RU2213972C1 - Способ определения состояния гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям одновременным выявлением igg антител - Google Patents
Способ определения состояния гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям одновременным выявлением igg антител Download PDFInfo
- Publication number
- RU2213972C1 RU2213972C1 RU2002124823/14A RU2002124823A RU2213972C1 RU 2213972 C1 RU2213972 C1 RU 2213972C1 RU 2002124823/14 A RU2002124823/14 A RU 2002124823/14A RU 2002124823 A RU2002124823 A RU 2002124823A RU 2213972 C1 RU2213972 C1 RU 2213972C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pathogenic bacteria
- antibodies
- optical density
- humoral immunity
- conditionally pathogenic
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния гуморального иммунитета при аутоиммунных заболеваниях и состояниях. Сущность изобретения заключается в том, что на твердый носитель с сорбированными на нем двенадцатью антигенами различных условно-патогенных бактерий наносят исследуемые и контрольную сыворотки в рабочем разведении 1:100 - 1:1600, проводят иммуноферментный анализ, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным антигенам условно-патогенных бактерий, определяют разность между величиной оптической плотности исследуемого образца и отрицательного контроля и при разности, большей или равной 0,3, определяют повышение активности гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям. Техническим результатом является определение активности гуморального иммунитета в отношении условно-патогенных бактерий. 6 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к методам иммуноферментного анализа антител к условно-патогенным бактериям, и может быть использовано для одновременного выявления IgG антител к антигенам условно-патогенных бактерий в сыворотке крови человека для определения состояния гуморального иммунитета.
Известен способ выявления высокоафинных поли- и моноклональных антител к водонерастворимым гаптенам путем инкубирования исследуемой пробы с антигеном, выделением полученного иммунного комплекса с последующей его детекцией, в качестве антигена используют соответствующее водонерастворимое поликонденсированное ароматическое или гетероциклическое соединение, предварительно конденсированное с радиоактивно меченным олигонуклеотидом (RU 2035189, А 61 К 39/116, опубл. 20.05.95).
Однако описанный способ предназначен только для выявления антител и обеспечения возможности выявлять высокоафинные антитела к водонерастворимым гаптенам.
Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности иммуноферментного анализа за счет одновременного выявления IgG антител к антигенам 12 видов условно-патогенных бактерий в сыворотке крови человека.
Для достижения указанного технического результата способ одновременного выявления IgG антител к антигенам условно-патогенных бактерий в сыворотке крови человека для определения состояния гуморального иммунитета заключается в том, что на твердый носитель с сорбированными на нем двенадцатью антигенами различных условно-патогенных бактерий наносят рабочие разведения исследуемых и контрольной сывороток, инкубируют при температуре 36-37oС в течение 55-60 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратно-индикаторную смесь, инкубируют при температуре 18-22oС в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным антигенам условно-патогенных бактерий и по величине разности их оптической плотности судят об активности иммунитета к каждому виду условно-патогенных бактерий, при этом при величине разности оптической плотности, большей или равной 0,3, результат считают положительным.
Кроме того, в качестве условно-патогенных бактерий берут: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sp., Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella minnesota Re, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae.
Кроме того, в качестве твердого носителя берут 96-луночный разборный полистироловый планшет.
Сущность изобретения поясняется на конкретном примере выполнения способа.
Пример. Проводят иммуноферментный анализ в сыворотке крови человека для одновременного выявления IgG антител к 12 антигенам условно-патогенных бактерий (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sp., Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella minnesota Re, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae). Выявление антител к антигенам условно-патогенных бактерий необходимо для определения гуморального иммунитета.
В предлагаемом способе применен принципиально новый подход, заключающийся в одновременном анализе антител сразу к 12 представителям условно-патогенных бактерий по величине разности оптической плотности между анализируемой сывороткой и отрицательным контролем в оптимальном для каждого представителя условно-патогенных бактерий рабочем разведении сывороток (от 1:1000 до 1:1600). В случае необходимости спектр антигенов может быть сужен или расширен.
Используемые реагенты:
(1) иммуносорбенты - планшеты полистирольные для иммуноферментного анализа однократного применения, разборные, по ТУ 64-2-50390. Каждые 2 стрипа в них сорбированы препаратами клеточных стенок (КС) одного из 12 представителей условно-патогенных бактерий.
(1) иммуносорбенты - планшеты полистирольные для иммуноферментного анализа однократного применения, разборные, по ТУ 64-2-50390. Каждые 2 стрипа в них сорбированы препаратами клеточных стенок (КС) одного из 12 представителей условно-патогенных бактерий.
(2) отрицательный контрольный образец (К -) - сухой, в ампуле содержит антитела к условно-патогенным бактериям ниже диагностического уровня. Получен смешением равных объемов 100 сывороток здоровых доноров - 1 амп., 0,1 мл.
(3) положительный контрольный образец (К+) - жидкий, пул не менее 12 сывороток крови, содержащий высокую активность антител к большинству условно-патогенных бактерий выше диагностического уровня - 1 фл., 0,1 мл.
(4) конъюгат (КГ) - антитела диагностические против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, сухие или жидкие по ТУ 42-14-276-82 - 1 фл. или 1 амп., 0,1-0,2 мл.
(5) хромоген (ОФД) - орто-фенилендиамин, таблетированный по ТУ 6-14-113-7095 - 1 фл., 2 табл.
(6) промывающий буферный раствор (ФСБ-Д)к - фосфатно-солевой буферный раствор, десятикратный концентрат с детергентом, рН 7,0-7,4, 1 фл., 100 мл.
(7) субстратная смесь ЦФБ-П - цитратно-фосфатный буферный раствор, рН 4,9-5,1 с перекисью водорода, 1 или 2 фл., 25 мл.
(8) стоп-реагент - 2М Н2SO4 (ГОСТ 4204-77).
Приготовление растворов для проведения анализа:
Раствор 1. Предназначен для приготовления рабочих разведений сывороток, конъюгата и отмывки планшетов. Его готовят разведением (ФСБ-Д)к в 10 раз дистиллированной водой (ГОСТ 6709-72) до объема 1,0 л. Хранят не более 3-х недель при температуре 4-8oС.
Раствор 1. Предназначен для приготовления рабочих разведений сывороток, конъюгата и отмывки планшетов. Его готовят разведением (ФСБ-Д)к в 10 раз дистиллированной водой (ГОСТ 6709-72) до объема 1,0 л. Хранят не более 3-х недель при температуре 4-8oС.
Раствор 2. К- растворяют в 0,1 мл дистиллированной воды при температуре 18-22oС. Раствор хранят не более 3-х недель при температуре 4-8oС.
Раствор 3. Сухой конъюгат растворяют в дистиллированной воде до объема, указанного на ампуле или флаконе. Условия растворения и хранения - как в растворе 2.
Раствор 4. Рабочий раствор конъюгата готовят разбавлением исходного жидкого конъюгата или раствора 3 раствором 1 до соотношения, указанного на этикетке. Раствор не хранят.
Раствор 5. Представляет собой субстратно-индикаторную смесь. Одну таблетку ОФД растворяют в 12,5 мл ЦФБ-П при периодическом перемешивании в темноте. После полного растворения таблетки раствор сразу же разливают по лункам.
Рабочие растворы сывороток. К-, К+, а также анализируемые сыворотки разводят раствором 1 до соотношения 1: 100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 во вспомогательных пробирках или на пластиковых панелях с лунками вместимостью 2,0 мл.
Последовательность операций
Вертикальные ряды каждого из 2-х планшетов помечены от 1 до 12. В стрипах под 1 сорбированы антигены Staphylococcus aureus, 2 - Staphylococcus epidermidis, 3 - Staphylococcus saprophyticus, 4 - Streptococcus pneumoniae, 5 - Streptococcus sp., 6 - Micrococcus luteus, 7 - Pseudomonas aeruginosa, 8 - Escherichia coli, 9 - Proteus vulgaris, 10 - Salmonella minnesota Re, 11 - Haemophilus influenzae, 12 - Kebsiella pneumoniae.
Вертикальные ряды каждого из 2-х планшетов помечены от 1 до 12. В стрипах под 1 сорбированы антигены Staphylococcus aureus, 2 - Staphylococcus epidermidis, 3 - Staphylococcus saprophyticus, 4 - Streptococcus pneumoniae, 5 - Streptococcus sp., 6 - Micrococcus luteus, 7 - Pseudomonas aeruginosa, 8 - Escherichia coli, 9 - Proteus vulgaris, 10 - Salmonella minnesota Re, 11 - Haemophilus influenzae, 12 - Kebsiella pneumoniae.
Отмывка иммуносорбента. В лунки планшета вносят раствор 1 в объеме не менее 0,2 мл, выдерживают при комнатной температуре в течение 2-6 мин. Затем содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 2 раза.
Внесение рабочих растворов сывороток. Для контроля конъюгата в первую лунку каждого вертикального ряда вносят по 0,1 мл раствора 1. В одну лунку вносят рабочее разведение К+, рабочее разведение К- вносят в две следующие лунки в том же объеме 0,1 мл. Каждый образец анализируемой сыворотки вносят в необходимом разведении в соседние лунки планшета.
Рабочее разведение 1:100 используют при анализе антител к антигенам Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus sp., Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae; 1:200 - Staphylococcus epidermidis; 1:400 - Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Haemophilus influenzae; 1:800 - Salmonella minnesota Re; 1: 1600 - Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae.
Инкубация. Планшет выдерживают при температуре 36-37oС в течение 55-60 мин.
Отмывка от избытка антител. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и отмывают путем внесения раствора 1 в объеме не менее 0,2 мл, выдерживания при комнатной температуре в течение 2-6 мин.
Внесение рабочего разведения конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора 4.
Инкубация. Планшет выдерживают при температуре 36-37oС в течение 55-60 мин.
Отмывка от избытка конъюгата. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и отмывают путем внесения раствора 1 в объеме не менее 0,2 мл, выдерживания при комнатной температуре в течение 2-6 мин.
Внесение субстратно-индикаторной смеси. Во все лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора 5.
Инкубация. Планшет выдерживают при температуре 18-22oС в течение 15-20 мин в защищенном от света месте.
Остановка реакции. Реакцию останавливают внесением в лунки планшета по 0,05 мл "стоп-реагента".
Учет результатов:
Вывести спектрофотометр на нулевой уровень по воздуху.
Вывести спектрофотометр на нулевой уровень по воздуху.
Измерить оптическую плотность в лунках планшета.
Рассчитать среднюю арифметическую величину значений оптической плотности К-.
Оптическая плотность при контроле конъюгата не должна превышать значения 0,15. Среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках с К- не должно превышать величину 0,5. Разность оптической плотности между К+ и К- в рабочих разведениях должна превышать или быть равной величине +0,3.
Положительными на содержание антител к различным условно-патогенным бактериям считаются исследуемые сыворотки, оптическая плотность которых превышает оптическую плотность К- на величину 0,3 и более. По величине разности оптической плотности судят об активности иммунитета к каждому виду условно-патогенных бактерий.
Результаты апробации
При анализе 326 сывороток доноров станций переливания крови г. Москвы и г. Тулы установлено, что число лиц с высокой активностью IgG антител к различным антигенам колеблется от 0% до 10,7% (таблица 1).
При анализе 326 сывороток доноров станций переливания крови г. Москвы и г. Тулы установлено, что число лиц с высокой активностью IgG антител к различным антигенам колеблется от 0% до 10,7% (таблица 1).
Анализ сывороток крови 130 лиц пожилого возраста (старше 65 лет), живущих в пансионате для ветеранов труда г. Москвы, позволил установить, что в этой группе людей с высокой активностью IgG антител ко многим антигенам условно-патогенных бактерий значительно больше (таблица 2).
Анализ сывороток крови работников Московского метрополитена, работающих в условиях повышенной загрязненности воздуха станций бактериальной микрофлорой, показал достоверное, по сравнению с донорами, увеличение в этой группе лиц с высоким уровнем IgG антител к Staphylococcus aureus и Escherichia coli.
При анализе сывороток крови 208 больных различными заболеваниями людей, в 90% случаев результаты иммуноферментного анализа совпали с данными бактериологических высевов (таблица 3).
В результате анализа 200 сывороток взрослых и детей больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких установлено, что в данной группе наиболее частыми являются положительные реакции с КС пневмококка и гемофильной палочки. А в сыворотках группы больных с различными заболеваниями ЖКТ - наиболее часто выявляется высокая активность IgG антител к антигенам Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli (таблица 4).
Анализ 26 сывороток людей с болезнью Бехтерева выявил, что более чем в 60% у лиц этой группы имеются высокие показатели активности IgG антител к Klebsiella pneumoniae, что сочетается с данными литературы о клебсиеллезной этиологии такого заболевания. Одновременно показано, что у таких больных имеется высокий уровень антител к другим видам условно-патогенных бактерий (таблица 5).
При анализе 39 сывороток больных пищевой токсоинфекцией преобладали образцы с высокой активностью IgG антител к Proteus vulgaris, Salmonella minnesota, Pseudomonas aeruginosa (таблица 6).
Claims (1)
- Способ оценки состояния гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям, отличающийся тем, что на твердый носитель с сорбированными на нем двенадцатью антигенами различных условно-патогенных бактерий наносят исследуемые и контрольную сыворотки в рабочем разведении 1:100-1:1600, проводят иммуноферментный анализ, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным антигенам условно-патогенных бактерий, определяют разность между величиной оптической плотности исследуемого образца и отрицательного контроля и при разности, большей или равной 0,3, определяют повышение активности гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002124823/14A RU2213972C1 (ru) | 2002-09-19 | 2002-09-19 | Способ определения состояния гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям одновременным выявлением igg антител |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002124823/14A RU2213972C1 (ru) | 2002-09-19 | 2002-09-19 | Способ определения состояния гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям одновременным выявлением igg антител |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2213972C1 true RU2213972C1 (ru) | 2003-10-10 |
| RU2002124823A RU2002124823A (ru) | 2004-03-20 |
Family
ID=31989415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002124823/14A RU2213972C1 (ru) | 2002-09-19 | 2002-09-19 | Способ определения состояния гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям одновременным выявлением igg антител |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2213972C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005064340A3 (fr) * | 2003-12-24 | 2005-11-24 | Inodiag | Methode de diagnostic serologique et determination de statut vaccinal comprenant differents controles |
| RU2473908C2 (ru) * | 2010-12-01 | 2013-01-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Способ количественного определения специфических иммуноглобулинов g к конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин в сыворотке крови |
-
2002
- 2002-09-19 RU RU2002124823/14A patent/RU2213972C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БОРИСОВА А.М. и др. Некоторые новые данные по оценке гуморального звена иммунитета у больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких. Иммунология, 1996, №5, с.61-67. КУЛАКОВ А.В. Новые подходы в изучении антибактериального гуморального иммунитета при вторичных иммунодефицитных состояниях. Автореф. докт. дисс. - М., 1997. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005064340A3 (fr) * | 2003-12-24 | 2005-11-24 | Inodiag | Methode de diagnostic serologique et determination de statut vaccinal comprenant differents controles |
| RU2473908C2 (ru) * | 2010-12-01 | 2013-01-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Способ количественного определения специфических иммуноглобулинов g к конъюгату формальдегид - сывороточный человеческий альбумин в сыворотке крови |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2002124823A (ru) | 2004-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bayer et al. | A sensitive enzyme assay for biotin, avidin, and streptavidin | |
| US4748110A (en) | Immunoassay for HTLV-III antigens | |
| EP0662218B1 (en) | Solid phase immunological assay | |
| JPH0540120A (ja) | クラス特異的な免疫グロブリン抗体の免疫分析法 | |
| JP4426103B2 (ja) | 生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための方法 | |
| Samsonova et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay of ampicillin in milk | |
| US20030017619A1 (en) | Test method for IgA nephropathy | |
| RU2213972C1 (ru) | Способ определения состояния гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям одновременным выявлением igg антител | |
| EP0740789B1 (en) | Mastitis test and apparatus | |
| WO1992009895A1 (en) | Composition and its preparation process using antigen conjugated to enzymatic activity for immunological diagnosis and chagas' disease immunological diagnosis kits, for individual and epidemiological application, based on that composition | |
| JP2553852B2 (ja) | サンプル中の生物学的物質の免疫学的測定法 | |
| CN101368965A (zh) | 一种检测巨细胞病毒IgM抗体的化学发光法免疫分析诊断试剂盒 | |
| US4288426A (en) | Serological test for syphilis | |
| CA2047742A1 (en) | Method and diagnostic test kit for detection of anti-cardiolipin | |
| EP0280557B1 (en) | Test kit, extraction device and method for the determination of streptococcus a antigen | |
| JPH01197658A (ja) | 逐次的分析反応の実施用の分析試薬混合装置及び逐次的分析反応の実施方法 | |
| EP0233048B1 (en) | Method of detecting urinary tract infection or inflammation | |
| RU2232992C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
| US4713328A (en) | Microbial Enzyme assays | |
| US20050032117A1 (en) | Method for assessment of cystic lung fibrosis | |
| SU1606940A1 (ru) | Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл | |
| US20230003729A1 (en) | Methods for enhancing specificity and sensitivity of group a streptococcus immunoassay | |
| CA1109790A (en) | Automated assay for bacterial or bacterial antibody | |
| EP0322102A2 (en) | Methods of improved antigen capture assays and compounds therefor | |
| Shuxratovna | Determination of Igg Antibody Against Leukemia Virus in Cattle Using Immunoenzyme Assay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060920 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140920 |