RU2657430C2 - Method of life-time diagnostics of mycobacteriosis of large cattle - Google Patents
Method of life-time diagnostics of mycobacteriosis of large cattle Download PDFInfo
- Publication number
- RU2657430C2 RU2657430C2 RU2016141010A RU2016141010A RU2657430C2 RU 2657430 C2 RU2657430 C2 RU 2657430C2 RU 2016141010 A RU2016141010 A RU 2016141010A RU 2016141010 A RU2016141010 A RU 2016141010A RU 2657430 C2 RU2657430 C2 RU 2657430C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cattle
- tuberculosis
- mycobacteriosis
- diagnosis
- mycobacteria
- Prior art date
Links
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 9
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000009313 farming Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 8
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 8
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 description 1
- 241000187481 Mycobacterium phlei Species 0.000 description 1
- 241000187490 Mycobacterium scrofulaceum Species 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N o-dicarboxybenzene Natural products OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000018040 scab formation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится медицине и ветеринарии, а именно к разделу иммунологии, для прижизненной диагностики микобактериозов и дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД-туберкулин для млекопитающих. М.И. Гулюкин, А.Х. Найманов, Г.И. Устинова и др. разработали аллерген из атипичных микобактерий. Способ включает выращивание культур атипичных микобактерий на жидкой питательной среде, инактивацию культур автоклавированием при 120° в течение 30 минут, осаждение белка из культурального фильтрата каждого штамма в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной 4% концентрации, переосаждение его сернокислым аммонием при 50% насыщении, диализ раствора белка через целлофановую оболочку против обессоленной воды для удаления солей, определение активности раствора белка каждой культуры атипичных микобактерий, смешивание растворов белка в равных долях по содержанию ЕД, стерилизирующую фильтрацию раствора, расфасовку и лиофилизацию. При этом в качестве культур микобактерий используют М. intracellularae, М. scrofulaceum, M. fortuitum и M. smegmatis, а выращивание культур атипичных микобактерий на жидкой питательной среде осуществляют в течение 2-3 недель (патент 2443428, Россия, МПК, A61K 39/04, A61K 39/35, ВИЭВ).The invention relates to medicine and veterinary medicine, namely to the immunology section, for the intravital diagnosis of mycobacteriosis and the differential diagnosis of para-allergic reactions in cattle for PPD-tuberculin for mammals. M.I. Gulyukin, A.Kh. Naimanov, G.I. Ustinova and others developed an allergen from atypical mycobacteria. The method includes growing cultures of atypical mycobacteria on a liquid nutrient medium, inactivating cultures by autoclaving at 120 ° for 30 minutes, precipitating the protein from the culture filtrate of each strain individually with trichloroacetic acid to a final 4% concentration, reprecipitating it with ammonium sulfate at 50% saturation, dialysis solution protein through a cellophane membrane against demineralized water to remove salts, determining the activity of the protein solution of each atypical mycobacteria culture, mixing protein solutions in equal shares in terms of the content of ED, sterilizing solution filtration, packaging and lyophilization. At the same time, M. intracellularae, M. scrofulaceum, M. fortuitum and M. smegmatis are used as mycobacterial cultures, and atypical mycobacteria cultures are grown on a liquid nutrient medium for 2-3 weeks (patent 2443428, Russia, IPC, A61K 39 / 04, A61K 39/35, VIEV).
Разработанный аллерген из атипичных микобактерий применяется in vivo в симультанной пробе с ППД-туберкулином для млекопитающих для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота при первичной постановке диагноза, а также для контроля за благополучием животных по туберкулезу в хозяйствах, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией атипичными микобактериями. Проба является групповой и дает возможность ориентироваться в ситуации по туберкулезу лишь в целом по стаду или группе (не менее 6 голов) исследуемых животных (Наставление по диагностике туберкулеза животных, 2002).The developed allergen from atypical mycobacteria is used in vivo in a simultaneous test with PPD-tuberculin for mammals for the diagnosis of tuberculosis in cattle during the initial diagnosis, as well as for monitoring the well-being of animals for tuberculosis in farms where reactions to tuberculin are caused by sensitization of atypical mycobacteria. The test is a group one and makes it possible to navigate the tuberculosis situation only as a whole for the herd or group (at least 6 animals) of the animals studied (Manual for the diagnosis of animal tuberculosis, 2002).
Классические культуральные и биохимические исследования на плотных питательных средах с оценкой скорости роста, морфологии колоний, пигментообразования, ферментативной активности и др. были единственными в течение многих лет для определения видов нетуберкулезных (атипичных) микобактерий (Макаревич Н.М., Рудой Н.М., Лотоцкая Р.А. и др. Диагностика заболеваний легких, вызванных нетуберкулезными микобактериями //10-й Всесоюзный съезд фтизиатров: Тезисы докладов. - Киев, 1986. - С. 85).Classical cultural and biochemical studies on solid nutrient media with an assessment of growth rate, colony morphology, pigment formation, enzymatic activity, etc. were the only ones for many years to determine the types of non-tuberculous (atypical) mycobacteria (N. Makarevich, N. M. Rudoy N. , Lototskaya R.A. et al. Diagnosis of lung diseases caused by non-tuberculous mycobacteria // 10th All-Union Congress of TB Specialists: Abstracts. - Kiev, 1986. - P. 85).
Для ускорения получения результатов бактериологического исследования и выделения большего числа культур микобактерий также используют методы культивирования микобактерий на жидких средах в системах Bactec MGIT и MB-bact (Heifets L. Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria // Semin. Respir. Car Med. - 2004 - Vol. 25. - P. 283-295).To speed up the results of bacteriological studies and isolate a larger number of mycobacterial cultures, methods of culturing mycobacteria on liquid media in the Bactec MGIT and MB-bact systems (Heifets L. Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria // Semin. Respir. Car Med. - 2004 - Vol. 25. - P. 283-295).
Известен комбинированный метод ускоренной бактериологической диагностики микобактериозов и туберкулеза с использованием модифицированных питательных сред и ПЦР (культурально-генетический метод), авторы Таллер Л.А., Ощепков В.Г., Секин Е.Ю., Янченко Т.А. Микобактерии высевали на модифицированные питательные среды СФД-1 и СФД-2, содержащие фитостимуляторы роста атипичных и патогенных микобактерий, на 5-й день после посева делали смывы и исследовали их в ПЦР. Производственное испытание проводили в сопоставлении с традиционными послеубойными методами диагностики: патологоанатомическим, бактериологическим и биологическим, предусмотренными в Наставлении по диагностике туберкулеза животных (2002). Применение данного метода позволяет сократить сроки постановки диагноза в сравнении с традиционными культуральным и биологическим методами в 6-20 раз (Таллер Л.А., Ошепков В.Г., Секин Е.Ю., Янченко Т.А., Слепченко А.Д. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - №9. -С. 67-69). Недостатком этого способа является затратность для изготовления специфических (моновидовых) праймеров и применение культурально-генетического способа с ПЦР только для посмертной диагностики.Known is a combined method of accelerated bacteriological diagnosis of mycobacteriosis and tuberculosis using modified culture media and PCR (cultural genetic method), the authors Taller L.A., Oshchepkov V.G., Sekin E.Yu., Yanchenko T.A. Mycobacteria were sown on modified nutrient media SFD-1 and SFD-2 containing phytostimulants for the growth of atypical and pathogenic mycobacteria, washings were made on the 5th day after sowing and examined by PCR. A production test was carried out in comparison with traditional post-mortem diagnostic methods: pathological, bacteriological and biological, as provided in the Manual for the diagnosis of animal tuberculosis (2002). The use of this method allows to reduce the time of diagnosis in comparison with traditional cultural and biological methods by 6-20 times (Taller L.A., Oshepkov V.G., Sekin E.Yu., Yanchenko T.A., Slepchenko A.D. Improving the laboratory diagnosis of cattle tuberculosis // Achievements of science and technology of the agro-industrial complex. - 2011. - No. 9.-S. 67-69). The disadvantage of this method is the cost for the production of specific (monovid) primers and the use of the cultural-genetic method with PCR only for post-mortem diagnostics.
Также известен пальпебральный метод туберкулинизации крупного рогатого скота. Этот метод применяют одновременно с внутрикожной туберкулиновой пробой для дифференциации специфических и параспецифических реакций при первичной постановке диагноза. Крупному рогатому скоту туберкулин вводят пальпебрально (в толщу века) в дозе 0,2 мл в нижнее веко, отступив от его края на 1,5-2 см. Учет и оценку реакции проводят через 72 часа после введения препарата. Оценку реакции проводят визуально, сравнивают веки в месте введения туберкулина и без введения туберкулина. Животных считают реагирующими на туберкулин при образовании ощутимой припухлости в месте введения препарата. На пальпебральную пробу реагирует только крупный рогатый скот, зараженный возбудителем бычьего или человеческого видов. Животные, инфицированные атипичными микобактериями, на пальпебральную пробу не реагируют (Наставление по диагностике туберкулеза животных, Москва, 2002).The palpebral method of cattle tuberculinization is also known. This method is used simultaneously with an intradermal tuberculin test to differentiate specific and paraspecific reactions during the initial diagnosis. For cattle, tuberculin is administered palpebrally (in the thickness of the eyelid) at a dose of 0.2 ml into the lower eyelid, departing from its edge by 1.5-2 cm. Accounting and assessment of the reaction is carried out 72 hours after administration of the drug. Evaluation of the reaction is carried out visually, the eyelids are compared at the injection site of tuberculin and without the introduction of tuberculin. Animals are considered responsive to tuberculin during the formation of a noticeable swelling at the injection site. Only cattle infected with a pathogen of bovine or human species react to a palpebral test. Animals infected with atypical mycobacteria do not respond to a palpebral test (Manual for the diagnosis of animal tuberculosis, Moscow, 2002).
Известен «Способ прижизненной диагностики туберкулеза» (см. патент РФ №2563617 от 25 августа 2015 г., G01N 33/49, G 21/76). Способ прижизненной диагностики туберкулеза включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, в качестве объекта исследований используется сыворотка от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, а инактивированную вакцину БЦЖ используют в качестве основного индуктора.The well-known "Method for the lifetime diagnosis of tuberculosis" (see RF patent No. 2563617 of August 25, 2015, G01N 33/49, G 21/76). The method for the intravital diagnosis of tuberculosis involves the determination of induced luminol-dependent chemiluminescence, the object of the study is serum from a cattle that are positive for PPD-tuberculin from tuberculosis-free farms, and the inactivated BCG vaccine is used as the main inducer.
Данный способ применяется для диагностики туберкулеза, поэтому он не позволяет с высокой степенью эффективности дифференцировать сенсибилизированных нетуберкулезными микобактериями от больных туберкулезом животных.This method is used for the diagnosis of tuberculosis, therefore, it does not allow with a high degree of efficiency to differentiate sensitized non-tuberculous mycobacteria from patients with tuberculosis animals.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности прижизненной диагностики микобактериозов, предотвращение необоснованного убоя продуктивных животных в хозяйствах различных форм собственности, в том числе фермерских и личных подсобных.The technical result of the proposed method is to increase the accuracy of intravital diagnosis of mycobacteriosis, preventing unreasonable slaughter of productive animals on farms of various forms of ownership, including farm and personal subsidiary.
Заявленный технический результат способа прижизненной диагностики микобактериозов крупного рогатого скота включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ), в качестве объекта исследований используют сыворотку от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, в качестве основного индуктора используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий.The claimed technical result of the method for the intravital diagnosis of cattle mycobacteriosis includes the determination of induced luminol-dependent chemiluminescence (CL), as the object of research, serum from a cattle positively reacting to PPD-tuberculin from tuberculosis-free farms is used, and a complex atypical allergen from the atypical is used as the main inducer mycobacteria.
Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств; получают сыворотку стандартным способом путем отстаивания крови в термостате, обводки образовавшегося сгустка и дальнейшего центрифугирования образовавшейся сыворотки. В качестве основного индуктора ХЛ используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ).The method is as follows: carry out blood sampling from a cattle positively responding to PPD-tuberculin from tuberculosis-free farms; serum is obtained in a standard way by settling blood in a thermostat, bypassing the resulting clot and further centrifuging the resulting serum. A complex allergen from atypical mycobacteria (KAM) is used as the main inducer of CL.
В плоскодонный 96-луночный планшет последовательно добавляли: 20 мкл раствор люминола, 50 мкл сыворотки, 50 мкл специфического индуктора (аллерген КАМ), стабилизирующий раствор для отрицательного контроля антигена 50 мкл, с последующей регистрацией спонтанной и индуцированной ХЛ.In a flat-bottomed 96-well plate, 20 μl of luminol solution, 50 μl of serum, 50 μl of a specific inducer (KAM allergen), a stabilizing solution for negative control of antigen of 50 μl, were added sequentially, followed by registration of spontaneous and induced CL.
Приготовление люминола - люминол-гидразид - 3 - фталевой кислоты, 40 мг люминола растворяли горячим (~95-98°С) раствором 0, 01 Н NaOH на дезинтеграторе MSE при амплитуде 16 microns до получения прозрачного раствора, в течение 7-10 мин. Определяли рН 7,2 и доводили общий объем до 20 мл 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного.Preparation of luminol - luminol hydrazide - 3 - phthalic acid, 40 mg of luminol was dissolved in a hot (~ 95-98 ° С) solution of 0.01 N NaOH on an MSE disintegrator at an amplitude of 16 microns to obtain a clear solution, for 7-10 minutes. The pH of 7.2 was determined and the total volume was adjusted to 20 ml with a 1-fold Hanks solution without phenol red.
Приготовление основного индуктора - комплексного аллергена из атипичных микобактерий (разведения).Preparation of the main inducer - a complex allergen from atypical mycobacteria (breeding).
Готовили разведения 1:50, 1:100 согласно «Схеме последовательного разведения сыворотки» (Ветеринарная лабораторная практика, 1963, Москва).Dilutions of 1:50, 1: 100 were prepared according to the “Scheme for Serial Dilution of Serum” (Veterinary Laboratory Practice, 1963, Moscow).
Для регистрации спонтанной и индуцированной хемилюминесценции использовали иммунохимический анализатор «Флюорофот» (ООО «СКБ «ПРОБАНАУЧПРРГБОР», Россия, г. Санкт-Петербург). Функционирование осуществляли под управлением подключаемой к анализатору ПЭВМ с программным управлением. Измеряли ХЛ монохроматического излучения находящейся в лунке жидкости (опытные и контрольные образцы), возникающего в результате химической реакции с участием люминофора фотоэлектронным умножителем (ФЭУ) в режиме значений интенсивности хемилюминесценции.To record spontaneous and induced chemiluminescence, the Fluorofot immunochemical analyzer (SKB PROBANAUCHPRRGBOR LLC, Russia, St. Petersburg) was used. The operation was carried out under the control of a PC connected to the analyzer with program control. The CL of monochromatic radiation of the liquid in the well was measured (experimental and control samples) resulting from a chemical reaction involving a phosphor by a photomultiplier tube (PMT) in the mode of chemiluminescence intensity values.
Регистрацию проводили в цифровых показателях - единицы счета числа фотонов (условные единицы, у.е.) при длине волны А, 460, 545, 642 нм. При интерпретации полученных результатов учитывали степень превышения уровня свечения опытной исследуемой пробы по сравнению с отрицательным контролем антигена.The registration was carried out in digital terms — units of counting the number of photons (arbitrary units, cu) at a wavelength of A, 460, 545, 642 nm. When interpreting the obtained results, the degree of excess of the luminescence level of the experimental test sample was taken into account in comparison with the negative antigen control.
При проведении экспериментов лабораторных животных содержали в условиях вивария, кормление осуществляли согласно «Правилам работы с использованием лабораторных животных» №755 от 12.08.1977 г.During the experiments, laboratory animals were kept in vivarium conditions, feeding was carried out in accordance with the "Rules for the Use of Laboratory Animals" No. 755 of 08/12/1977
Для изучения специфичности показаний ХЛ сыворотки крови с индуктором-антигеном КАМ проведена серия экспериментов на морских свинках, подобранных по принципу аналогов, зараженных музейными культурами атипичных микобактерий III (M.intracellularae) и IV (M. smegmatis+M. phlei) групп по классификации Раньона, как наиболее часто выделяемые в регионе Западной Сибири.To study the specificity of CL serum indications with the KAM inducer antigen, a series of experiments was conducted on guinea pigs, selected according to the principle of analogues infected with museum cultures of atypical mycobacteria III (M.intracellularae) and IV (M. smegmatis + M. phlei) groups according to the Runion classification as the most frequently distinguished in the region of Western Siberia.
Опыт. Две опытные группы морских свинок по 5 гол., на 4 срока взятия крови, заражали атипичными микобактериями M. intracellularae и M. smegmatis подкожно в дозе 40 мг /гол. в 1 мл растворителя, контрольной группе (5 здоровых морских свинок) вводили физиологический раствор в дозе 1 мл подкожно.Experience. Two experimental groups of guinea pigs of 5 goals each, for 4 periods of blood collection, were infected with atypical mycobacteria M. intracellularae and M. smegmatis subcutaneously at a dose of 40 mg / goal. in 1 ml of solvent, the control group (5 healthy guinea pigs) was injected with saline at a dose of 1 ml subcutaneously.
На 14-е, 28-е, 45-е, 60-е сутки после заражения от каждой опытной группы брали пробы крови, получали из нее сыворотку, определяли показатели ХЛ сыворотки крови опытных животных при взаимодействии со специфическим индуктором КАМ, взятым в разведениях 1:50, 1:100.On the 14th, 28th, 45th, and 60th day after infection, blood samples were taken from each experimental group, serum was obtained from it, the serum CL indicators of the experimental animals were determined in interaction with a specific KAM inducer taken in dilutions 1 : 50, 1: 100.
Установлено, что на 14-й день после заражения у животных обеих групп наблюдали всплеск уровня свечения ХЛ:It was established that on the 14th day after infection in animals of both groups there was a surge in the level of CL fluorescence:
1-я опытная группа М. intracellularae у 2-х голов из 5 (40%), К ст. (Коэффициент стимуляции) 40,0;The 1st experimental group M. intracellularae in 2 goals out of 5 (40%), K st. (Stimulation coefficient) 40.0;
2-я опытная группа M.smegmatis у 4-х из 5 (80%), К ст.от 2,2 до 44,2.The 2nd experimental group M.smegmatis in 4 out of 5 (80%), K st from 2.2 to 44.2.
При патологоанатомической экспертизе во внутренних органах в месте введения - уплотнение, кровоизлияния, увеличен регионарный лимфоузел у животных в обеих группах. При бактериологическом исследовании - рост заражающей культуры М. intracellularae в виде белых беспигментных колоний;When pathological examination in the internal organs at the injection site - compaction, hemorrhage, increased regional lymph node in animals in both groups. In bacteriological research - the growth of an infectious culture of M. intracellularae in the form of white pigmentless colonies;
M.smegmatis- роста нет.M.smegmatis - no growth.
На 28-й день после заражения: ХЛ:On the 28th day after infection: CL:
1-я опытная группа M. intracellularae у 4-х из 5 (80%), К ст. 12,5;The 1st experimental group M. intracellularae in 4 out of 5 (80%), K st. 12.5;
2-я опытная группа M. smegmatis у 4-х из 5 (80%), К ст. 44,2.The 2nd experimental group M. smegmatis in 4 out of 5 (80%), K st. 44.2.
У опытных свинок, зараженных М. intracellularae, в месте введения суспензии - кровоизлияния, во внутренних органах - лимфатические узлы увеличены, в печени - единичные или множественные туберкулезоподобные очажки, селезенка кровенаполнена.Experienced pigs infected with M. intracellularae have hemorrhages at the injection site of the suspension, lymph nodes in the internal organs are enlarged, single or multiple tuberculous foci in the liver, the spleen is blood-filled.
При бактериологическом исследовании биоматериала от опытных животных - рост заражающей культуры М. intracellularae в виде белых беспигментных колоний. У опытных свинок, зараженных M. smegmatis, в месте введения и внутренних органах нет изменений; при бактериологическом исследовании - роста нет.In bacteriological research of biomaterial from experimental animals, the growth of the M. intracellularae infecting culture in the form of white pigmentless colonies. In experimental pigs infected with M. smegmatis, there are no changes in the injection site and internal organs; with bacteriological research - no growth.
На 45-й день после заражения: ХЛ:On the 45th day after infection: CL:
1- я опытная группа М. intracellularae у 4-х из 4 (100%), К ст. 8,6;The 1st experimental group M. intracellularae in 4 out of 4 (100%), K st. 8.6;
2- я опытная группа M. smegmatis у 3-х из 3 (100%), К ст. 18,7.The 2nd experimental group M. smegmatis in 3 out of 3 (100%), K st. 18.7.
У опытных свинок, зараженных М. intracellularae, в месте введения суспензии - язвы, лимфатические узлы увеличены, в печени - единичные или множественные туберкулезоподобные очажки.In experimental pigs infected with M. intracellularae, ulcers are present at the injection site, ulcers, lymph nodes are enlarged, and single or multiple tuberculosis-like foci in the liver.
При бактериологическом исследовании биоматериала от опытных животных - рост заражающей культуры М. intracellularae в виде белых беспигментных колоний.In bacteriological research of biomaterial from experimental animals, the growth of the M. intracellularae infecting culture in the form of white pigmentless colonies.
У опытных свинок, зараженных M. smegmatis, в месте введения и внутренних органах практически нет изменений; при бактериологическом исследовании - роста нет.In experimental pigs infected with M. smegmatis, there are practically no changes in the injection site and internal organs; with bacteriological research - no growth.
На 60-й день после заражения: ХЛ:On the 60th day after infection: CL:
1-я опытная группа M. intracellularae у 5-х из 5 (100%), К ст. 13,5;The 1st experimental group M. intracellularae in 5 out of 5 (100%), K st. 13.5;
2-я опытная группа M. smegmatis у 5-х из 5 (100%), К ст. 9,0.The 2nd experimental group M. smegmatis in 5 out of 5 (100%), K st. 9.0.
У опытных свинок, зараженных М. intracellularae, в месте введения суспензии - струп, селезенка рыхлая, но не увеличена. При бактериологическом исследовании биоматериала от опытных животных - рост заражающей культуры М. intracellularae в виде белых беспигментных колоний.In experimental pigs infected with M. intracellularae, the scab at the injection site is scab, the spleen is loose, but not enlarged. In bacteriological research of biomaterial from experimental animals, the growth of the M. intracellularae infecting culture in the form of white pigmentless colonies.
У опытных свинок, зараженных M. smegmatis, в месте введения и внутренних органах практически нет изменений; при бактериологическом исследовании - роста нет.In experimental pigs infected with M. smegmatis, there are practically no changes in the injection site and internal organs; with bacteriological research - no growth.
В результате ХЛ исследований сыворотки крови морских свинок, экспериментально зараженных атипичными микобактериями III-IV групп по Раньону, установлено превышение уровня сверхслабого свечения опытных проб с КАМ над отрицательным контролем антигена в 2,2-9 и более раз с 14-го дня заражения.As a result of CL studies of the blood serum of guinea pigs experimentally infected with atypical mycobacteria of groups III-IV according to the Runion, it was found that the level of super-weak luminescence of experimental samples with KAM was higher than the negative antigen control by 2.2-9 times or more from the 14th day of infection.
Также положительный контроль с БЦЖ находился на уровне отрицательного контроля.Also, positive control with BCG was at the level of negative control.
У здоровых животных в контрольной группе во все сроки исследований результат отрицательный.In healthy animals in the control group, the result is negative for all periods of the study.
Таким образом, аллерген КАМ при использовании in vitro в ХЛ реакции с сывороткой крови морских свинок, экспериментально зараженных атипичными микобактериями, является специфичным. Способ позволяет сократить сроки постановки диагноза до 3-4 часов с момента доставки проб крови для исследований вместо 3 мес (Наставление по диагностике туберкулеза животных, Москва, 2002).Thus, the KAM allergen when used in vitro in the CL reaction with the blood serum of guinea pigs experimentally infected with atypical mycobacteria is specific. The method allows to reduce the time of diagnosis to 3-4 hours from the date of delivery of blood samples for research instead of 3 months (Manual for the diagnosis of animal tuberculosis, Moscow, 2002).
Особенно результативны показатели ХЛ в эксперименте на морских свинках, зараженных атипичными микобактериями IV группы по Раньону - пробы сыворотки опытных животных дали положительный результат в ХЛ от 80% до 100%, хотя при патологоанатомической экспертизе во внутренних органах не наблюдали выраженных туберкулезоподобных изменений, и не выделена исходная заражающая культура (в поздние сроки). Отсутствие роста при посеве органов подтверждает неспособность атипичных микобактерий именно IV группы, как условных сапрофитов, размножаться в организме животного, заражающая культура выделялась до 14-го дня после заражения.The CL indicators are especially effective in the experiment on guinea pigs infected with Runyon group IV atypical mycobacteria - serum samples of experimental animals gave a positive result in CL from 80% to 100%, although during pathoanatomical examination in the internal organs no pronounced tuberculous changes were observed, and no initial infectious culture (late). The lack of growth during organ sowing confirms the inability of atypical mycobacteria of precisely the IV group, as conditional saprophytes, to multiply in the body of the animal, the infectious culture was released until the 14th day after infection.
Достоверность результатов ХЛ исследований в опытах подтверждена результатами бактериологических исследований - из биоматериала опытных морских свинок выделяли исходную заражающую культуру до 14-го дня после заражения. При патологоанатомической экспертизе у опытных животных наблюдали в месте введения суспензии уплотнение или изъязвление с последующим заживлением и образованием струпа; во внутренних органах (селезенка, печень, легкие) наблюдали мелкие и средние туберкулезоподобные очаги без последующего прогрессирования.The reliability of the results of CL studies in the experiments was confirmed by the results of bacteriological studies - the initial infecting culture was isolated from the biomaterial of the experimental guinea pigs until the 14th day after infection. During postmortem examination in experimental animals, compaction or ulceration was observed at the injection site of the suspension, followed by healing and scab formation; in the internal organs (spleen, liver, lungs), small and medium tuberculosis-like lesions were observed without subsequent progression.
Пример. Научно-производственный опыт на крупном рогатом скоте, в котором была проверена специфичность показаний ХЛ сыворотки с КАМ.Example. Scientific and industrial experience in cattle, in which the specificity of the testimony of CL serum with KAM was verified.
Работа проведена в благополучном по туберкулезу хозяйстве, где регулярно выявляются положительно реагирующие на ППД-туберкулин коровы и нетели. В таблице представлены результаты комплексных исследований на туберкулез и микобактериозы поголовья крупного рогатого скота ООО «Булатовское» Куйбышевского района Новосибирской области.The work was carried out in a tuberculosis-free farm, where cows and heifers that respond positively to PPD-tuberculin are regularly detected. The table shows the results of comprehensive studies on tuberculosis and mycobacteriosis in cattle livestock of Bulatovskoye LLC in the Kuibyshevsky District of the Novosibirsk Region.
Из таблицы следует, что в данном хозяйстве в январе и июне 2012 г. проведено 1346 исследований крупного рогатого скота внутрикожной пробой ППД для млекопитающих. Положительно прореагировали на внутрикожную пробу 147 гол., из них дополнительно на пальпебральную пробу ППД - туберкулином - 21 гол. При контрольно-диагностическом убое и патологоанатомической экспертизе внутренних органов этих 21 гол. туберкулезных изменений не обнаружено.From the table it follows that in this farm in January and June 2012 1346 studies of cattle with an intradermal breakdown of PPD for mammals were conducted. 147 goals reacted positively to the intradermal test. Of these, 21 goals were additionally tested on the palpebral test PPD - tuberculin. With the control and diagnostic slaughter and pathological examination of the internal organs of these 21 goals. no tuberculous changes were found.
Отсутствие туберкулеза в данном хозяйстве также подтверждено отрицательными результатами биологической пробы на морских свинках и бактериологическими исследованиями 21 пробы послеубойного биоматериала - при посеве на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л культур патогенных микобактерий бычьего, человеческого, птичьего не выделено. Выделены атипичные микобактерии 3 и 4 групп по классификации Раньона. Также атипичные микобактерии выделены из проб кормов и от голубей, постоянно присутствующих на фермах.The absence of tuberculosis in this farm was also confirmed by the negative results of a biological test in guinea pigs and bacteriological studies of 21 samples of post-slaughter biomaterial - when sowing pathogenic mycobacteria of bovine, human, and bird cultures on dense nutrient media of Levenshtein-Jensen and Fast-3L. Atypical mycobacteria of groups 3 and 4 were identified according to the classification of Runion. Also, atypical mycobacteria are isolated from feed samples and from pigeons that are constantly present on farms.
Дополнительно, при исследовании ХЛ методом с индуктором КАМ 147 пробы сыворотки крови - индуцированная ХЛ составила 53,62 у.е., что более чем в 100 раз превышала интенсивность спонтанной ХЛ (отрицательный контроль) - 0,48 у.е., положительный контроль с БЦЖ - 0,17 у.е. (Р<0,001 уровень достоверно значимых различий между индуцированной ХЛ исследуемых проб и спонтанной ХЛ отрицательного контроля).Additionally, in the study of CL by the KAM 147 inducer of blood serum samples, the induced CL was 53.62 cu, which was more than 100 times higher than the intensity of spontaneous CL (negative control) - 0.48 cu, positive control with BCG - 0.17 cu (P <0.001 level of significantly significant differences between the induced CL of the studied samples and spontaneous CL of the negative control).
На основании проведенных комплексных ветеринарно-диагностических исследований в 2012 г. в ООО «Булатовское» Куйбышевского района Новосибирской области туберкулез крупного рогатого скота исключен. Установлена сенсибилизация крупного рогатого скота факторами нетуберкулезной этиологии, в частности атипичными микобактериями. Перманентная персистенция атипичных микобактерий, воспалительные процессы у животных вызывают сенсибилизацию и аллергизацию макроорганизма с последующей повышенной чувствительностью к ГТЛД-туберкулину (Ощепков В.Г. и др., Динамика возможного проявления неспецифических реакций на туберкулез у крупного рогатого скота в хозяйствах, благополучных по туберкулезу // Инфекционная патология животных: сборник трудов, Омск - 2001 - С. 211-215).Based on the comprehensive veterinary diagnostic tests carried out in 2012, Bulatovskoye LLC in the Kuibyshev district of the Novosibirsk Region excluded cattle tuberculosis. Cattle sensitization was established by factors of non-tuberculous etiology, in particular, atypical mycobacteria. Permanent persistence of atypical mycobacteria, inflammatory processes in animals cause sensitization and allergization of the macroorganism, followed by increased sensitivity to GTLD-tuberculin (Oshchepkov V.G. et al., Dynamics of the possible manifestation of nonspecific reactions to tuberculosis in cattle in tuberculosis-free farms / / Infectious pathology of animals: collection of works, Omsk - 2001 - S. 211-215).
Из 139 голов, потенциально подлежащих убою, согласно Наставлению по диагностике туберкулеза (2002), 119 сохранены для дальнейшего хозяйственного использования.Of the 139 heads that could be slaughtered, according to the Manual for the Diagnosis of Tuberculosis (2002), 119 were saved for further economic use.
Анализ показал, что в отличие от известного способа, использование в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий предлагаемого способа прижизненной диагностики микобактериозов позволяет повысить точность диагностики микобактериозов и туберкулеза у крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах, предотвратить необоснованный убой продуктивных животных в хозяйствах различных форм собственности, в том числе фермерских и личных подсобных.The analysis showed that, in contrast to the known method, the use of the proposed method for the intravital diagnosis of mycobacteriosis in the overall complex of anti-tuberculosis measures allows to increase the accuracy of diagnosis of mycobacteriosis and tuberculosis in cattle in tuberculosis-free farms, to prevent unreasonable slaughter of productive animals in farms of various forms of ownership, including farm and personal auxiliary.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016141010A RU2657430C2 (en) | 2016-10-18 | 2016-10-18 | Method of life-time diagnostics of mycobacteriosis of large cattle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016141010A RU2657430C2 (en) | 2016-10-18 | 2016-10-18 | Method of life-time diagnostics of mycobacteriosis of large cattle |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016141010A RU2016141010A (en) | 2018-04-18 |
| RU2657430C2 true RU2657430C2 (en) | 2018-06-13 |
Family
ID=61974609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016141010A RU2657430C2 (en) | 2016-10-18 | 2016-10-18 | Method of life-time diagnostics of mycobacteriosis of large cattle |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2657430C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2738133C1 (en) * | 2020-05-28 | 2020-12-08 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Омский аграрный научный центр" (ФГБНУ "Омский АНЦ") | Method of life-time diagnosis of cattle tuberculosis |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2538690C1 (en) * | 2013-09-25 | 2015-01-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) | Method of manufacturing allergen for differential diagnostics of para-allergic reactions in cattle to ppd tuberculin for mammals |
| RU2563617C2 (en) * | 2013-12-19 | 2015-09-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных" (ФГБНУ ВНИИБТЖ) | Method of life-time diagnostics of tuberculosis |
-
2016
- 2016-10-18 RU RU2016141010A patent/RU2657430C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2538690C1 (en) * | 2013-09-25 | 2015-01-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) | Method of manufacturing allergen for differential diagnostics of para-allergic reactions in cattle to ppd tuberculin for mammals |
| RU2563617C2 (en) * | 2013-12-19 | 2015-09-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных" (ФГБНУ ВНИИБТЖ) | Method of life-time diagnostics of tuberculosis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ОЩЕПКОВ В.Г. и др. Дифференциальная диагностика туберкулеза с применением хемилюминесцентного метода / Достижения науки и техники АПК, 2009, N 12, стр.41-44. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2738133C1 (en) * | 2020-05-28 | 2020-12-08 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Омский аграрный научный центр" (ФГБНУ "Омский АНЦ") | Method of life-time diagnosis of cattle tuberculosis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016141010A (en) | 2018-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Selden et al. | Central nervous system stem cell transplantation for children with neuronal ceroid lipofuscinosis | |
| Breitschwerdt et al. | PCR amplification of Bartonella koehlerae from human blood and enrichment blood cultures | |
| JP5661280B2 (en) | Cell fever test using toll-like receptors | |
| RU2657430C2 (en) | Method of life-time diagnostics of mycobacteriosis of large cattle | |
| RU2563617C2 (en) | Method of life-time diagnostics of tuberculosis | |
| Medvedev et al. | Introduction of effective biological stimulants affecting lactating cows: Using cyanoform | |
| Anusz et al. | Ante-mortem and post-mortem tuberculosis diagnostics in three European Bison (Bison bonasus caucasicus) from the enclosure in Bukowiec in the Bieszczady National Park in Poland | |
| RU2687553C1 (en) | Method of lifetime differential diagnosis of bovine tuberculosis and mycobacterioses | |
| Hülsdünker et al. | In vivo myeloperoxidase imaging and flow cytometry analysis of intestinal myeloid cells | |
| RU2538690C1 (en) | Method of manufacturing allergen for differential diagnostics of para-allergic reactions in cattle to ppd tuberculin for mammals | |
| RU2443428C1 (en) | Method for making allergen for differential diagnostics of para-allergic responses in cattles on ppd tuberculin for mammals | |
| Anusz et al. | Ante-mortem and post-mortem tuberculosis diagnostics in three European bison from the enclosure in Bukowiec in the Bieszczady National Park in Poland. | |
| RU2707539C2 (en) | Test strain leptospira interrogans serogroup canicola serovar canicola for detection of antibodies to l. canicola | |
| RU2738133C1 (en) | Method of life-time diagnosis of cattle tuberculosis | |
| RU2309681C1 (en) | Method for detecting noncultivated mycobacteria of tuberculosis in cattle | |
| RU2752978C1 (en) | Test strain leptospira interrogans of serogroup grippotyphosa of serovar grippotyphosa for detection of antibodies to l. grippotyphosa | |
| RU2567845C1 (en) | METHOD OF SEPARATION OF LARVAE T.canis BY METHOD OF DIGESTING LUNG AND LIVER PARENCHYMA OF CARNIVORES | |
| Heslop | Further Researches into the Serological Diagnosis of Contagious Pleuro-Pneumonia of Cattle | |
| WO2021225089A1 (en) | Method for elucidating correlation between irritant and produced substance | |
| RU2383891C1 (en) | Method of qualitative preliminary express-diagnostics of oncological diseases | |
| RU2642327C1 (en) | Method for prediction of pathogenetic process development for non-cultured or cultured type in experiment | |
| RU2489489C1 (en) | Method to determine bactericide properties of blood serum | |
| Nurlygayanova et al. | Diagnoses of Leptospirosis in Animals | |
| RU2605633C1 (en) | Method for producing allergen for differentiating dried purified tuberculine nonspecific reactions for mammals | |
| RU2737149C1 (en) | Method for long-term storage of leprosy mycobacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201019 |