RU2247987C2 - Method for detecting bactericide activity of blood serum - Google Patents
Method for detecting bactericide activity of blood serum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2247987C2 RU2247987C2 RU2003101778/15A RU2003101778A RU2247987C2 RU 2247987 C2 RU2247987 C2 RU 2247987C2 RU 2003101778/15 A RU2003101778/15 A RU 2003101778/15A RU 2003101778 A RU2003101778 A RU 2003101778A RU 2247987 C2 RU2247987 C2 RU 2247987C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood serum
- level
- luminescent
- intensity
- effect
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение.The technical field to which the invention relates.
Изобретение относится к области биомедицинских измерительных технологий, а именно к способам определения бактерицидной активности сыворотки крови (БАСК) с использованием жизнеспособных серочувствительных микроорганизмов.The invention relates to the field of biomedical measuring technologies, and in particular to methods for determining the bactericidal activity of blood serum (BASK) using viable serosensitive microorganisms.
В частности, изобретение предназначено для определения бактерицидной активности сыворотки крови с использованием спонтанно люминесцирующих серочувствительных микроорганизмов.In particular, the invention is intended to determine the bactericidal activity of blood serum using spontaneously luminescent serosensitive microorganisms.
Задача тестирования бактерицидной активности сыворотки крови определяется необходимостью интегральной оценки уровня неспецифической противоинфекционной резистентности организма человека и животных при ряде физиологических и патологических состояний. В этой связи определение бактерицидных свойств крови внесено в “Номенклатуру клинических лабораторных исследований” (п.6.3.2), утвержденную Приказом Министерства здравоохранения РФ № 64 от 21.02.2000 г.The task of testing the bactericidal activity of blood serum is determined by the need for an integrated assessment of the level of non-specific anti-infection resistance of the human body and animals in a number of physiological and pathological conditions. In this regard, the definition of the bactericidal properties of blood is included in the “Clinical Laboratory Research Nomenclature” (clause 6.3.2), approved by Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 64 of 02.21.2000.
Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в лабораториях биологического и медицинского профиля, решающих вопросы оценки гомеостаза внутренней среды организма и уровня антиинфекционной резистентности с целью выявления их возможных нарушений и контроля эффективности соответствующих коррекционных мероприятий.Thus, the claimed method is intended for use in laboratories of a biological and medical profile, solving issues of assessing homeostasis of the internal environment of the body and the level of anti-infectious resistance in order to identify their possible violations and monitor the effectiveness of the corresponding corrective measures.
Уровень техники.The level of technology.
Существующие подходы к определению БАСК основаны на одном и том же принципе - воздействии сыворотки крови на популяцию жизнеспособных серо чувствительных микроорганизмов с последующей оценкой доли клонов, выживших после подобного контакта, по сравнению с контролем - теми же микроорганизмами, инкубированными вне контакта с сывороткой крови. При этом в качестве серо чувствительных микроорганизмов обычно используются различные штаммы Escherichia coli: 0111 [1], 675 [3], f2 [5] и др., что определяется особенностями строения их клеточной стенки, эффективно разрушаемой под действием комплекса сывороточных факторов. Вычисление значений БАСК производится на основании сходных и имеющих одинаковый биологический смысл формул, основанных на расчете соотношения микроорганизмов, выросших в опыте и контроле, и выражается в процентах.Existing approaches to the determination of BASK are based on the same principle - the effect of blood serum on a population of viable sulfur-sensitive microorganisms, followed by an estimate of the proportion of clones surviving after such contact, as compared to the control, by the same microorganisms incubated out of contact with blood serum. Moreover, various strains of Escherichia coli are usually used as gray-sensitive microorganisms: 0111 [1], 675 [3], f2 [5], etc., which is determined by the structural features of their cell wall, which is effectively destroyed by the complex of serum factors. The calculation of BASK values is based on similar formulas having the same biological meaning, based on the calculation of the ratio of microorganisms grown in experience and control, and is expressed as a percentage.
Вместе с тем по технологии своего исполнения существующие методы определения БАСК могут быть подразделены на две большие группы.However, according to the technology of its implementation, existing methods for determining BASK can be divided into two large groups.
Первую составляют так называемые “бактериологические” методы, основанные на определении количества микроорганизмов, выживших после контакта с сывороткой крови и при посеве на плотные питательные среды формирующих на них изолированные колонии. Несмотря на многочисленные попытки уменьшения трудоемкости подобных методов, снижения расхода питательных сред [2, 3, 4] говорить об их использовании в настоящее время можно только в историческом аспекте (способы-аналоги).The first is made up of the so-called “bacteriological” methods based on determining the number of microorganisms that survived after contact with blood serum and when sowing on solid nutrient media forming isolated colonies on them. Despite numerous attempts to reduce the complexity of such methods, to reduce the consumption of nutrient media [2, 3, 4], it is currently possible to talk about their use only in the historical aspect (analogue methods).
Вторая группа представлена так называемыми “фотонефелометрическими” методами, основанными на оптической регистрации феномена задержки роста бактериальной культуры в жидкой питательной среде [1, 5, 6], и в настоящее время получили наибольшее распространение. Первый из них (метод О.В.Бухарина и В.Л.Созыкина, 1979) по совокупности признаков является наиболее близким к заявляемому и может быть охарактеризован как способ-прототип.The second group is represented by the so-called “photonephelometric” methods based on the optical recording of the phenomenon of growth retardation of a bacterial culture in a liquid nutrient medium [1, 5, 6], and is currently the most widely used. The first of them (the method of O.V. Bukharin and V.L. Sozykin, 1979) in terms of the set of features is the closest to the claimed one and can be characterized as a prototype method.
Определение БАСК по способу-прототипу предусматривает выполнение трехстадийной процедуры.The definition of BASK according to the prototype method involves the implementation of a three-stage procedure.
Первый этап является абсолютно необходимым и определяет сущность проводимой реакции, при этом осуществляется контакт жизнеспособного серо чувствительного микроорганизма - Esherichia coli 0111 - с сывороткой крови (30 мин, 37°С), во время которого часть бактериальной популяции гибнет. На втором этапе к данной смеси добавляется мясопептонный бульон и осуществляется подращивание оставшейся части бактериальной популяции в жидкой питательной среде (2 часа 30 мин, 37°С). На третьем нефелометрическое определение и сравнение значений оптической плотности подращенной культуры с контролем (значениями оптической плотности бактериальной популяции, инкубируемой в тех же условиях, но не имевшей контакта с сывороткой крови). Поскольку оптическая плотность растущей культуры пропорциональна количеству жизнеспособных бактерий, по степени ее подавления судят о выраженности бактерицидного действия сыворотки крови, выражая ее в процентах. Итоговое значение БАСК рассчитывают по формуле:The first stage is absolutely necessary and determines the essence of the reaction, while a viable sulfur-sensitive microorganism - Esherichia coli 0111 - comes into contact with blood serum (30 min, 37 ° C), during which part of the bacterial population dies. At the second stage, meat-peptone broth is added to this mixture and the remaining part of the bacterial population is grown in a liquid nutrient medium (2 hours 30 min, 37 ° C). On the third, the nephelometric determination and comparison of the absorbance values of the grown culture with the control (absorbance values of a bacterial population incubated under the same conditions but not having contact with blood serum). Since the optical density of a growing culture is proportional to the number of viable bacteria, the degree of its suppression is used to judge the severity of the bactericidal action of blood serum, expressing it as a percentage. The final value of BASK is calculated by the formula:
где [OD]к - оптическая плотность бактериальной суспензии в контроле, [OD]о - оптическая плотность бактериальной суспензии в опыте.where [OD] k is the optical density of the bacterial suspension in the control, [OD] o is the optical density of the bacterial suspension in the experiment.
Основной причиной, препятствующей получению требуемого результата при использовании способа-прототипа, является существенная длительность второго этапа определения бактерицидной активности, лимитируемая скоростью роста индикаторного серо чувствительного микроорганизма после контакта с сывороткой крови до значений оптической плотности, доступных для фото нефелометрической регистрации.The main reason that prevents obtaining the desired result when using the prototype method is the significant duration of the second stage of determining bactericidal activity, limited by the growth rate of the indicator gray-sensitive microorganism after contact with blood serum to the optical density values available for photo nephelometric registration.
Альтернативные подходы, ведущие к устранению данного недостатка, в доступной нам литературе не описаны.Alternative approaches leading to the elimination of this drawback are not described in the literature available to us.
Таким образом, заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.Thus, the claimed method is not known from the prior art, i.e. is new.
Сущность изобретения.SUMMARY OF THE INVENTION
Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является снижение длительности процедуры определения бактерицидной активности сыворотки крови (повышение его экспрессности). Дополнительной задачей, решаемой при осуществлении заявляемого способа, является снижение трудоемкости его выполнения.The main task, the solution of which the claimed method is directed, is to reduce the duration of the procedure for determining the bactericidal activity of blood serum (increase its expression). An additional problem to be solved when implementing the proposed method is to reduce the complexity of its implementation.
Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее:The essence of the proposed method, formulated at the level of functional generalization and underlying it, is the following:
- уровень угнетения свечения популяции спонтанно люминесцирующих серочувствительных микроорганизмов под действием сыворотки крови пропорционален доли бактериальных клеток, в отношении которых в этих условиях развивается бактерицидный эффект.- the level of suppression of the luminescence of the population of spontaneously luminescent serosensitive microorganisms under the action of blood serum is proportional to the proportion of bacterial cells, in relation to which a bactericidal effect develops under these conditions.
Соответственно, при реализации заявляемого способа определения БАСК характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления в сравнении со способом-прототипом представляются следующим образом (таблица 1).Accordingly, when implementing the proposed method for determining BASK, the characteristics of actions, the order of their implementation and the conditions for implementation in comparison with the prototype method are presented as follows (table 1).
На первом этапе определения бактерицидной активности сыворотки крови в “опытную” и “контрольную” кюветы вносят по 20 мкл суспензии серо чувствительных спонтанно люминесцирующих бактерий с концентрацией 10 КОЕ/мл. В качестве подобной бактериальной культуры может использоваться генно-инженерный штамм Escherichia coli Z 905, несущий плазмиду pPHL7 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi. Данный штамм депонирован в “Коллекции культур светящихся бактерий” Института биофизики Сибирского отделения Российской академии наук (Каталог светящихся бактерий / под ред. Э.К.Родичевой. - Новосибирск: Наука, 1997. - 125 с.) и в настоящее время выпускается в виде лиофилизированного препарата под коммерческим названием “Микробиосенсор E.coli Z 905”, содержащего 109 КОЕ/мл жизнеспособных люминесцирующих микроорганизмов.At the first stage of determining the bactericidal activity of blood serum, 20 μl of a suspension of gray-sensitive spontaneously luminescent bacteria with a concentration of 10 CFU / ml are introduced into the “experimental” and “control” cuvettes. A genetically engineered strain of Escherichia coli Z 905 carrying the pPHL7 plasmid with the genes of the luminescent Photobacterium leiognathi system can be used as a similar bacterial culture. This strain was deposited in the “Collection of cultures of luminous bacteria” of the Institute of Biophysics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Catalog of luminous bacteria / under the editorship of E.K. Rodicheva. - Novosibirsk: Nauka, 1997. - 125 p.) And is currently available in the form lyophilized preparation under the commercial name “E.coli Z 905 Microbiosensor” containing 10 9 CFU / ml of viable luminescent microorganisms.
После этого в контрольную кювету вносят 20 мкл 0,9% раствора хлористого натрия, а в опытную 20 мкл тестируемой сыворотки крови, предварительно в соотношении 1:1 разбавленной 0,9% раствора хлорида натрия. Образцы выдерживают в течении 30 минут при 37°С.After that, 20 μl of a 0.9% sodium chloride solution is added to the control cuvette, and 20 μl of the tested blood serum is added to the experimental cuvette, previously in a 1: 1 ratio diluted with 0.9% sodium chloride solution. Samples are incubated for 30 minutes at 37 ° C.
Содержание этапа - формирование бактерицидного действия сыворотки крови в отношении используемого индикаторного микроорганизма - принципиально не отличается от такового в способе прототипе.The content of the stage — the formation of the bactericidal action of blood serum in relation to the indicator microorganism used — does not fundamentally differ from that in the prototype method.
В то же время использование заявляемого способа позволяет отказаться от 2,5-часового этапа подращивания индикаторных микроорганизмов, выживших после воздействия сыворотки крови, и непосредственно перейти к этапу регистрации результата бактерицидного эффекта. В результате общая продолжительность определения БАСК сокращается в 6 раз (со 180 минут до 30 минут). Дополнительной задачей, решаемой при использовании заявляемого способа, является снижение его трудоемкости за счет исключения этапа подращивания бактериальных культур (внесение в пробы питательной среды, перемешивание, помещение в термостат и выемка из него, внесение проб в измерительные кюветы).At the same time, the use of the proposed method allows you to abandon the 2.5-hour stage of growing indicator microorganisms that survived after exposure to blood serum, and directly go to the stage of recording the result of a bactericidal effect. As a result, the total duration of BASK determination is reduced by 6 times (from 180 minutes to 30 minutes). An additional problem to be solved when using the proposed method is to reduce its complexity by eliminating the stage of growing bacterial cultures (introducing a nutrient medium into samples, mixing, placing in a thermostat and removing from it, introducing samples into measuring cuvettes).
На завершающем этапе осуществления заявляемого способа к “опытной” и “контрольной” пробам добавляют по 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия, что позволяет остановить развитие бактерицидного эффекта путем одномоментного 25-кратного разбавления действующих компонентов реакции. После этого кюветы помещают в измерительную ячейку люминометра и замеряют уровень свечения бактериальной суспензии в видимой сине-зеленой области спектра 420-600 нм в течении 30 секунд. В качестве измерительного прибора при реализации заявляемого способа могут использоваться биохемилюминометр БХЛ-6 (НПО “Биофармавтоматика”, Нижний Новгород), БЛМ 8802 М (СКТБ “Наука”, Красноярск), а также прочие отечественные и зарубежные люминометры, работающие в обозначенной области спектра и обеспечивающие соответствующую дискретность измерений.At the final stage of the implementation of the proposed method to the “experimental” and “control” samples add 1 ml of 0.9% sodium chloride solution, which allows to stop the development of the bactericidal effect by simultaneous 25-fold dilution of the active components of the reaction. After this, the cuvettes are placed in the measuring cell of the luminometer and the level of luminescence of the bacterial suspension is measured in the visible blue-green region of the spectrum of 420-600 nm for 30 seconds. As a measuring device when implementing the proposed method, a BHL-6 biochemiluminometer (NPO Biofarmavtomatika, Nizhny Novgorod), BLM 8802 M (SKTB Nauka, Krasnoyarsk), as well as other domestic and foreign luminometers working in the indicated spectral region and can be used providing the corresponding discreteness of measurements.
Содержание этапа - регистрация результата реакции - также имеет некоторые отличия от такового в способе-прототипе, т.к.:The content of the step — recording the result of the reaction — also has some differences from that in the prototype method, because:
- во-первых, используется иной физический принцип - определение люминесценции вместо фото нефелометрии оптической плотности;- firstly, a different physical principle is used - the determination of luminescence instead of optical density nephelometry photos;
- во-вторых, оценка эффекта проводится непосредственно на бактериальных клетках, подвергнутых действию сыворотки крови, а не на их “потомках” после десятков генераций (как в способе-прототипе).- secondly, the effect is evaluated directly on bacterial cells exposed to blood serum, and not on their “descendants” after dozens of generations (as in the prototype method).
В то же время итоговый расчет БАСК проводят по формуле, которая по своей сути аналогична таковой в способе-прототипе и выражают в тех же величинах, т.е. в процентах, а именно:At the same time, the final calculation of BASK is carried out according to the formula, which in its essence is similar to that in the prototype method and is expressed in the same quantities, i.e. in percent, namely:
где ∑импК - сумма импульсов испускаемых бактериальной суспензией в контроле, ∑импО - сумма импульсов испускаемых бактериальной суспензией в опыте.where ∑imp is the sum of the pulses emitted by the bacterial suspension in the control, ∑imp is the sum of the pulses emitted by the bacterial suspension in the experiment.
Возможность получения технического результата при выполнении перечисленных действий в указанных интервалах значений определяется следующим комплексом причинно-следственных связей:The ability to obtain a technical result when performing the above actions in the indicated ranges of values is determined by the following complex of cause-effect relationships:
1) выраженность бактерицидного эффекта сыворотки крови в отношении серо чувствительных спонтанно люминесцирующих микроорганизмов (как природного изолята Photobacterium phosphoreum В 17677 F, так и генно-инженерного штамма Escherichia coli Z 905, несущего плазмиду pPHL 7 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi), регистрируемого с использованием способа-прототипа по интенсивности подавления роста в жидкой питательной среде с фото нефелометрической регистрацией результата, прямо пропорциональна уровню снижения их спонтанной люминесценции (коэффициент корреляции r=0,96; t=7,11; P<0,001), что является главным обоснованием возможности использования серо чувствительных люминесцирующих бактерий для тестирования бактерицидной активности сыворотки крови с использованием биолюминометрии;1) the severity of the bactericidal effect of blood serum in relation to gray-sensitive spontaneously luminescent microorganisms (both the natural isolate of Photobacterium phosphoreum B 17677 F and the genetic engineering strain Escherichia coli Z 905 carrying the plasmid pPHL 7 with genes of the luminescent Photobacterium leiognathi system) of the prototype method in terms of the intensity of growth inhibition in a liquid nutrient medium with photo-nephelometric recording of the result, is directly proportional to the level of decrease in their spontaneous luminescence (correlation coefficient radiation r = 0.96; t = 7.11; P <0.001), which is the main justification for the possibility of using gray-sensitive luminescent bacteria to test the bactericidal activity of blood serum using bioluminometry;
2) наибольшая чувствительность к бактерицидному действию сыворотки крови с использованием как заявляемого способа, так и способа-прототипа, по сравнению с Р. phosphoreum В 17677 F продемонстрирована у E.coli Z 905, что определяет предпочтительность его использования при определении бактерицидной активности сыворотки крови;2) the greatest sensitivity to the bactericidal action of blood serum using both the proposed method and the prototype method, compared with P. phosphoreum B 17677 F demonstrated in E. coli Z 905, which determines the preference for its use in determining the bactericidal activity of blood serum;
3) зависимость интенсивности бактерицидного эффекта и подавления бактериальной люминесценции от концентрации сыворотки крови имеет S-образный характер со значением БАСК в отношении E.coli Z 905 на уровне 40-60% при использовании сыворотки крови в концентрации 25% от общего объема реакционной смеси, что диктует целесообразность использования именно этой концентрации, как позволяющей оценить наибольшую вариабельность БАСК вокруг ее “средних” значений.3) the dependence of the intensity of the bactericidal effect and the suppression of bacterial luminescence on the concentration of blood serum is S-shaped with a BASK value in relation to E. coli Z 905 at a level of 40-60% when using blood serum at a concentration of 25% of the total reaction mixture, which dictates the expediency of using this particular concentration, as it allows one to estimate the highest variability of BASK around its “average” values.
4) при проведении сравнительного изучения БАСК в серии из 100 сывороток с использованием заявляемого способа и способа-прототипа установлено соответствие результатов, полученных обоими методами (достоверная положительная корреляционная связь с коэффициентом r=0,556; t=3,48; P=0,002), что позволяет использовать заявляемый способ для изучения всех ранее выявленных закономерностей изменения БАСК при различных физиологических и патологических состояниях.4) when conducting a comparative study of BASK in a series of 100 sera using the proposed method and the prototype method, the results obtained by both methods were found to be consistent (reliable positive correlation with the coefficient r = 0.556; t = 3.48; P = 0.002), which allows you to use the inventive method to study all previously identified patterns of changes in BASK in various physiological and pathological conditions.
В целом, резюмируя приведенные выше материалы о сущности заявляемого способа, характеристике действий, порядке их выполнения и условия осуществления, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и по этому показателю должен быть оценен как соответствующий критерию “изобретательский уровень”.In general, summarizing the above materials about the essence of the proposed method, the characteristics of the actions, the order of their implementation and the conditions for implementation, it can be stated that the claimed method does not follow from the prior art and should be evaluated as meeting the criterion of “inventive step”.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.Information confirming the possibility of carrying out the invention.
Для определения бактерицидной активности крови одним из общепринятых методов в стерильных (асептичных) условиях осуществляют забор 1-2 мл венозной крови без консерванта и после ретракции сгустка отбирают верхнюю прозрачную часть (сыворотку) крови.To determine the bactericidal activity of blood, one of the generally accepted methods under sterile (aseptic) conditions is sampling 1-2 ml of venous blood without a preservative, and after retraction of the clot, the upper transparent part (serum) of the blood is taken.
В дальнейшем последовательность выполнения действий при осуществлении заявляемого способа, их условия и режимы являются следующими:In the future, the sequence of actions during the implementation of the proposed method, their conditions and modes are as follows:
1) Готовят суспензию живых серочувствительных люминесцирующих бактерий с концентрацией 109 КОЕ/мл. При выполнении способа по п.2 формулы изобретения в качестве серо чувствительной люминесцирующей бактерии используют генно-инженерный штамм E.coli Z 905, несущий плазмиду pPHL 7 с генами люминесцентной системы Р.leiognathi.1) Prepare a suspension of live sulfur-sensitive luminescent bacteria with a concentration of 10 9 CFU / ml When performing the method according to claim 2, as a gray-sensitive luminescent bacterium, a genetically engineered strain of E. coli Z 905 carrying the plasmid pPHL 7 with the genes of the luminescent system P. leiognathi is used.
Помимо использования данной бактериальной культуры, предварительно перед проведением исследования выращенной на среде Эндо в течение 18-24 часов при 37°С, технология выполнения выполнении заявляемого способа предполагает использование лиофилизированного препарата этой бактерии под коммерческим названием “Микробиосенсор E.coli Z 905”. В этом случае до начала исследования флакон с охлажденной лиофилизированной культурой светящихся бактерий Е.coli Z 905 выдерживают в течении 30-40 минут при температуре 37°С, после чего в него вносят 2 мл 0,9% раствора хлористого натрия и содержимое флакона перемешивают. Суспензию выдерживают при температуре 37°С в течении 45 минут с целью реактивации и стабилизации биолюминесценции, после чего она пригодна к использованию.In addition to using this bacterial culture, prior to conducting the study grown on Endo medium for 18-24 hours at 37 ° C, the technology for performing the proposed method involves the use of a lyophilized preparation of this bacterium under the commercial name “E.coli Z 905 Microbiosensor”. In this case, before the start of the study, the vial with a cooled lyophilized culture of luminous bacteria E. coli Z 905 is kept for 30-40 minutes at a temperature of 37 ° C, after which 2 ml of a 0.9% sodium chloride solution are added and the contents of the vial are mixed. The suspension is maintained at a temperature of 37 ° C for 45 minutes in order to reactivate and stabilize bioluminescence, after which it is suitable for use.
2) В “опытную” и “контрольную” кюветы вносят по 20 мкл суспензии серочувствительных люминесцирующих бактерий с концентрацией 109 КОЕ/мл, после чего в “контрольную кювету” вносят 20 мкл 0,9% раствора хлористого натрия, а в “опытную” 20 мкл тестируемой сыворотки крови, предварительно в соотношении 1:1 разбавленной 0,9% раствора хлорида натрия.2) 20 μl of a suspension of sulfur-sensitive luminescent bacteria with a concentration of 10 9 CFU / ml are added to the “experimental” and “control” cuvettes, after which 20 μl of a 0.9% sodium chloride solution is added to the “control cuvette” and to the “experimental” 20 μl of test blood serum, previously in a 1: 1 ratio diluted with 0.9% sodium chloride solution.
3) Кюветы инкубируют в термостате 30 минут при 37°С.3) The cells are incubated in an incubator for 30 minutes at 37 ° C.
4) В “опытную” и “контрольную” кюветы добавляют по 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия.4) Add 1 ml of 0.9% sodium chloride solution to the “experimental” and “control” cuvettes.
5) Кюветы помещают в измерительные ячейки биолюминометра и замеряют уровень свечения в видимой сине-зеленой области спектра при 420-600 нм в течение 30 сек.5) The cuvettes are placed in the measuring cells of the bioluminometer and the level of luminescence is measured in the visible blue-green region of the spectrum at 420-600 nm for 30 sec.
6) Производят расчет бактерицидной активности исследуемой сыворотки крови по формуле6) Calculate the bactericidal activity of the test blood serum according to the formula
где ∑импК - сумма импульсов испускаемых бактериальной суспензией в контроле, ∑импО - сумма импульсов испускаемых бактериальной суспензией в опыте.where ∑ impO is the sum of the pulses emitted by the bacterial suspension in the control, ∑ impO is the sum of the pulses emitted by the bacterial suspension in the experiment.
Пример 1.Example 1
В ожоговое отделение Муниципальной городской клинической больницы № 5 г. Оренбурга 21.12.02 г. около 16.00 поступил пациент А. с обширным ожогом правого бедра II Б степени. Для определения иммунного статуса с целью прогнозирования и течения болезни и ее возможной коррекции у пациента А. был осуществлен забор венозной крови в количестве 10 мл. В частности, в качестве интегрального показателя неспецифической противоинфеционной резистентности предполагалось определение бактерицидной активности сыворотки крови. Однако, ввиду значительной длительности (3 часа) определения БАСК фото нефелометрическим методом, данное исследование было отложено до утра следующего дня, для чего небольшое количество сыворотки (2 мл) было заморожено. Экспрессное определение уровня БАСК было осуществлено с помощью альтернативного метода, основанного на использовании биолюминометрии.In the burn department of the Municipal City Clinical Hospital No. 5 of Orenburg on 12/21/02, at about 4 p.m., patient A. was admitted with an extensive burn of the right thigh, II B degree. To determine the immune status in order to predict the course of the disease and its possible correction in patient A., venous blood was collected in an amount of 10 ml. In particular, the determination of the bactericidal activity of blood serum was assumed as an integral indicator of nonspecific anti-infection resistance. However, due to the considerable duration (3 hours) of BASK determination by the nephelometric method, this study was postponed until the next morning, for which a small amount of serum (2 ml) was frozen. Rapid determination of the BASK level was carried out using an alternative method based on the use of bioluminometry.
При выполнении данного исследования 20 мкл. сыворотки пациента А., предварительно разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:1 было помещено в измерительную кювету, туда же добавили 20 мкл суспензии люминесцирующих бактерий (E.coli Z 905) в концентрации 109 КОЕ/мл. В контрольную измерительную кювету было помещено 20 мкл физиологического раствора и 20 мкл суспензии тех же люминесцирующих бактерий. После 30-минутной инкубации в термостате при 37°С в каждую из измерительных кювет было добавлено по 1 мл. физиологического раствора. Кюветы с образцами поместили в прибор регистрирующий биологическое свечение - биолюминометр БЛМ 8802 (СКТБ “Наука”, Красноярск) и замерили уровень люминесценции в контроле и опыте.When performing this study, 20 μl. serum of patient A., previously diluted with physiological saline in a ratio of 1: 1, was placed in a measuring cell, 20 μl of a suspension of luminescent bacteria (E. coli Z 905) at a concentration of 10 9 CFU / ml was added there. 20 μl of physiological saline and 20 μl of a suspension of the same luminescent bacteria were placed in a control measuring cell. After a 30-minute incubation in a thermostat at 37 ° C, 1 ml was added to each of the measuring cuvettes. saline solution. The sample cuvettes were placed in a device that recorded biological glow - a BLM 8802 bioluminometer (SKTB Nauka, Krasnoyarsk) and measured the luminescence level in the control and experiment.
После расчета полученных результатов по формуле:After calculating the results obtained by the formula:
где ∑импК - сумма импульсов испускаемых бактериальной суспензией в контроле, ∑импО - сумма импульсов испускаемых бактериальной суспензией в опыте, уровень БАСК оказался равным 17%, что позволило оценить его как “низкий”.where ∑ impO is the sum of impulses emitted by the bacterial suspension in the control, ∑ impO is the sum of impulses emitted by the bacterial suspension in the experiment, the BASK level turned out to be 17%, which made it possible to evaluate it as “low”.
В связи с тем что у пациента А. была выявлена низкая противоинфекционная защита организма, уже через час после поступления в ожоговое отделение ему было сделано переливание 400 мл плазмы крови с целью повышения уровня БАСК.Due to the fact that patient A. was found to have low anti-infection protection of the body, just an hour after entering the burn department, he received a transfusion of 400 ml of blood plasma in order to increase the level of BASK.
На следующий день замороженную накануне сыворотку пациента А. исследовали на бактерицидную активность фотонефелометрическим методом, который подтвердил правильность результатов полученных при использовании биолюминометрии (уровень БАСК=15%).The next day, the serum of patient A, frozen the day before, was examined for bactericidal activity by the photonephalometric method, which confirmed the correctness of the results obtained using bioluminometry (BASK level = 15%).
Таким образом, положительный эффект от использования способа проявился в экспрессности получения результатов определения БАСК, что позволило провести оперативную коррекцию комплекса лечебных мероприятий.Thus, the positive effect of the use of the method was manifested in the rapidity of obtaining the results of the determination of BASK, which allowed for prompt correction of the complex of therapeutic measures.
Пример 2.Example 2
Фирма, выпускающая биологически активные добавки для домашних животных, разработала новый препарат “Z”, добавление которого в рацион должно вызывать не только прирост живого веса, но и увеличение уровня неспецифической противоинфекционной резистентности организма животного.A company producing biologically active additives for pets has developed a new drug “Z”, the addition of which to the diet should not only increase live weight, but also increase the level of non-specific anti-infection resistance of the animal’s body.
Для исследования препарата “Z” на базе хозяйств “Самородово” и “Пригородный”, было отобрано 90 кроликов породы “Великан” (45 опытных и 45 контрольных), 90 поросят крупной белой породы (45 опытных и 45 контрольных) и 90 телят черно-пестрой породы (45 опытных и 45 контрольных). Каждый день животные взвешивались, каждые пять дней осуществлялся забор крови для определения комплекса факторов естественной противоинфекционной резистентности, в том числе уровня бактерицидной активности сыворотки крови.To study the preparation “Z” on the basis of Samorodovo and Prigorodny farms, 90 Velikan rabbits were selected (45 experimental and 45 control), 90 large white piglets (45 experimental and 45 control) and 90 black-calf motley breed (45 experimental and 45 control). Every day the animals were weighed, blood was taken every five days to determine the complex of factors of natural anti-infection resistance, including the level of bactericidal activity of blood serum.
Определение БАСК проводили с помощью люминесцирующих бактерий (“Микробиосенсор E.coli Z 905”). Сыворотки крови 90 исследуемых животных (45 получавших + 45 не получавших препарат “Z”), предварительно разведенные физиологическим раствором в соотношении 1:1, в объеме 20 мкл помещались в микропланшету на 96 лунок; в оставшиеся 6 лунок вносили физиологический раствор в объеме 20 мкл (контроль). После этого во все лунки добавляли по 20 мкл люминесцирующих бактерий. Планшету с пробами выдерживали в течение 30 минут при 37°С и после внесения в лунки разбавляющего физиологического раствора помещали в люминоскан “Ascent” (Thermo Labsystems), регистрирующий биологическое свечение в планшетах.The determination of BASK was carried out using luminescent bacteria (“E.coli Z 905 Microbiosensor”). The blood serum of 90 test animals (45 receiving + 45 not receiving the drug “Z”), previously diluted with saline in a ratio of 1: 1, in a volume of 20 μl was placed in a 96-well microplate; in the remaining 6 wells, physiological saline was added in a volume of 20 μl (control). After that, 20 μl of luminescent bacteria were added to all wells. The sample plate was kept for 30 minutes at 37 ° C and, after the dilution of physiological saline was added to the wells, it was placed in an Ascent luminoscan (Thermo Labsystems), which recorded the biological glow in the plates.
С использованием предварительно записанной в программу люминоскана формулыUsing the formula previously recorded in the luminoscan program
где ∑импК - сумма импульсов испускаемых бактериальной суспензией в контроле, ∑импО - сумма импульсов испускаемых бактериальной суспензией в опыте, рассчитывали БАСК в сравниваемых группах животных. Полученные данные позволили констатировать стабильное и достоверное повышение уровня БАСК в двух из трех групп лабораторных животных, что явилось дополнительным аргументом в пользу использования препарата “Z” в ветеринарной практике.where ∑imp is the sum of pulses emitted by the bacterial suspension in the control, ∑imp is the sum of pulses emitted by the bacterial suspension in the experiment, BASK was calculated in the compared groups of animals. The data obtained allowed us to establish a stable and significant increase in the level of BASK in two of the three groups of laboratory animals, which was an additional argument in favor of the use of the drug “Z” in veterinary practice.
В целом определение БАСК 90 животных заявляемым способом заняло менее 1 часа.In General, the definition of BASK 90 animals of the claimed method took less than 1 hour.
Таким образом, положительный результат, полученный при использовании заявляемого способа, выступает в виде сокращения длительности выполнения процедуры определения бактерицидной активности крови и уменьшения его трудоемкости.Thus, a positive result obtained using the proposed method, appears in the form of a reduction in the duration of the procedure for determining the bactericidal activity of the blood and reduce its complexity.
Источники информации, в которых содержатся сведения об аналогах изобретенияSources of information that contain information about analogues of the invention
1. Бухарин О.В., Созыкин В.Л. Фотонефелометрический метод определения бактерицидной активности сыворотки крови // Факторы естественного иммунитета. - Оренбург, 1979. - С.43-45.1. Bukharin O. V., Sozykin V. L. Photonephalometric method for determining the bactericidal activity of blood serum // Factors of natural immunity. - Orenburg, 1979.- P.43-45.
2. Евтушенко А.Д., Тимохина Т.Х., Аргунова Г.А. Модифицированный способ бактериологического определения бактерицидной активности сыворотки крови // Лаб. дело. - 1982. - № 12. - С.41-42.2. Evtushenko A.D., Timokhina T.Kh., Argunova G.A. A modified method of bacteriological determination of bactericidal activity of blood serum // Lab. a business. - 1982. - No. 12. - P.41-42.
3. Красильников А.П., Титов Л.П. Определение бактерицидной активности сыворотки крови методом реплик // Лаб. дело. - 1981. - № 4. - С.245-247.3. Krasilnikov A.P., Titov L.P. Determination of bactericidal activity of blood serum by the replica method // Lab. a business. - 1981. - No. 4. - S.245-247.
4. Слоним А.А., Толчеев Ю.Д. Определение бактерицидной активности сыворотки крови и лимфы // Лаб. дело. - 1989. - № 7. - С.65-66.4. Slonim A.A., Tolcheev Yu.D. Determination of bactericidal activity of blood serum and lymph // Lab. a business. - 1989. - No. 7. - S.65-66.
5. Смирнова О.В., Кузьмина Т.А. Определение бактерицидной активности сыворотки крови методом фото нефелометрии // Ж. микробиол. - 1966. - № 4. - С.8-11.5. Smirnova OV, Kuzmina T.A. Determination of bactericidal activity of blood serum by photo nephelometry // J. Microbiol. - 1966. - No. 4. - S.8-11.
6. Смирнова О.В. Кузьмина Т.Д., Исиченко И.Б. По поводу критических замечаний относительно метода определения бактерицидной активности сыворотки крови при использовании фотонефелометра // Лаб. дело. - 1981. - № 10. - С.626-628.6. Smirnova OV Kuzmina T.D., Isichenko I.B. Regarding critical comments regarding the method for determining the bactericidal activity of blood serum using a photonephalometer // Lab. a business. - 1981. - No. 10. - S.626-628.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003101778/15A RU2247987C2 (en) | 2003-01-22 | 2003-01-22 | Method for detecting bactericide activity of blood serum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003101778/15A RU2247987C2 (en) | 2003-01-22 | 2003-01-22 | Method for detecting bactericide activity of blood serum |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003101778A RU2003101778A (en) | 2004-07-27 |
| RU2247987C2 true RU2247987C2 (en) | 2005-03-10 |
Family
ID=35365005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003101778/15A RU2247987C2 (en) | 2003-01-22 | 2003-01-22 | Method for detecting bactericide activity of blood serum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2247987C2 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2489489C1 (en) * | 2011-12-26 | 2013-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Оренбургский государственный университет" | Method to determine bactericide properties of blood serum |
| RU2497128C2 (en) * | 2011-12-30 | 2013-10-27 | Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Сибирский Федеральный Университет" | Method for simultaneous determination of two analytes via bioluminescent molecular microanalysis |
| RU2603104C2 (en) * | 2013-11-12 | 2016-11-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства Российской академии сельскохозяйственных наук | Method of biochemiluminescent assessment of rumen fluid toxicity in vitro |
| RU2686337C1 (en) * | 2018-07-03 | 2019-04-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) | Method of determining antimicrobial activity of whole serum and fraction of its antimicrobial peptides |
| WO2020062377A1 (en) * | 2018-09-26 | 2020-04-02 | 南京工业大学 | Method for predicting corrosion and spontaneous combustion of sulfur-related petrochemical equipment |
-
2003
- 2003-01-22 RU RU2003101778/15A patent/RU2247987C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БУХАРИН О.В. и др. Фотонефелометрический метод определения бактерицидной активности сыворотки крови. Факторы естесственного иммунитета. Оренбург, 1979, с. 43-45. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2489489C1 (en) * | 2011-12-26 | 2013-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Оренбургский государственный университет" | Method to determine bactericide properties of blood serum |
| RU2497128C2 (en) * | 2011-12-30 | 2013-10-27 | Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Сибирский Федеральный Университет" | Method for simultaneous determination of two analytes via bioluminescent molecular microanalysis |
| RU2603104C2 (en) * | 2013-11-12 | 2016-11-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства Российской академии сельскохозяйственных наук | Method of biochemiluminescent assessment of rumen fluid toxicity in vitro |
| RU2686337C1 (en) * | 2018-07-03 | 2019-04-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) | Method of determining antimicrobial activity of whole serum and fraction of its antimicrobial peptides |
| WO2020062377A1 (en) * | 2018-09-26 | 2020-04-02 | 南京工业大学 | Method for predicting corrosion and spontaneous combustion of sulfur-related petrochemical equipment |
| US11428654B2 (en) | 2018-09-26 | 2022-08-30 | Nanjing Tech University | Method for predicting corrosion and spontaneous combustion of sulfur-related petrochemical equipment |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Camell et al. | Aging induces an Nlrp3 inflammasome-dependent expansion of adipose B cells that impairs metabolic homeostasis | |
| Lawrence | Heberden Oration, 1969. Rheumatoid arthritis--nature or nurture? | |
| Li et al. | Burden and viability of Borrelia burgdorferi in skin and joints of patients with erythema migrans or Lyme arthritis | |
| Segovia et al. | Flow cytometric evaluation of antibiotic effects on viability and mitochondrial function of refrigerated spermatozoa of Nile tilapia | |
| Breitschwerdt et al. | PCR amplification of Bartonella koehlerae from human blood and enrichment blood cultures | |
| ES2431291T3 (en) | Methods to modulate cell surface receptors to prevent or reduce inflammation | |
| Jürgenschellert et al. | Occurrence of strongylid nematode parasites on horse farms in Berlin and Brandenburg, Germany, with high seroprevalence of Strongylus vulgaris infection | |
| Alexander et al. | Urinary ethanol and diabetes mellitus | |
| US8993332B2 (en) | Method for characterising the biological activity of helminth eggs, in particular Trichuris eggs | |
| RU2247987C2 (en) | Method for detecting bactericide activity of blood serum | |
| Vlasschaert et al. | Clonal hematopoiesis of indeterminate potential is associated with acute kidney injury | |
| Lalramhluna et al. | Parasitological and immunological response to Haemonchus contortus infection: Comparison between resistant Garole and susceptible Sahabadi sheep | |
| Labelle et al. | Effects of ophthalmic disease on concentrations of plasma fibrinogen and serum amyloid A in the horse | |
| Fitz et al. | Clinical management of gastrointestinal disease in the common marmoset (Callithrix jacchus) | |
| RU2686337C1 (en) | Method of determining antimicrobial activity of whole serum and fraction of its antimicrobial peptides | |
| RU2366953C2 (en) | Biochemiluminescent method for evaluation of phagocytic activity of neutrophils | |
| Eisenberg et al. | Chronic wasting associated with Chlamydia pneumoniae in three ex situ breeding facilities for tropical frogs | |
| RU2489489C1 (en) | Method to determine bactericide properties of blood serum | |
| RU2315113C2 (en) | Method for diagnosis of sensitivity of mycobacterium tuberculosis to antituberculosis preparations | |
| RU2689359C1 (en) | Method for determining the bactericidal properties of materials | |
| RU2657430C2 (en) | Method of life-time diagnostics of mycobacteriosis of large cattle | |
| RU2688117C1 (en) | Method for evaluating pro- and antimicrobial properties of samples | |
| US20020009765A1 (en) | Method for assessing viability of live microbial therapeutic agents | |
| RU2603104C2 (en) | Method of biochemiluminescent assessment of rumen fluid toxicity in vitro | |
| RU2786802C1 (en) | Method for determining the activity of lysozyme in the oral fluid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060123 |