009135209/15A
Other languages
English (en)
Inventor
Галина Евгеньевна Яковлева (RU)
Галина Евгеньевна Яковлева
Ксения Александровна Черемисина (RU)
Ксения Александровна Черемисина
Original Assignee
Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест" filed Critical Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест"
Priority to RU2009135209/15A priority Critical patent/RU2417373C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2417373C1 publication Critical patent/RU2417373C1/ru

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины и касается набора реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы, включающего реагент 1, содержащий хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, моноклональные антитела к слюнной α-амилазе (MAT), 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду и реагент 2, содержащий 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит (GalG2CNP), MES и воду, отличающегося тем, что реагент 1 дополнительно содержит EDTA и бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве соли кальция - ацетат кальция, а реагент 2 дополнительно содержит EDTA и азид натрия, при указанном в формуле изобретения соотношении компонентов. Предложенный набор реагентов обладает повышенной стабильностью при сохранении высокой точности и воспроизводимости результатов анализа. 1 табл.

Description

Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять активность панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.
Наиболее распространенным для определения активности панкреатической α-амилазы является метод, одобренный Международной федерацией клинической химии (IFCC), с использованием в качестве субстрата 4,6-ethylidene-(G7)-p-nitrophenil-(G1)-α,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G7)-п-нитрофенил-(G1)-α,D-мальтогептазид; Et-G7PNP). Первой стадией реакции является селективное ингибирование активности слюнного изофермента α-амилазы с помощью моноклональных антител (MAT) к слюнной α-амилазе. Оставшаяся активной панкреатическая α-амилаза расщепляет Et-G7PNP до G2PNP, G3PNP, G4PNP, Et-G3, Et-G4 и Et-G5. После этого α-глюкозидаза гидролизует G2PNP, G3PNP и G4PNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности панкреатической α-амилазы в образце (Kruse-Jarres J.D., Kaiser С., Hafkenscheid J.С.М. et al. Evaluation of a new α-amylase assay using 4,6-ethylidene-(G7)-1-4-nitrophenil-(G1)-α-D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol.27. P.103-113).
Основным недостатком метода является использование дополнительного фермента для получения окрашенного продукта.
Наиболее близким к заявленному набору реагентов - прототипом, является набор реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, состоящий из двух реагентов, имеющих следующий состав компонентов: реагент 1 - хлорид натрия 50-500 ммоль/л, калий роданистый (KSCN) 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, хлорид кальция 0,5-10,0 ммоль/л, MAT 5-100 мг/л, MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) 50 ммоль/л, рН 5-8, вода - остальное; реагент 2 - 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside (2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит; GalG2CNP) 2,4-12 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, рН 5-8, вода - остальное (Morishita Y., IinumaY., Nakashima N., et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside // Clinical Chemistry. 2000. Vol 46. P.928-933).
В основу набора для определения панкреатической α-амилазы положен кинетический колориметрический метод, заключающийся в том, что на первой стадии слюнной изофермент α-амилазы ингибируется с помощью MAT, на второй стадии - панкреатическая α-амилаза гидролизует GalG2CNP с образованием окрашенного продукта 2-chloro-4-nitrophenol и неокрашенного - 4-O-β-D-galactopyranosylmaltose. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности панкреатической α-амилазы в образце.
Недостатком прототипа является небольшой срок хранения реагентов - 3 месяца при температуре 4°С.
Технической задачей изобретения является повышение стабильности набора реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче и продление срока его хранения при сохранении высокой точности и воспроизводимости результатов анализа.
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым набором реагентов, включающим два жидких реагента, готовых к использованию, при этом первый реагент (реагент 1) дополнительно содержит EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и бычий сывороточный альбумин (БСА), а хлорид кальция заменен на ацетат кальция; второй реагент (реагент 2) дополнительно содержит EDTA и азид натрия.
Предлагаемый набор реагентов включает следующие компоненты:
реагент 1, содержащий хлорид натрия 50-500 ммоль/л, KSCN 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA 0,2-5,0 ммоль/л, ацетат кальция 0,7-10,0 ммоль/л, БСА 0,5-2 мас.%, MAT 12,0-25,0 мг/л, MES 50 ммоль/л, рН 5,5-6,5, вода - остальное; реагент 2, содержащий азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA 0,2-5,0 ммоль/л, GalG2CNP 2,5-20 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, рН 5,5-6,5, вода - остальное.
Данный набор реагентов характеризуется правильностью определения активности панкреатической α-амилазы 100±5% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5%. Срок хранения набора реагентов при температуре 2-8°С составляет 1 год.
Включение в состав реагента 1 новых компонентов - EDTA, образующей комплексные соединения с большинством катионов, БСА - способствующего стабильности антител, а также замена хлорида кальция на консервант ацетат кальция, позволяет повысить стабильность реагента 1 и продлить срок его годности до 1 года.
Включение в состав реагента 2 нового компонента - EDTA, образующей комплексные соединения с большинством катионов, а также добавление консерванта - азида натрия позволяет повысить стабильность реагента 2 и продлить срок его годности до 1 года.
Определение активности панкреатической α-амилазы осуществляется при температуре реагентов 37°С следующим образом: к 25 мкл пробы добавляют 1 мл реагента 1, выдерживают 5 минут и добавляют 0,25 мл реагента 2, через 1 мин начинают считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм, при этом количество считываний должно быть не менее трех. Активность панкреатической α-амилазы (А) в Е/л рассчитывают по формуле:
А=ΔЕ/мин×2757,
Где ΔЕ/мин - среднее изменение оптической плотности за минуту;
2757 - фактор пересчета по уравнению Бугера-Ламберта-Бера.
Определяющими существенными отличиями предлагаемого набора реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, по сравнению с прототипом, являются:
- реагент 1 дополнительно содержит EDTA и БСА, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;
- в реагенте 1 хлорид кальция заменен на ацетат кальция, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;
- реагент 2 дополнительно содержит EDTA, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;
все компоненты в наборе использованы в оптимальных, экспериментально подобранных концентрациях, что позволяет повысить функциональность и расширить область применения набора.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Готовят реагент 1 и реагент 2.
Для приготовления реагента 1 делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят их в стеклянный стакан и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке и доводят рН под контролем рН-метра до 6,0. Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.
Для приготовления реагента 2 делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят все навески, кроме GalG2CNP, в стеклянный стакан и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке, доводят рН под контролем рН-метра до 6,0. Далее раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, доводят объем до метки дистиллированной водой, перемешивают, добавляют навеску GalG2CNP и вновь тщательно перемешивают на магнитной мешалке.
В результате получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:
реагент 1, содержащий:
Хлорид натрия, ммоль/л - 50,0
KSCN, ммоль/л - 400,0
Азид натрия, ммоль/л - 90,0
EDTA, ммоль/л - 0,2
Ацетат кальция, ммоль/л - 0,7
БСА, мас.% - 2,0
MAT, мг/л-12,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное;
реагент 2, содержащий:
Азид натрия, ммоль/л - 90,0
EDTA, ммоль/л - 0,2
GalG2CNP, ммоль/л - 2,5
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,9
Пример 2
Приготовление реагента 1 и реагента 2 осуществляют аналогично примеру 1. Получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:
реагент 1, содержащий:
Хлорид натрия, ммоль/л - 200,0
KSCN, ммоль/л - 150,0
Азид натрия, ммоль/л - 20,0
EDTA, ммоль/л - 2,5
Ацетат кальция, ммоль/л - 5,0
БСА, мас.% - 1,0
MAT, мг/л - 25,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное;
реагент 2, содержащий:
Азид натрия, ммоль/л - 20,0
EDTA, ммоль/л - 2,5
GalG2CNP, ммоль/л - 20,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,5.
Пример 3
Приготовление реагента 1 и реагента 2 осуществляют аналогично примеру 1. Получают набор реагентов для определения панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:
реагент 1, содержащий:
Хлорид натрия, ммоль/л - 500,0
KSCN, ммоль/л - 50,0
Азид натрия, ммоль/л - 1,0
EDTA, ммоль/л - 5,0
Ацетат кальция, ммоль/л - 10,0
БСА, мас.% - 0,5
MAT, мг/л - 20,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное;
реагент 2, содержащий:
Азид натрия, ммоль/л - 1,0
EDTA, ммоль/л - 5,0
GalG2CNP, ммоль/л - 10,0
MES, ммоль/л - 50,0
Вода - остальное.
При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 6,5.
Пример 4 Определение активности панкреатической α-амилазы в контрольных сыворотках.
К 1 мл реагента 1, прогретому до температуры 37°С, добавили 25 мкл контрольной сыворотки «Precinorm U», выдержали 5 минут при температуре 37°С и добавили 0,25 мл реагента 2. Через 1 мин начали считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм. Аналогичную процедуру повторили для контрольных сывороток «Precipath U», «c.f.a.s.», «Contornorm», «Contropath», «BioCal E». Результаты анализа приведены в таблице.
Таблица
Контрольная сыворотка Аттестованное значение активности панкреатической α-амилазы (IFCC), Е/л Полученный результат, Е/л
«Precinorm U» («Roche», Германия) 40,8 (33,6-48,0) 40
«Precipath U» («Roche», Германия) 102(84-120) 102
«c.f.a.s.» («Roche», Германия) 162 164
«Contornorm» («Biocon», Германия) 40,1 (32,9-47,3) 41
«Contropath» («Biocon», Германия) 102 (84-120) 101
«BioCal E» («Biocon», Германия) 171 177
Из таблицы 1 видно, что предлагаемый реагент обеспечивает высокую точность определения активности панкреатической α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.
Использование предлагаемого набора реагентов позволит, по сравнению с прототипом:
- увеличить срок годности набора до 1 года путем обеспечения стабильности реагентов;
- расширить область применения и повысить функциональность набора за счет обеспечения возможности работы с ним в условиях клинико-диагностических, поликлинических и биохимических лабораторий.
Предлагаемый набор реагентов доступен для любой клинико-диагностической, поликлинической и биохимической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие зарубежным стандартам.

Claims (1)

  1. Набор реагентов для определения активности панкреатической α-амилазы, включающий реагент 1, содержащий хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, моноклональные антитела к слюнной α-амилазе (MAT), 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду и реагент 2, содержащий 2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозит (GalG2CNP), MES и воду, отличающийся тем, что реагент 1 дополнительно содержит EDTA и бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве соли кальция - ацетат кальция, а реагент 2 дополнительно содержит EDTA и азид натрия, при следующем соотношении компонентов:
    реагент 1 Хлорид натрия, ммоль/л 50,0-500,0 KSCN, ммоль/л 50,0-400,0 Азид натрия, ммоль/л 1,0-90,0 EDTA, ммоль/л 0,2-5,0 Ацетат кальция, ммоль/л 0,7-10,0 БСА, мас.% 0,5-2,0 МАТ, мг/л 12,0-25,0 MES, ммоль/л 50,0 Вода, л Остальное до 1 л; реагент 2 Азид натрия, ммоль/л 1,0-90,0 EDTA, ммоль/л 0,2-5,0 GalG2CNP, ммоль/л 2,5-20,0 MES, ммоль/л 50,0 Вода, л Остальное до 1 л,

    при этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,5-6,5.
RU2009135209/15A 2009-09-21 2009-09-21 НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ α-АМИЛАЗЫ RU2417373C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009135209/15A RU2417373C1 (ru) 2009-09-21 2009-09-21 НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ α-АМИЛАЗЫ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009135209/15A RU2417373C1 (ru) 2009-09-21 2009-09-21 НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ α-АМИЛАЗЫ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2417373C1 true RU2417373C1 (ru) 2011-04-27

Family

ID=44731642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009135209/15A RU2417373C1 (ru) 2009-09-21 2009-09-21 НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ α-АМИЛАЗЫ

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2417373C1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1500886A (zh) * 2002-11-15 2004-06-02 赵青华 胰淀粉酶活性检测液及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1500886A (zh) * 2002-11-15 2004-06-02 赵青华 胰淀粉酶活性检测液及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MORISHITA Y. et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside//Clinical Chemistry, 2000, V.46, P.P.928-933. *
ЯКОВЛЕВА Г.Е. Набор реагентов «Амилаза-Ново» для определения а-амилазы в сыворотке крови и моче // Новости «Вектор-Бест», 1999 Декабрь, №14. ЯКОВЛЕВА Г.Е. Ферменты в клинической биохимии. - Новосибирск: «Вектор-Бест», 2005, С.18-19. ЧЕРЕМИСИНА К.А. Определение активности панкреатической α-амилазы // Новости «Вектор-Бест», 2009, №3(53). «Панкреатическая амилаза (Pancreas-amylase liquicolor)», Реагенты фирмы «HUMAN», Германия, Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТКА». - М., 2006. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Garry et al. A micro method for serum cholinesterase
JP3080770B2 (ja) 液体中のイオンを測定する方法及びそのための組成物
US3950226A (en) Novel reagent and method for the determination of urea in biological fluids
Rauscher et al. Optimized conditions for determining activity concentration of alpha-amylase in serum, with 1, 4-alpha-D-4-nitrophenylmaltoheptaoside as substrate.
CN105203472B (zh) 一种稳定的游离脂肪酸测定试剂盒
CN101226198A (zh) 一种糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体稳定试剂
CN107870170B (zh) 一种酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒
CN113584125B (zh) 一种液态稳定的5’-核苷酸酶校准品及检测试剂盒及其应用
CN111944872A (zh) 测定肌酐含量的试剂组合、试剂或试剂盒
RU2417373C1 (ru) НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ α-АМИЛАЗЫ
CN107505470A (zh) 稳定的肌酐检测试剂盒及其使用方法
Lundin et al. Optimized bioluminescence assay of creatine kinase and creatine kinase B-subunit activity.
CN105203533A (zh) 一种分析灵敏度高的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂
RU2417374C1 (ru) РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ОБЩЕЙ α-АМИЛАЗЫ
Hynie et al. Determination of phosphodiesterase I activity in human blood serum
CN104048955A (zh) 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
Sung-Ping et al. Fluorometric enzymatic determination of serum creatinine on the surface of silicone-rubber pads
Guilbault et al. Enzymatic, fluorometric assay of alpha-amylase in serum.
CN111500672B (zh) 一种分析灵敏度高的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定试剂盒及其制备方法和应用
JP2008197077A (ja) 試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、非特異的発色を抑制する方法、並びに非特異的発色抑制剤
US6818415B2 (en) Sodium activation of amylase
CN102140495A (zh) 二甲基精氨酸二甲胺水解酶测定方法及其诊断试剂
WO1995006135A1 (en) Method of determining sodium ion
JP2002238598A (ja) カルシウムイオン測定用組成物および測定方法
SU1041568A1 (ru) Реагент дл определени аденозин-5-трифосфата

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20110922