RU2158306C2 - Method of detection of cattle viral diarrhea virus (mucosa disease) using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction - Google Patents
Method of detection of cattle viral diarrhea virus (mucosa disease) using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2158306C2 RU2158306C2 RU99101603A RU99101603A RU2158306C2 RU 2158306 C2 RU2158306 C2 RU 2158306C2 RU 99101603 A RU99101603 A RU 99101603A RU 99101603 A RU99101603 A RU 99101603A RU 2158306 C2 RU2158306 C2 RU 2158306C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- polymerase chain
- chain reaction
- cattle
- viral diarrhea
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии животных, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии и биопромышленности для выявления инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (вирусной диареи телят) (ВД КРС), а также контаминации культур клеток и животных этим вирусом при производстве вакцин против классической чумы свиней в виду серологического родства этих вирусов. The invention relates to biotechnology, namely to the genetic engineering of animals, and can be used in veterinary virology and biotechnology to detect infectious diseases of farm animals, in particular diseases of the mucous membranes of cattle (viral calf diarrhea) (VL cattle), as well as crop contamination cells and animals with this virus in the production of vaccines against classical swine fever in view of the serological relationship of these viruses.
До настоящего времени основным способом диагностики болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, вызываемой вирусом вирусной диареи, является длительная процедура, основанная на постановке реакций нейтрализации на культуре клеток МДВК с парными пробами сывороток. Пробы сывороток берутся с интервалом 3-4 недели от одних и тех же животных и исследуются одновременно. To date, the main method for diagnosing cattle mucous membrane disease caused by the virus of viral diarrhea is a lengthy procedure based on the formulation of neutralization reactions on a culture of MDVC cells with paired serum samples. Serum samples are taken at intervals of 3-4 weeks from the same animals and are examined simultaneously.
К недостаткам данного способа можно отнести то, что этот метод исследования не позволяет различать вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), от вируса классической чумы свиней. The disadvantages of this method include the fact that this research method does not allow to distinguish between the virus of cattle viral diarrhea (VD cattle), from the virus of classical swine fever.
Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ выявления вируса вирусной диареи КРС, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение РНК из инфицированных тканей, обратно-транскрибирование РНК обратной транскриптазой AMV, амплифицирование полученной комплементарной ДНК с помощью Taq-полимеразы ДНК в присутствии двух специфичных для ВД КРС штамма NADL праймеров, обнаружение амплифицированного фрагмента ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле (Detection of bovine viral diarrhea (BVD) virus using the polymerase chain reaction. C.Hertig, U. Pauli, R. Zanoni and E.Peterhans//Veterinary Microbiology, 1991, v.26.- p. 65-76). The closest solution adopted for the prototype is a method for detecting bovine viral diarrhea virus based on a polymerase chain reaction (PCR), including isolation of RNA from infected tissues, reverse transcription of RNA by AMV reverse transcriptase, amplification of the resulting complementary DNA using Taq DNA polymerase in the presence of two VD-specific cattle of NADL strain NADL primers, detection of amplified DNA fragment using agarose gel electrophoresis (Detection of bovine viral diarrhea (BVD) virus using the polymerase chain reaction. C. Hertig, U. P auli, R. Zanoni and E. Peterhans // Veterinary Microbiology, 1991, v.26.- p. 65-76).
К недостаткам данного способа можно отнести то, что он не позволяет обнаруживать значительную часть штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, циркулирующих среди животных, так как олигонуклеотидные праймеры синтезируются по нуклеотидной последовательности одного штамма NADL, что вызывает недостаточную специфичность при выявлении других штаммов вируса вирусной диареи. Дифференциация вируса вирусной диареи крупного рогатого скота от вируса классической чумы свиней (КЧС) для этого способа не проводилась. The disadvantages of this method include the fact that it does not allow to detect a significant portion of cattle viral diarrhea virus strains circulating among animals, since oligonucleotide primers are synthesized by the nucleotide sequence of one NADL strain, which causes insufficient specificity for other strains of viral diarrhea virus . Differentiation of the virus of viral diarrhea of cattle from the virus of classical swine fever (CSF) for this method was not carried out.
Технической задачей изобретения является повышение специфичности и возможности дифференцировать вирус ВД КРС от близкородственного вируса КЧС при сохранении чувствительности и быстроты проведения анализов. An object of the invention is to increase the specificity and ability to differentiate the VD virus of cattle from the closely related CoES virus while maintaining the sensitivity and speed of analysis.
Сущность изобретения заключается в том, что на первом этапе выбираются и синтезируются олигонуклеотидные праймеры комплементарные консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, которая имеет наибольшие отличия от нуклеотидных последовательностей РНК штаммов вируса классической чумы свиней. Затем синтезируется комплементарная ДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции и проводится амплификация синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием вышеупомянутых праймеров. The essence of the invention lies in the fact that at the first stage, oligonucleotide primers complementary to the conservative region of the highest genome similarity of different strains of the virus of cattle diarrhea, which has the greatest differences from the nucleotide sequences of the RNA strains of classical swine fever virus, are selected and synthesized. Then, complementary DNA is synthesized on the viral RNA matrix in the reverse transcription reaction and the synthesized complementary DNA is amplified by the polymerase chain reaction using the aforementioned primers.
Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.
Выбираются и синтезируются олигонуклеотидные праймеры, например: N 1- 5'-TAG ATT CCA GAC CGA CCC- 3' и N 2 - 5'-GGA AGG GAT АСА ACG GGC - 3'. Праймеры выбираются в консервативной области геномов различных штаммов вируса болезни слизистых оболочек (ВД КРС) так, чтобы они имели наибольшее сходство между соответствующими участками вирусной РНК штаммов болезни слизистых оболочек и различия с нуклеотидными последовательностями РНК вируса классической чумы свиней. Первый праймер используют для синтеза первой цепи ДНК, комплементарной вирусной РНК ВД КРС, в реакции обратной транскрипции. Второй праймер - для синтеза второй цепи кДНК с помощью фермента Tag-полимеразы. Затем оба праймера используют для амплификации участка генома вируса в полимеразной цепной реакции. Oligonucleotide primers are selected and synthesized, for example: N 1-5'-TAG ATT CCA GAC CGA CCC-3 'and N 2 - 5'-GGA AGG GAT ACA ACG GGC-3'. Primers are selected in the conservative region of the genomes of various strains of the mucosal disease virus (VD cattle) so that they have the greatest similarity between the corresponding sections of the viral RNA of the strains of the mucous membrane disease and differences with the nucleotide sequences of the RNA virus of classical swine fever. The first primer is used for the synthesis of the first DNA strand, complementary to viral RNA of VD cattle, in a reverse transcription reaction. The second primer is for the synthesis of the second cDNA chain using the enzyme Tag-polymerase. Then both primers are used to amplify a portion of the viral genome in the polymerase chain reaction.
Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства штаммов вируса вирусной диареи КРС и отличающиеся от последовательностей РНК вируса КЧС. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". Новые признаки технического решения по совокупности признаков обеспечивают достижение цели изобретения: выявляется большее число штаммов вируса вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота и их дифференциация от серологически родственного вируса классической чумы свиней. A significant difference between the proposed method and the known prototype is that nucleotide sequences are used as primers, which are the same for most cattle viral diarrhea virus strains and differ from the CSF virus RNA sequences. Thus, the claimed method meets the criterion of "novelty." The new features of the technical solution in terms of the features ensure the achievement of the objective of the invention: a greater number of strains of the virus of viral diarrhea (mucous membrane disease) of cattle and their differentiation from the serologically related virus of classical swine fever are detected.
Технической задачей изобретения является повышение специфичности и возможность дифференцировать два вида вирусов без снижения чувствительности способа выявления вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. An object of the invention is to increase the specificity and the ability to differentiate two types of viruses without compromising the sensitivity of the method for detecting cattle viral diarrhea virus.
Поставленная цель достигается выбором и синтезом олигонуклеотидных праймеров: N 1-5'-TAG ATT CCA GAC CGA CCC-3' и N 2-5'-GGA AGG GAT АСА ACG GGC-3'. Праймеры были выбраны в консервативной области геномов различных штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота так, что имели 100% сходство между собой и соответствующими участками вирусной РНК вирусной диареи КРС и различия с нуклеотидными последовательностями вирусной РНК классической чумы свиней. Первый праймер использовали для синтеза первой цепи ДНК, комплементарной вирусной РНК ВД КРС, в реакции обратной транскрипции. Второй праймер - для синтеза второй цепи кДНК с помощью фермента Tag-полимеразы. Затем оба праймера использовали для амплификации участка генома вируса в полимеразной цепной реакции, проведя 30 циклов при следующем режиме: денатурация при 95oC в течение 1 мин, гибридизация - при 60oC в течение 1 мин и синтез - при 73oC в течение 2 мин. О положительном результате анализа судили по размеру синтезированного фрагмента кДНК, мигрирующего в 1% геле агарозы.This goal is achieved by the selection and synthesis of oligonucleotide primers: N 1-5'-TAG ATT CCA GAC CGA CCC-3 'and N 2-5'-GGA AGG GAT ACA ACG GGC-3'. Primers were selected in the conservative genome region of various strains of the virus of cattle viral diarrhea so that they had 100% similarity between themselves and the corresponding sections of viral RNA of viral diarrhea of cattle and differences with the nucleotide sequences of the viral RNA of classical swine fever. The first primer was used to synthesize the first DNA strand, complementary to viral RNA of VD cattle, in the reverse transcription reaction. The second primer is for the synthesis of the second cDNA chain using the enzyme Tag-polymerase. Then both primers were used to amplify a portion of the virus genome in the polymerase chain reaction, after 30 cycles in the following mode: denaturation at 95 o C for 1 min, hybridization at 60 o C for 1 min and synthesis at 73 o C for 2 minutes. A positive analysis result was judged by the size of the synthesized cDNA fragment migrating in a 1% agarose gel.
Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства штаммов вируса ВД КРС и имеющие наибольшие отличия от последовательностей РНК вируса КЧС. A significant difference of the proposed method from the known prototype is that nucleotide sequences are used as primers that are the same for most strains of VD virus of cattle and have the greatest differences from the RNA sequences of the CSF virus.
Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа. The essence of the technical solution is disclosed in the examples of the specific implementation of the method.
Пример. Операция 1. Выделение РНК вируса ВД КРС из патологического материала. Образец патологического материала (300-500 мг) растирают в ступке со стеклянным порошком (100-200 мг) и добавляют 1000 мкл 4 М гуанидинтиоционата, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем 600 мкл лизата переносят в пробирку объемом 1,5 мл и добавляют 60 мкл 3 М ацетата натрия рН 5,0 и 300 мкл смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:25:0,5). Содержимое перемешивают и выдерживают на льду или при -15oC в течение 15-20 мин. Затем образец центрифугируют на центрифуге T23D в угловом роторе при 8500 об/мин в течение 20 мин. Водную фазу собирают и к полученному объему добавляют равный объем охлажденного изопропанола, перемешивают и ставят на 30 мин при -45oC или на 2 ч при -20oC. Затем пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин на центрифуге. Осадок растворяют в 300 мкл 4 М гуанидинтиоционата и, добавив 30 мкл 3 М натрия ацетата pH 5,0 и 750 мкл этилового спирта, выдерживают в течение 2-3 ч при -20oC или 30-40 мин при -45oC. После этого образец центрифугируют на центрифуге MPW 310 при 14000 об/мин в течение 15 мин. Осадок промывают холодным этиловым спиртом и, высушив при 37o, растворяют в 15-20 мкл бидистиллированной воды.Example. Operation 1. Isolation of RNA virus VD cattle from pathological material. A sample of pathological material (300-500 mg) was ground in a mortar with glass powder (100-200 mg) and 1000 μl of 4 M guanidine thiocyanate was added, stirred and kept at room temperature for 15 minutes. Then, 600 μl of the lysate was transferred to a 1.5 ml tube and 60 μl of 3 M sodium acetate pH 5.0 and 300 μl of a phenol: chloroform: isoamyl alcohol mixture (25: 25: 0.5) were added. The contents are mixed and kept on ice or at -15 o C for 15-20 minutes The sample is then centrifuged in a T23D centrifuge in an angular rotor at 8500 rpm for 20 minutes. The aqueous phase is collected and an equal volume of chilled isopropanol is added to the resulting volume, stirred and placed for 30 minutes at -45 ° C or for 2 hours at -20 ° C. Then the sample is centrifuged for 10 minutes at 13000 rpm in a centrifuge. The precipitate is dissolved in 300 μl of 4 M guanidine thiocyanate and, adding 30 μl of 3 M sodium acetate pH 5.0 and 750 μl of ethyl alcohol, incubated for 2-3 hours at -20 o C or 30-40 min at -45 o C. After that, the sample is centrifuged in an MPW 310 centrifuge at 14,000 rpm for 15 minutes. The precipitate is washed with cold ethyl alcohol and, dried at 37 o , dissolved in 15-20 μl bidistilled water.
Операция 2. Выделение РНК вируса ВД КРС из культуры клеток MDBK, зараженных вакцинным штаммом вируса ВК-1. 400 мл суспензии клеток центрифугируют на центрифуге T23D в бакет-роторе при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее к осадку клеток добавляют 1,5-2 мл 4 М гуанидинтиоционата и проводят последующие операции, как описано выше в операции 1. Operation 2. Isolation of RNA VD virus RNA from a culture of MDBK cells infected with a vaccine strain of the virus VK-1. 400 ml of the cell suspension are centrifuged in a T23D centrifuge in a bucket rotor at 5000 rpm for 15 minutes. Next, 1.5-2 ml of 4 M guanidine thiocyanate is added to the cell pellet and subsequent operations are performed as described above in step 1.
Операция 3. Выделение вирусной РНК из сухой живой культуральной вакцины ЛК-ВНИИВВиМ против КЧС. Во флакон с содержанием 500 прививочных доз добавляют 1500 мкл 4 М гуанидинтиоционата, выдерживают 10-15 мин при комнатной температуре и проводят последующие операции, как описано выше в операции 1. Operation 3. Isolation of viral RNA from the dry live culture vaccine LK-VNIIVViM against CSF. 1500 μl of 4 M guanidine thiocyanate is added to a bottle containing 500 vaccination doses, it is kept for 10-15 minutes at room temperature and the following operations are carried out as described in step 1 above.
Операция 5. Синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК ВД КРС. Выделенную вирусную РНК добавляют к 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 10 мМ MgC12; 140 mM KCl; 20 mM b-меркаптоэтанола; 100 мкг/мл праймера N 1; 1 мМ dATF, dTTF, dCTF, dGTF, 1 мкл обратной транскриптазы (37 ед./мкл). Реакцию проводят в течение 1 ч и 30 мин при +37oC. После этого содержимое пробирки прогревают в течение 3 мин при 95oC.Operation 5. Synthesis of complementary DNA on a matrix of viral RNA VD cattle. The isolated viral RNA is added to 50 μl of the reaction mixture containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 10 mM MgC1 2 ; 140 mM KCl; 20 mM b-mercaptoethanol; 100 μg / ml primer N 1; 1 mM dATF, dTTF, dCTF, dGTF, 1 μl reverse transcriptase (37 units / μl). The reaction is carried out for 1 h and 30 min at +37 o C. After that, the contents of the tube are heated for 3 min at 95 o C.
Операция 6. Синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК КЧС. Обратную транскрипцию проводят, как описано в операции 5. Operation 6. Synthesis of complementary DNA on the matrix of viral RNA of CoES. Reverse transcription is performed as described in step 5.
Операция 7. Полимеразная цепная реакция. 5 мкл раствора, содержащего кДНК вируса ВД КРС, добавляют к 45 мкл раствора, содержащего 67 мМ трис-HCl, pH 8,8; 1,5 мM MgCl2, 0,01% TWeen-20; 0,2 мМ каждого из четырех дезокситрифосфатов, 2 единицы Taq-полимеразы и по 200 нг праймеров N 1 и N 2. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 30 циклов: 95oC в течение 1 мин, 60oC в течение 1 мин, 73oC в течение 2 мин. В конце реакции проводят завершающий синтез при 73oC в течение 4 мин.Operation 7. Polymerase chain reaction. 5 μl of a solution containing cD VD virus cDNA is added to 45 μl of a solution containing 67 mM Tris-HCl, pH 8.8; 1.5 mM MgCl 2 , 0.01% TWeen-20; 0.2 mM of each of the four deoxytriphosphates, 2 units of Taq polymerase, and 200 ng of primers N 1 and N 2 each. 30 μl of liquid paraffin are layered on top of the reaction mixture. PCR consists of 30 cycles: 95 o C for 1 min, 60 o C for 1 min, 73 o C for 2 min. At the end of the reaction, a final synthesis is carried out at 73 ° C. for 4 minutes.
После завершения ПЦР отбирают водную фазу и смешивают ее с равным объемом раствора, содержащего фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:25:1). После центрифугирования в центрифуге MPW 310 при 14000 об/мин в течение 30 с, водную фазу отбирают и осаждают ДНК этиловым спиртом с ацетатом натрия. Осадок растворяют в 20 мкл воды. After completion of the PCR, the aqueous phase is taken and mixed with an equal volume of a solution containing phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 25: 1). After centrifugation in an MPW 310 centrifuge at 14,000 rpm for 30 s, the aqueous phase was collected and DNA was precipitated with ethyl alcohol and sodium acetate. The precipitate was dissolved in 20 μl of water.
Операция 8. Полимеразную цепную реакцию с кДНК вируса КЧС проводят в тех же условиях, что и с кДНК вируса ВД КРС (операция N 7). Operation 8. The polymerase chain reaction with cDNA of the virus of CoES is carried out under the same conditions as with cDNA of the virus of VD of cattle (operation N 7).
Операция 9. Определение размера продуктов ПЦР. 15 мкл раствора продукта полимеразной цепной реакции смешивают с 5 мкл раствора, содержащего 50%-ный глицерин, бромфеноловый синий, и наносят в "карман" 1%-го агарозного геля. Маркер молекулярной массы состоит из продуктов расщепления ДНК плазмиды pDR322 рестрикционной эндонуклеазой Alul. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 997 нуклеотидные пары. Step 9. Determining the size of PCR products. 15 μl of a solution of the product of the polymerase chain reaction is mixed with 5 μl of a solution containing 50% glycerol, bromphenol blue, and put in the "pocket" of 1% agarose gel. The molecular weight marker consists of the DNA cleavage products of plasmid pDR322 by Alul restriction endonuclease. The assay is considered positive if the PCR product matches the expected fragment size of 997 nucleotide pairs.
Результаты проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют кДНК вируса вирусной диареи КРС. Анализы были отрицательными, когда использовали кДНК вируса классической чумы свиней. Чувствительность предлагаемого способа выявления вируса КЧС достаточно высока и составляет 0.1 пг вирусной РНК, что соответствует 10000 вирусных частиц. Результаты испытаний различных пар праймеров в ПЦР приведены в таблице 1. The results of the experiments show that positive analyzes of PCR products are obtained only when the viral diarrhea virus cattle cDNA is used as a matrix. Assays were negative when classical swine fever virus cDNA was used. The sensitivity of the proposed method for detecting CSF virus is quite high and is 0.1 pg of viral RNA, which corresponds to 10,000 viral particles. The test results of various pairs of primers in PCR are shown in table 1.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99101603A RU2158306C2 (en) | 1999-01-19 | 1999-01-19 | Method of detection of cattle viral diarrhea virus (mucosa disease) using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99101603A RU2158306C2 (en) | 1999-01-19 | 1999-01-19 | Method of detection of cattle viral diarrhea virus (mucosa disease) using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU99101603A RU99101603A (en) | 2000-10-20 |
| RU2158306C2 true RU2158306C2 (en) | 2000-10-27 |
Family
ID=20215177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99101603A RU2158306C2 (en) | 1999-01-19 | 1999-01-19 | Method of detection of cattle viral diarrhea virus (mucosa disease) using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2158306C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2524426C2 (en) * | 2008-12-03 | 2014-07-27 | Пфайзер Инк. | CATTLE DIARRHEA VIRUS WITH MODIFIED Erns PROTEIN |
-
1999
- 1999-01-19 RU RU99101603A patent/RU2158306C2/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| C.Hertig, U.Pauli, R.Zanoni and T.Peterhans. Detection of bovine viral diarrhea (BVD) virus using the polymerase chain reaction. Veterinary Microbiology, 1991, v.26, p.65-76. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2524426C2 (en) * | 2008-12-03 | 2014-07-27 | Пфайзер Инк. | CATTLE DIARRHEA VIRUS WITH MODIFIED Erns PROTEIN |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6867021B2 (en) | Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli | |
| CN113046475B (en) | Primer composition and kit for rapidly detecting mutant novel coronavirus | |
| JP6936835B2 (en) | Methods for detecting CPV2A, 2B and 2C and methods for identifying wild type from vaccine type | |
| CN111286559A (en) | Primer, probe and kit for detecting African swine fever virus | |
| JP2013516983A (en) | Means and method for distinguishing between FECV and FIPV | |
| US7381547B2 (en) | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR | |
| US20210340635A1 (en) | Materials and methods for detecting coronavirus | |
| RU2360971C1 (en) | Method and test system to detect dna of african swine fever virus by means of specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction | |
| RU2158306C2 (en) | Method of detection of cattle viral diarrhea virus (mucosa disease) using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction | |
| JP2018000124A (en) | Kit for nucleic acid extraction and amplification from virus and extraction and amplification method using the same | |
| RU2743352C1 (en) | Method for differential amplification of vp1 region fragment of enterovirus genome enterovirus a and enterovirus b | |
| CN113817870A (en) | Primer composition for simultaneously detecting seven respiratory tract-related viruses and application thereof | |
| CN107164511B (en) | Method for rapidly detecting haemophilus parasuis serotype 4 | |
| RU2120994C1 (en) | Method of detection of pig classic plague virus | |
| JP2010516231A (en) | Human erythrovirus | |
| RU2644233C2 (en) | Method for leukosis diagnosis in cattle | |
| US20240110252A1 (en) | Compositions and Kits for Rapid Detection of SARS-CoV-2 and Methods of Production and Use Thereof | |
| WO2005059505A2 (en) | Method and kit for the genotypification of hla-b27 based on real time pcr | |
| CN111321246A (en) | Canine distemper virus nano PCR detection kit and application thereof | |
| Bremer et al. | Discrimination between sheep-associated and wildebeest-associated malignant catarrhal fever virus by means of a single-tube duplex nested PCR | |
| Pšikal et al. | Colorimetric detection of lagomorphs' calicivirus genomic sequences by polymerase chain reaction incorporating digoxigenin dUTP | |
| RU2203951C1 (en) | Method for detecting fusobacterium necrophorum in nest pcr | |
| KR100386135B1 (en) | Detection of Nephrotic Hemorrhagic Fever Virus | |
| WO2007038117A2 (en) | Detecting foot-and-mouth disease virus | |
| RU2416648C1 (en) | Oligonucleotide primers, method and test system for identifying genome of rabbit viral hemorrhagic disease by reverse transcription - polymerase chain reaction |