RU2120994C1

RU2120994C1 - Method of detection of pig classic plague virus

Info

Publication number: RU2120994C1
Application number: RU97103934A
Authority: RU
Inventors: В.И. Семенихин; А.Т. Пузырев; А.С. Донченко; С.Ф. Орешкова; В.М. Чекишев; А.А. Ильичев; П.Е. Герб
Original assignee: Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАН
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 1998-10-27

Abstract

FIELD: molecular biology, genetic engineering. SUBSTANCE: method involves synthesis of oligonucleotide primers 5'-CTGCTGGCCTGG- -GTGACTACG-3' and 5'-ATAACTCAATGGAACCTG-3' and synthesis of complementary DNA on RNA-template. Then amplification of synthesized DNA is carried out by method of polymerase chain reaction and size products of polymerase chain reaction is analyzed. Method ensures to differentiate pig classic plague virus from closely related cattle diarrhea virus. EFFECT: high specificity of method. 1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии животных, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности, классической чумы свиней (КЧС). The invention relates to biotechnology, namely to the genetic engineering of animals, and can be used in veterinary virology to detect infectious diseases of farm animals, in particular classical swine fever (CSF).

До настоящего времени основным способом диагностики классической чумы свиней является длительная процедура, основанная на иммунофлуоресцентном методе выявления возбудителя болезни. Известен способ иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней, включающий выделение вируса в перевиваемой культуре клеток почки поросенка РК-15, инокулированной испытуемыми материалами от павших или вынужденно убитых больных свиней, и идентификация его прямой иммунофлуоресценцией, затем выявление и титрование специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямой иммунофлуоресценцией в сыворотках крови переболевших свиней и, на последнем этапе, выявление и титрование вируснейтрализующих антител классической чумы свиней методом нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (Методические указания по иммунофлуоресцентной диагностике классической чумы свиней //Покров: МСХ СССР. - 1984. - 14 с.). To date, the main method for diagnosing classical swine fever is a lengthy procedure based on the immunofluorescence method for identifying the causative agent of the disease. A known method of immunofluorescence diagnosis of classical swine fever, including the isolation of the virus in an inoculated culture of PK-15 piglet kidney cells inoculated with test materials from dead or forcedly killed sick pigs, and its identification by direct immunofluorescence, then the identification and titration of specific antibodies to classical swine fever virus immunofluorescence in the blood serum of ill pigs and, at the last stage, the identification and titration of classical virus neutralizing antibodies swine fever by neutralizing fluorescent microplatelets (Guidelines for immunofluorescence diagnosis of classical swine fever // Pokrov: Ministry of Agriculture of the USSR. - 1984. - 14 pp.).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он не позволяет различать вирус классической чумы свиней от вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС). The disadvantages of this method include the fact that it does not allow to distinguish between classical swine fever virus and cattle viral diarrhea virus (VD).

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является известный способ выявления вируса классической чумы свиней, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение РНК из КЧС-инфицированных тканей, обратно-транскрибирование РНК обратной транскриптазой AMV, амплифицирование полученной комплементарной ДНК с помощью Taq-полимеразы ДНК в присутствии двух КЧС-специфических праймеров, обнаружение амплифицированного фрагмента ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле и, для повышения чувствительности, повторное амплифицирование ДНК набором гнездовых праймеров (Rapid detection of hog cholera virus in tissues by the polymerase chain reaction. S. - T.Liu, S.-N.Li, D.-C.Wang et al./Journal of Virological Methods, 1991, v. 35.-p. 227-236.). The closest solution adopted for the prototype is a known method for detecting classical swine fever virus based on polymerase chain reaction (PCR), including the isolation of RNA from CSF-infected tissues, reverse transcription of RNA with AMV reverse transcriptase, amplification of the obtained complementary DNA using Taq DNA polymerase in the presence of two CSF-specific primers, detection of an amplified DNA fragment by agarose gel electrophoresis and, to increase sensitivity, repeat amp DNA sequencing using a set of nested primers (Rapid detection of hog cholera virus in tissues by the polymerase chain reaction. S. - T. Liu, S.-N. Li, D.-C. Wang et al. / Journal of Virological Methods, 1991 , v. 35.-p. 227-236.).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он не позволяет обнаруживать значительную часть штаммов вируса классической чумы свиней, циркулирующих среди животных, так как олигонуклеотидные праймеры синтезируются по нуклеотидной последовательности одного штамма, что вызывает недостаточную специфичность при выявлении других штаммов вируса чумы свиней. Дифференциация вируса классической чумы свиней от вируса вирусной диареи крупного рогатого скота для этого способа не проводилась. The disadvantages of this method include the fact that it does not allow to detect a significant part of the strains of classical swine fever virus circulating among animals, since oligonucleotide primers are synthesized by the nucleotide sequence of one strain, which causes insufficient specificity for the detection of other strains of swine fever virus. The differentiation of the virus of classical swine fever from the virus of viral diarrhea of cattle for this method was not carried out.

Технической задачей изобретения является повышение специфичности и возможности дифференцировать вирус КЧС от близкородственного вируса ВД КРС при сохранении чувствительности и быстроты проведения анализов. An object of the invention is to increase the specificity and ability to differentiate the CSF virus from the closely related VD virus of cattle while maintaining the sensitivity and speed of analysis.

Сущность изобретения заключается в том, что на первом этапе выбираются и синтезируются олигонуклеотидные праймеры, комплементарные консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса классической чумы свиней, которая имеет наибольшие отличия от нуклеотидных последовательностей РНК штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Затем синтезируется комплементарная ДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции и проводится амплификация синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием вышеупомятуных праймеров. The essence of the invention lies in the fact that at the first stage, oligonucleotide primers are selected and synthesized that are complementary to the conservative region of the greatest similarity of genomes of various strains of classical swine fever virus, which has the greatest differences from the nucleotide sequences of RNA strains of the virus of cattle diarrhea. Then, complementary DNA is synthesized on the viral RNA matrix in the reverse transcription reaction and the synthesized complementary DNA is amplified by the polymerase chain reaction using the aforementioned primers.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Выбираются и синтезируются олигонуклеотидные праймеры, например: N 1 - 5' - CTG GCC TGG GTG ACT ACG-3' и N 2-5'-ATA ACT CAA TGG AAC CTG-3'. Праймеры выбираются в консервативной области геномов различных штаммов вируса классической чумы свиней так, чтобы они имели 100% сходство между соответствующими участками вирусной РНК штаммов классической чумы свиней и различия с нуклеотидными последовательностями вирусной РНК ВД КРС. Первый праймер используют для синтеза первой цепи ДНК, комплементарной вирусной РНК классической чумы свиней, в реакции обратной транскрипции. Второй праймер - в ДНК-полимеразной реакции для синтеза второй цепи кДНК. Затем оба праймера используют для амплификации участка генома вируса в полимеразной цепной реакции. Oligonucleotide primers are selected and synthesized, for example: N 1-5 '- CTG GCC TGG GTG ACT ACG-3' and N 2-5'-ATA ACT CAA TGG AAC CTG-3 '. Primers are selected in the conservative region of the genomes of various strains of classical swine fever virus so that they have 100% similarity between the corresponding sections of the viral RNA of strains of classical swine fever and differences with the nucleotide sequences of viral RNA of VD cattle. The first primer is used to synthesize the first DNA strand, complementary to the viral RNA of classical swine fever, in a reverse transcription reaction. The second primer is in the DNA polymerase reaction for the synthesis of the second cDNA strand. Then both primers are used to amplify a portion of the viral genome in the polymerase chain reaction.

Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства штаммов вируса классической чумы свиней и отличающиеся от последовательностей РНК ВД КРС. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". Новые признаки технического решения по совокупности признаков обеспечивают достижение цели изобретения: выявляется большее число штаммов вируса классической чумы свиней и их дифференциация от серологически родственного вируса ВД КРС. Следовательно, можно считать заявляемое техническое решение соответствующим критерию "изобретательный уровень". A significant difference of the proposed method from the known prototype is that nucleotide sequences are used as primers that are the same for most strains of classical swine fever virus and differ from VD cattle RNA sequences. Thus, the claimed method meets the criterion of "novelty." The new features of the technical solution for the totality of features ensure the achievement of the objective of the invention: a greater number of strains of the virus of classical swine fever are detected and their differentiation from serologically related virus of VD cattle. Therefore, we can consider the claimed technical solution meets the criterion of "inventive step".

Технической задачей изобретения является повышение специфичности и возможность дифференцировать два вида вирусов без снижения чувствительности способа выявления вируса классической чумы свиней. An object of the invention is to increase the specificity and the ability to differentiate two types of viruses without reducing the sensitivity of the method for detecting classical swine fever virus.

Поставленная цель достигается выбором и синтезом олигонуклеотидных праймеров: N 1 - 5' - CTG GCC TGG GTG ACT ACG-3' и N 2 -5'-ATA ACT CAA TGG AAC CTG-3'. Праймеры были выбраны в консервативной области геномов различных штаммов вируса классической чумы свиней так, что имели 100% сходство между собой и соответствующими участками вирусной РНК классической чумы свиней и различия с неуклеотидными последовательностями вирусной РНК ВД КРС. Первый праймер использовали для синтеза первой цепи ДНК, комплементарной вирусной РНК КЧС, в реакции обратной транскрипции. Второй праймер - в ДНК-полимеразной реакции для синтеза второй цепи кДНК. Затем оба праймера использовали для амплификации участка генома вируса в полимеразной цепной реакции, проведя 30 циклов при следующем режиме: денатурация при 95^oC в течение 1 мин, гибридизация - при 56^oC в течение 1 мин и синтез - при 73^oC в течение 2 мин. О положительном результате анализа судили по размеру синтезированного фрагмента кДНК, мигрирующего в 1% геле агарозы.This goal is achieved by the selection and synthesis of oligonucleotide primers: N 1 - 5 '- CTG GCC TGG GTG ACT ACG-3' and N 2 -5'-ATA ACT CAA TGG AAC CTG-3 '. Primers were chosen in the conservative genome region of various strains of classical swine fever virus so that they had 100% similarity between themselves and the corresponding sections of the viral RNA of classical swine fever and differences with the non-nucleotide sequences of the viral RNA of VD cattle. The first primer was used to synthesize the first DNA strand complementary to the CSF virus RNA in a reverse transcription reaction. The second primer is in the DNA polymerase reaction for the synthesis of the second cDNA strand. Then, both primers were used to amplify a portion of the virus genome in the polymerase chain reaction, after 30 cycles in the following mode: denaturation at 95 ^o C for 1 min, hybridization at 56 ^o C for 1 min and synthesis at 73 ^o C for 2 minutes. A positive analysis result was judged by the size of the synthesized cDNA fragment migrating in a 1% agarose gel.

Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства штаммов вируса КЧС и имеющих наибольшие отличия от последовательностей РНК ВД КРС. A significant difference between the proposed method and the known prototype is that nucleotide sequences are used as primers that are the same for most CSF virus strains and have the greatest differences from VD cattle RNA sequences.

Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа. The essence of the technical solution is disclosed in examples of a specific implementation of the method.

Пример. Операция 1. Выделение РНК вируса КЧС из патологического материала. Образец патологического материала (1 г) растирают в ступке со стеклянным порошком и добавляют 6 мл 4 М гуанидинтиоционата. Смесь пипетируют до образования однородной суспензии. После этого к суспензии добавляют 0,48 мл 3 М ацетата натрия pH 5,0 и 4,8 мл смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 25:1). Содержимое встряхивают 30 сек и выдерживают на льду в течение 15 мин. Затем образец центрифугируют на центрифуге Beckman J2-21 в роторе JA-20 при 9500 об/мин в течение 20 минут при 2^oC. Водную фазу собирают и к полученному объему добавляют равный объем охлажденного изопропанола, перемешивают и ставят на 30 мин при -45^oC. Затем пробу центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин в том же роторе. Осадок растворяют в 500 мкл 4 М гуанидинтиоционата и, добавив 50 мкл 3 М натрия ацетата pH 5,0 и 2,5 мл этилового спирта, выдерживают 30 мин при -45^oC. После этого образец центрифугируют на центрифуге Eppendorf 5415 C при 14000 об/мин в течение 6 мин при комнатной температуре. Осадок растворяют в 100 мкл воды, добавив 10 мкл 3 М натрия ацетата pH 5,0 и 280 мкл этилового спирта, перемешивают и выдерживают 30 мин при -45^oC. Далее центрифугирование проводят на центрифуге Eppendorf 5415 C при 14000 об/мин в течение 6 мин при комнатной температуре. Осадок промывают холодным этиловым спиртом и, высушив при 42^oC, растворяют в 20 мкл воды.Example. Operation 1. Isolation of CSF virus RNA from pathological material. A sample of pathological material (1 g) was ground in a mortar with glass powder and 6 ml of 4 M guanidine thiocyanate was added. The mixture is pipetted until a homogeneous suspension is formed. After that, 0.48 ml of 3 M sodium acetate pH 5.0 and 4.8 ml of a phenol: chloroform: isoamyl alcohol mixture (25: 25: 1) were added to the suspension. The contents are shaken for 30 seconds and kept on ice for 15 minutes. The sample is then centrifuged in a Beckman J2-21 centrifuge in a JA-20 rotor at 9500 rpm for 20 minutes at 2 ^° C. The aqueous phase is collected and an equal volume of chilled isopropanol is added to the resulting volume, stirred and set for 30 minutes at -45 ^o C. Then the sample is centrifuged for 10 min at 12000 rpm in the same rotor. The precipitate is dissolved in 500 μl of 4 M guanidine thiocyanate and, adding 50 μl of 3 M sodium acetate pH 5.0 and 2.5 ml of ethyl alcohol, incubated for 30 min at -45 ^o C. After that, the sample is centrifuged in an Eppendorf 5415 C centrifuge at 14000 r / min for 6 min at room temperature. The precipitate is dissolved in 100 μl of water, adding 10 μl of 3 M sodium acetate pH 5.0 and 280 μl of ethyl alcohol, stirred and incubated for 30 minutes at -45 ^o C. Then centrifugation is carried out on an Eppendorf 5415 C centrifuge at 14000 rpm for 6 min at room temperature. The precipitate was washed with cold ethyl alcohol and, dried at 42 ^° C, was dissolved in 20 μl of water.

Операция 2. Выделение вирусной РНК из культуры клеток РК-15, зараженных вакцинным штаммом вируса КЧС ЛК-ВНИИВВиМ. 400 мл суспензии клеток центрифугируют на центрифуге Beckman J2-21 в роторе JA-20 при 9500 об/мин в течение 20 минут при 2^oC. Далее к осадку клеток добавляют 6 мл 4 М гуанидинтиоционата и проводят последующие операции как описано выше в операции 1.Operation 2. Isolation of viral RNA from a culture of RK-15 cells infected with a vaccine strain of the CSF virus LK-VNIIVViM. 400 ml of the cell suspension is centrifuged on a Beckman J2-21 centrifuge in a JA-20 rotor at 9500 rpm for 20 minutes at 2 ^° C. Next, 6 ml of 4 M guanidine thiocyanate is added to the cell pellet and the following operations are carried out as described above in step 1 .

Операция 3. Выделение РНК вируса ВД КРС из патологического материала от свиней, имевших антитела в сыворотке крови к вирусу ВД КРС в титрах 1:16-1: 32. Выделение проводят как описано в операции 1. Operation 3. The selection of RNA virus VD cattle from pathological material from pigs that had antibodies in the blood serum of the virus VD cattle in titers 1: 16-1: 32. Isolation is carried out as described in operation 1.

Операция 4. Выделение РНК вируса ВД КРС из культуры клеток MDBK, зараженных вакцинным штаммом вируса ВК-1. Выделение проводят как описано в операции 2. Operation 4. Isolation of RNA virus VD cattle from a culture of MDBK cells infected with a vaccine strain of the virus VK-1. Isolation is carried out as described in step 2.

Операция 5. Синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК КЧС. Выделенную вирусную РНК добавляют к 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, pH 8,3; 10 мМ MgCl₂; мМ KCl; 20 mM β-меркаптоэтанола; 100 мкг/мл праймера N1; мМdATF, dTTF, dCTF, dGTF, 800 ед/мл обратной транскриптазы. Реакцию проводят в течение 1 часа и 30 минут при 42^oC. После этого содержимое пробирки прогревают в течение 3 мин при 95^oC.Operation 5. Synthesis of complementary DNA on the matrix of viral RNA of CoES. The isolated viral RNA is added to 50 μl of the reaction mixture containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 10 mM MgCl ₂ ; mM KCl; 20 mM β-mercaptoethanol; 100 μg / ml primer N1; mMdATF, dTTF, dCTF, dGTF, 800 u / ml reverse transcriptase. The reaction is carried out for 1 hour and 30 minutes at 42 ^o C. After that, the contents of the tube are heated for 3 minutes at 95 ^o C.

Операция 6. Синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК ВД КРС. Обратную транскрипцию проводят как описано в операции N5. Operation 6. Synthesis of complementary DNA on a matrix of viral RNA VD cattle. Reverse transcription is carried out as described in operation N5.

Операция 7. Полимеразная цепная реакция, 5 мкл раствора, содержащего кДНК вируса КЧС, добавляют к 45 мкл раствора, содержащего 67 мМ трис-HCl, pH 8,8; 1,5 мМ MgCl₂, 0,01% TWeen-20; 0,2 мМ каждого из четырех дезокситрифосфатов, 2 единицы Tag-полимеразы и по 200 нг праймеров N1 и N2. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 30 циклов: 95^oC в течение 1 мин, 56^oC в течение 1 мин, 73^oC в течение 2 мин. В конце реакции проводят завершающий синтез при 73^oC в течение 3 мин.Step 7. Polymerase chain reaction, 5 μl of a solution containing CSF virus cDNA is added to 45 μl of a solution containing 67 mM Tris-HCl, pH 8.8; 1.5 mM MgCl ₂ , 0.01% TWeen-20; 0.2 mm of each of the four deoxytriphosphates, 2 units of Tag polymerase and 200 ng of primers N1 and N2. Over the reaction mixture layered 30 μl of liquid paraffin. PCR consists of 30 cycles: 95 ^o C for 1 min, 56 ^o C for 1 min, 73 ^o C for 2 min. At the end of the reaction, a final synthesis is carried out at 73 ^° C. for 3 minutes.

После завершения ПЦР отбирают водную фазу и смешивают ее с равным объемом раствора, содержащего фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:25:1). После центрифугирования в центрифуге Eppendorf при 14000 об/мин в течение 30 сек водную фазу отбирают и осаждают ДНК этиловым спиртом с ацетатом натрия. Осадок растворяют в 20 мкл воды. After completion of the PCR, the aqueous phase is taken and mixed with an equal volume of a solution containing phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 25: 1). After centrifugation in an Eppendorf centrifuge at 14,000 rpm for 30 seconds, the aqueous phase was collected and DNA was precipitated with ethyl alcohol and sodium acetate. The precipitate was dissolved in 20 μl of water.

Операция 8. Полимеразную цепную реакцию с кДНК ВД КРС проводят в тех же условиях, что и с кДНК КЧС (операция N 7). Operation 8. The polymerase chain reaction with cDNA VD of cattle is carried out under the same conditions as with cDNA of CoES (operation N 7).

Операция 9. Определение размера продуктов ПЦР. 15 мкл раствора продукта полимеразной цепной реакции смешивают с 5 мкл раствора, содержащего 50%-ный глицерин, бромфеноловый синий, и наносят в "карман" 1%-ного агарозного геля. Маркер молекулярной массы состоит из продуктов расщепления ДНК плазмиды pUC18 рестрикционной эндонуклеазной Alu1. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 379 нуклеотидные пары. Step 9. Determining the size of PCR products. 15 μl of a solution of the product of the polymerase chain reaction is mixed with 5 μl of a solution containing 50% glycerol, bromphenol blue, and put in the "pocket" of a 1% agarose gel. The molecular weight marker consists of the DNA cleavage products of plasmid pUC18 restriction endonuclease Alu1. The assay is considered positive if the PCR product matches the expected fragment size of 379 nucleotide pairs.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют кДНК классической чумы свиней. Анализы были отрицательными, когда использовали кДНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Чувствительность предлагаемого способа выявления вируса КЧС достаточно высока и составляет 0,1 пг вирусной РНК, что соответствует 1000 вирусных частиц. Результаты испытаний различных пар праймеров в ПЦР приведены в таблице. The results of the experiments show that positive analyzes of PCR products are obtained only when cDNA of classical swine fever is used as a matrix. Assays were negative when cattle viral diarrhea virus cDNA was used. The sensitivity of the proposed method for detecting CSF virus is quite high and is 0.1 pg of viral RNA, which corresponds to 1000 viral particles. The test results of various pairs of primers in PCR are shown in the table.

Claims

A method for detecting classical swine fever virus, including synthesis of oligonucleotide primers, synthesis of complementary DNA on an RNA matrix in a reverse transcription reaction and amplification of synthesized complementary DNA by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers, analysis of the size of polymerase chain reaction products, characterized in that the synthesized primers nucleotide sequences
5'-CTG GCC TGG GTG ACT ACG-3 '
5'-ATA ACT CAA TGG AAC CTG-3 '