RU2145976C1 - Способ получения полипептида (варианты) - Google Patents
Способ получения полипептида (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2145976C1 RU2145976C1 RU94035681A RU94035681A RU2145976C1 RU 2145976 C1 RU2145976 C1 RU 2145976C1 RU 94035681 A RU94035681 A RU 94035681A RU 94035681 A RU94035681 A RU 94035681A RU 2145976 C1 RU2145976 C1 RU 2145976C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- group
- group containing
- carbon atoms
- formula
- integer
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
В настоящем изобретении заявляется способ получения полипептида, заключающийся в конденсации предшественников, которые представляют собой аминокислоту и адаптор, в присутствии рибосом или р-РНК, или крупного фрагмента рибосомы, или белков рибосомы, а также третичного ароматического амина. Изобретение позволяет синтезировать полипептиды без использования АТФ и ГТФ. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл.
Description
Изобретение относится к способам получения полипептидов.
Известен способ получения полипептидов в свободной от клеток трансляционной системе, при осуществлении которого требуются рибосомы, источники химической энергии, такие как АТФ и ГТФ, и растворимые белковые факторы.
Однако указанный способ не всегда является удовлетворительным, поскольку он требует использования источников энергии и растворимых белковых факторов. По этой причине осуществление указанного способа оказывается настолько сложным, что он не имеет практической ценности для получения полипептидов.
Учитывая отмеченные обстоятельства, авторы настоящего изобретения провели интенсивное исследование способа получения полипептидов в свободной от клеток трансляционной системе и обнаружили, что конденсацию предшественников, которые представляют собой аминокислоты и адаптор, можно эффективно осуществить, не используя источники энергии, такие как АТФ и ГТФ, и растворимые белковые факторы, но в присутствии рибосом и ароматических третичных аминов.
Таким образом, в настоящем изобретении заявляется способ получения полипептида, который заключается в конденсации предшественников, представляющих собой аминокислоту и адаптор, в присутствии рибосом, p-РНК, крупного фрагмента рибосомы или белков рибосомы и ароматического третичного амина.
Заявляется также способ получения полипептида, который включает следующие стадии:
(а) взаимодействие аминокислоты с молекулой адаптора в присутствии аминоацил-т-РНК-синтазы с целью получения предшественника, включающего аминокислоту и адаптор на основе нуклеиновой кислоты; и
(б) конденсацию предшественника в присутствии рибосом, p-РНК, крупного фрагмента рибосомы или белков рибосомы и в присутствии ароматического третичного амина.
(а) взаимодействие аминокислоты с молекулой адаптора в присутствии аминоацил-т-РНК-синтазы с целью получения предшественника, включающего аминокислоту и адаптор на основе нуклеиновой кислоты; и
(б) конденсацию предшественника в присутствии рибосом, p-РНК, крупного фрагмента рибосомы или белков рибосомы и в присутствии ароматического третичного амина.
В соответствии с настоящим изобретением конденсацию предшественников, которые представляют собой аминокислоту и адаптор, можно эффективно осуществить, не используя источники энергии, такие как АТФ и ГТФ, и растворимые белковые факторы, но в присутствии рибосом и ароматического третичного амина.
Прежде всего будет дано описание способа получения полипептида, который заключается в конденсации аминокислоты и адаптора в присутствии рибосом, p-РНК, крупного фрагмента рибосомы или белков рибосомы и в присутствии ароматического третичного амина.
Реакцию конденсации предшественника обычно проводят в присутствии рибосом, p-РНК, крупного фрагмента рибосомы или белков рибосомы и в присутствии ароматического третичного амина.
Рибосомы, p-РНК, крупный фрагмент рибосомы или белки рибосомы, которые должны использоваться в указанной реакции, получают обычными способами, такими как экстракция из клеточного органа или организма, которые могут быть получены естественным путем или куплены на рынке.
Рибосомы E.coli получают следующим способом. Например, смешивают E.coli с буферным раствором и растирают в ступке или во французском прессе, получая суспензию, которую далее помещают в ультрацентрифугу, и отделяют жидкость над осадком. Жидкость над осадком разделяют центрифугированием и получают рибосомы E.coli. Далее, крупные фрагменты рибосом и белки рибосом можно получить, используя известный способ в градиенте плотности сахарозы.
Организмы, которые могут быть эукариотными и прокариотными, включают, например, млекопитающих, насекомых, растения, такие как морские водоросли, лишайники, папоротники, голосемянные, покрытосемянные, грибки, бактерии, плесени и дрожжи. Предпочтительными примерами организмов являются: млекопитающие, в том числе крыса, мышь, корова и коза; морские водоросли, в том числе зеленые водоросли и сине-зеленые водоросли; покрытосемянные, в том числе пшеница, рис, табак, помидоры и т.п.; бактерии, в том числе Escherichia, Bacillus, Pseudomonas и т.п.; плесени, в том числе Neurospora, Aspergillus, Penicillum и т.п.; и дрожжи, в том числе Saccharomyces и т.п.
В качестве источника рибосом, p-РНК, больших фрагментов рибосомы или белков рибосом предпочтительно используют термофильные бактерии, такие как Bacillus Strearothermophilus, aguiatucus и Thermus thermophilus, которые не только обладают сопротивляемостью к действию высоких температур, но м менее чувствительны к денатурации под действием органического растворителя.
Примером клеточных органов являются митохондрия и хлоропласт.
По настоящему изобретению можно использовать рибосомы, промытые водным раствором с большой концентрацией катионов. Экстракцию белка хромосомы можно осуществить обычными способами, такими, которые описаны в монографии "Ribosomes and Protein Synthesis: A Practical Approach (G. Spedding, Oxford University Press, 1990)".
Ароматические амины, которые используются в настоящем процессе, включают производное пиридина, производные амидазола, производные пуриновых оснований и производные пиримидиновых оснований.
Производные пиридина, которые следует использовать в настоящем способе, могут быть представлены формулой I:
где R независимо представляет член, выбранный из группы, включающий атом водорода, атом галогена, C1 - C4 алифатическую углеводородную группу, амино-группу, C5-C8 алициклическую углеводородную группу, C6 - C10 ароматическую углеводородную группу, гидроксильную группу, сульфгидрильную группу и гетероциклическую группу, содержащую по крайней мере один гетероатом, при этом все указанные группы, за исключением атома водорода или атома галогена, по выбору могут содержать заместители; альтернативно R представляет собой группу формулы: -COQ, где Q является атомом водорода, C1 - C4 алифатической углеводородной группой, амино-группой, C5-C6 ациклической углеводородной группой, C6-C10 ароматической углеводородной группой, гидроксильной группой, сульфгидрильной группой и гетероциклической группой, содержащей по крайней мере один гетероатом, при этом все указанные группы по выбору могут содержать заместители; а p обозначает целое число от 1 до 5.
где R независимо представляет член, выбранный из группы, включающий атом водорода, атом галогена, C1 - C4 алифатическую углеводородную группу, амино-группу, C5-C8 алициклическую углеводородную группу, C6 - C10 ароматическую углеводородную группу, гидроксильную группу, сульфгидрильную группу и гетероциклическую группу, содержащую по крайней мере один гетероатом, при этом все указанные группы, за исключением атома водорода или атома галогена, по выбору могут содержать заместители; альтернативно R представляет собой группу формулы: -COQ, где Q является атомом водорода, C1 - C4 алифатической углеводородной группой, амино-группой, C5-C6 ациклической углеводородной группой, C6-C10 ароматической углеводородной группой, гидроксильной группой, сульфгидрильной группой и гетероциклической группой, содержащей по крайней мере один гетероатом, при этом все указанные группы по выбору могут содержать заместители; а p обозначает целое число от 1 до 5.
Производные имидазола, которые следует использовать в настоящем способе, могут быть представлены формулой II:
где R имеет вышеуказанное значение; R' обозначает те же атомы и группы, что и приведенные для R, при условии, что она исключает атом галогена, амино-группу, гидроксильную группу и сульфгидрильную группу, при этом те же атомы и группы исключаются из Q; R и R' не зависят друг от друга; а m обозначает целое число от 1 до 3.
где R имеет вышеуказанное значение; R' обозначает те же атомы и группы, что и приведенные для R, при условии, что она исключает атом галогена, амино-группу, гидроксильную группу и сульфгидрильную группу, при этом те же атомы и группы исключаются из Q; R и R' не зависят друг от друга; а m обозначает целое число от 1 до 3.
Производные пуриновых оснований включают соединение, представленное формулой III:
где R и R' имеют вышеуказанное значение и независимы друг от друга; а m обозначает целое число от 1 до 3, и соединение формулы IV:
где R и R' имеют вышеуказанное значение, R'' обозначает те же атомы и группы, приведенные для R при условии, что она исключает атом галогена, амино-группу, гидроксильную группу и сульфгидрильную группу, при этом те же атомы и группы исключаются из Q; R, R' и R'' не зависят друг от друга; а k обозначает целое число от 1 до 2:
Производные пиримидиновых оснований включают соединение, представленное формулой V:
где R имеет вышеуказанное значение, а n обозначает целое число от 1 до 4;
соединение формулы VI:
где R, R' и n имеют вышеуказанное значение, и R и R' не зависят друг от друга; и
соединение формулы VII:
где R, R' имеют вышеуказанное значение и не зависят друг от друга; а m обозначает целое число от 1 до 3.
где R и R' имеют вышеуказанное значение и независимы друг от друга; а m обозначает целое число от 1 до 3, и соединение формулы IV:
где R и R' имеют вышеуказанное значение, R'' обозначает те же атомы и группы, приведенные для R при условии, что она исключает атом галогена, амино-группу, гидроксильную группу и сульфгидрильную группу, при этом те же атомы и группы исключаются из Q; R, R' и R'' не зависят друг от друга; а k обозначает целое число от 1 до 2:
Производные пиримидиновых оснований включают соединение, представленное формулой V:
где R имеет вышеуказанное значение, а n обозначает целое число от 1 до 4;
соединение формулы VI:
где R, R' и n имеют вышеуказанное значение, и R и R' не зависят друг от друга; и
соединение формулы VII:
где R, R' имеют вышеуказанное значение и не зависят друг от друга; а m обозначает целое число от 1 до 3.
В приведенных выше формулах I - VII примерами C1 - C4 алифатических углеводородных групп в R, R' и R'' являются метильная группа, этильная группа, н-пропильная группа, изо-пропильная группа, н-бутильная группа, втор-бутильная группа, изобутильная группа и трет-бутильная группа.
Примерами C5-C8 алициклических углеводородных групп являются циклопентильная группа, циклогексильная группа, циклопентильная группа и циклооктильная группа.
Примерами C6-C10 ароматических углеводородных групп являются фенильная группа и нафтильная группа.
Примерами атома галогена являются атом фтора, атом хлора, атом брома и атом иода.
Примерами гетероатома в гетероциклической группе являются атом кислорода, атом азота или атом серы. Примерами гетероциклической группы, содержащей по крайней мере один гетероатом, при этом указанная группа может быть необязательно замещена, являются рибозильная группа, дезоксирибозильная группа и их монофосфатное, фосфодиэфирное или трифосфатное производное.
Примерами пиридиновых производных являются альфа-пиколин, бета-пиколин, гамма-пиколин, 2-аминопиридин, 3-аминопиридин, 4-аминопиридин и 4-диметиламинопиридин.
Примерами производных имидазола являются имидазол и 1-метилимидазол.
Примерами производных пуриновых оснований являются гуанидин, пурин, аденин, 9-метиладенин, 7-метиладенин, аденозин, 2'-дезоксиаденозин, аденозин-5'-монофосфат, аденозин-5'-дифосфат и гуанозинтрифосфат.
Примерами производных пиримидиновых оснований являются цитозин, урацин, тимин, цитидин, 2'-дезоксицитидин, цитидил-5'-монофосфат и цитидил-5'-дифосфат. Однако третичные ароматические амины не ограничиваются приведенными примерами.
Концентрация третичного ароматического амина специально не оговаривается и предпочтительная концентрация третичного ароматического амина меняется в зависимости от типа основания.
Однако предпочтительная концентрация третичного ароматического амина обычно лежит в интервале от концентрации насыщения в воде до 1/10 или преимущественно до 1/10 от концентрации насыщения. Например, предпочтительная концентрация пиридина, пиримидина или имидазола составляет от 10 нМ до приблизительно 10 М; от 1 нМ до приблизительно 1 М для пурина, 2-аминопиридина, 4-аминопиридина или 4-диметиламинопиридина; от 10 пМ до приблизительно 100 мМ для аденозин-5'-дифосфата или цитидил-5'-дифосфата; и от 10 пМ до приблизительно 10 мМ для аденина и гуанидина.
pH растворителя, в котором производят конденсацию, специально не оговаривают, однако с точки зрения повышения выхода она предпочтительно составляет от 5 до 11, более предпочтительно от 6 до 10.
Настоящую реакцию конденсации для более эффективного ее осуществления преимущественно проводят в присутствии подходящих катионов, таких как магний и по крайней мере одного иона, выбранного из иона калия или иона аммония.
Концентрация ионов калия или ионов аммония предпочтительно составляет от 50 мМ до 500 мМ, более предпочтительно от 100 мМ до 300 мМ. Что касается концентрации ионов магния, то она предпочтительно составляет от 1 мМ до 500 мМ, более предпочтительно от 5 мМ до 300 мМ.
Для ускорения реакции конденсации могут быть добавлены такие ионы, как ионы цинка, ионы железа, ионы меди или ионы марганца.
Температура реакции обычно составляет от 0 до 90oC. Если используют рибосомы высокотермофильных бактерий, то реакцию можно проводить в интервале от 30 до 90oC. Если используют рибосомы термофильных бактерий, то температура реакции преимущественно составляет от 30 до 80oC. Если используют другие рибосомы, то температура реакции предпочтительно составляет от 30 до 70oC, более предпочтительно от 30 до 60oC.
Указанную реакцию конденсации для ее ускорения можно проводить в присутствии других добавок. Примерами таких добавок являются полиамины, такие как спермин и спермидин, полиэтиленгликоли, глицерины и спирты.
Настоящую реакцию преимущественно проводят в присутствии молекулы-шаблона, представляющей собой нуклеиновую кислоту, которая взаимодействует с молекулами адаптора.
Примерами таких молекул-шаблонов являются нужные и-РНК или их производные, которые присутствуют в живых клетках, или и-РНК, получаемые синтетическими ферментативными методами. Далее, в качестве шаблона можно использовать такие соединения как полиуридиловая кислота (поли(U)), полиадениловая кислота (поли(A)) или их блок-сополимер (например, поли (UA)), которые выполняют синтетические функции и-РНК.
В качестве шаблона возможно также использование кодирования полезных белков нуклеиновыми кислотами. Примерами полезных белков являются биологически активные пептиды, такие как человеческий гормон роста, фармацевтические белки, белки, участвующие в реакции антиген - антитело, и ферменты, которые катализируют биологические процессы.
Предшественники, представляющие собой аминокислоты и адапторы, включают аминоацил-т-РНК, которую обычно получают взаимодействием аминокислоты и молекулой м-РНК, играющей роль адаптора, в присутствии аминоацил-т-РНК-синтетазы или же синтезируют химическим путем из аминокислоты и соответствующего адаптора.
Аминокислотой, которую следует использовать в настоящем изобретении, может быть соединение, содержащее в одной и той же молекуле карбоксильную группу и амино-группу, или природная или не встречающаяся в природе аминокислота. Атом углерода, к которому присоединена амино-группа, может занимать любое положение в углеродной цепи, содержащей карбоксильную группу, а количество амино-групп и карбоксильных групп в молекуле не ограничено. Если указанные аминокислоты имеют хиральные центры, то они включают I-аминокислоты, D-аминокислоты и их рацемические смеси.
Примерами аминокислот, которые следует использовать по настоящему изобретению, являются: входящие в состав белков (природные) аминокислоты, такие как аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глютамин, глютаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин и их производные; бета-аланин, гамма-аминомасляная кислота, 5-аминолевулиновая кислота и их производные, которые все присутствуют в живых клетках; и аминокислоты, которые не встречаются в живых клетках, такие как п-, м- и о-аминобензойная кислота.
Примерами адаптора являются нуклеиновые кислоты, такие как м-РНК (например, описанные в G.Fasman, ed., "Handbook of Biochemistry and Molecular Biology" 3 rd Ed., Vol. 2, p. 423 CRR press (1975) и D.H.Gauss, M.Sprizl, Nucleic Acid Res., 9 rl (1981)) или их разновидности, которые можно специальным образом комбинировать с соответствующими аминокислотами, находящимися в живых клетках или получаемых синтетическими ферментативными способами.
Реакцию адаптора с аминокислотой проводят, например, в присутствии аминоацил-т-РНК-синтетазы, которую можно получить такими способами, как описано в "Seikagaku Jikken Koza", Vol.7, Chapter 1, Edited by Biochemical Society of Jahan, 1975.
Реакцию можно также осуществить синтетическими методами.
Реакцию адапторов с аминокислотами можно, например, провести в одном реакционном сосуде или в различных реакционных сосудах для каждой аминокислоты при температуре 37oC. В таком случае в соответствующую реакцию конденсации вводят растворитель, в то время как концентрация реагентов, если это необходимо, поддерживается на заданном уровне.
После того, как получают предшественник, такой как аминоацил-т-РНК, его можно выделить из реакционной смеси, а затем ввести в реакцию конденсации.
По завершении реакции полипептид может быть выделен стандартным способом.
Наконец, настоящее изобретение детально поясняется следующими примерами, которые однако не ограничивают настоящее изобретение.
Пример 1.
Готовят раствор 5 мМ хлорида магния, 10 мМ хлорида калия, 2 мМ АТФ, (L)-[14С] -фенилаланина с активностью 5 мкКи/мл и 3,0 A280/мл аминоацил-т-РНК-синтетазы (это выражение обозначает концентрацию аминоацил-т-РНК-синтетазы, определяемую по поглощению при длине волны 280 нм для 1 мл раствора), которую получают из раствора клеточного экстракта E.coli A 19. Экстракцию фермента проводят в соответствии с методом, приведенным в "Seikagaku Jikken Koza", Vol.7, Chapter1, Edited by Biochemical Society of Japan, 1975.
Полученную реакционную смесь выдерживают 5 минут при температуре 37oC и получают фенилаланил-т-РНК (который далее обозначают как "[14C]-фенилаланил-т-РНК" или "Phe-tRNAPhe" в качестве предшественника реакции конденсации. Затем [14C] -фенилаланил-т-РНК выделяют после экстракции фенолом концентрированием на центрифуге (Microcon-10, Amicon, 12000 об/мин, при 0oC, 1 час, три раза). Полученный исходный буферный раствор содержит 37,5 мкг/мл (1500 отсчетов в минуту/мкл) Phe-tRNAPhe, 20 мМ ПаОАс (pH 4,5) и 5 мМ MgCl2.
Далее, получают раствор 15 мМ хлорида магния, 120 мМ хлорида калия и 16 A260/мл рибосом, выделенных из 25 мкл E.coli A19, используя 1 мкл раствора Phe-tRNAPhe, полученного ранее (две репликации). Метод получения соответствует приведенному в монографии "Ribosomes and Protein Synthesis: A Practical Approach (G.Spedding, Oxford University Press, 1990)".
Один из приготовленных выше растворов разбавляют 50%-ным водным пиридином, а затем дают ему прореагировать при 37oC в течение 60 минут, получая полифенилаланин.
Добавляют в реакционную смесь 10 мкл воды и 1 мкл 1 N раствора едкого кали и оставляют смесь реагировать при 37oC в течение 60 минут, а затем непрореагировавший Phe-tRNAPhe подвергают гидролизу.
Аликвоты полученной реакционной смеси исследуют методом тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем (Silica-Gel 60, Merck), элюируя смесью 1-бутанол/вода/уксусная кислота = 4/1/1, и обрабатывают проявителем (BAS 2000 фирмы Fuji Photo Film Co., Ltd).
Через 12 часов [14-С]-полифенилаланин определяют по значению Rf, величина которого составляет более 0,58 и соответствует аутентичному образцу тримера.
Методом жидкостной хроматографии высокого разрешения было показано, что полученный полифенилаланин представляет собой полипептид, состоящий из более чем десяти аминокислот. Если в указанной реакции отсутствуют рибосомы, то реакция конденсации не протекает.
Пример 2.
Реакцию проводят аналогично методике, приведенной в примере 1, используя Thermus thermophilus HB 27 вместо E.coli, и получают полифенилаланин.
Пример 3
Реакцию проводят при 60oC аналогично методике, приведенной в примере 1, используя Thermus thermophilus, HB 27 вместо E.coli, и получают полифенилаланин.
Реакцию проводят при 60oC аналогично методике, приведенной в примере 1, используя Thermus thermophilus, HB 27 вместо E.coli, и получают полифенилаланин.
Пример 4.
Рибосомы, выделенные из E.coli, подвергают центрифугированию, применяя 10%-20% градиент плотности сахарозы для выделения большего фрагмента и меньшего фрагмента. Из выделенных фрагментов только больший фрагмент обладает способностью интенсивно производить полифенилаланин по методике, приведенной в примере 1.
Пример 5
Рибосомы, выделенные из E.coli, обрабатывают фенолами для отделения белков и получают рибосомную РНК; а затем проводят реакцию конденсации в присутствии рибосомальной РНК аналогично методике, приведенной в примере 1, и получают полифенилаланин.
Рибосомы, выделенные из E.coli, обрабатывают фенолами для отделения белков и получают рибосомную РНК; а затем проводят реакцию конденсации в присутствии рибосомальной РНК аналогично методике, приведенной в примере 1, и получают полифенилаланин.
Пример 6
Рибосомы ферментатируют с помощью 1 мг/мл протеиназы К в присутствии 0,5% додецилсульфата натрия при 37oC в течение 1 час с целью отделения белка рибосомы. Реакцию проводят в присутствии р-РНК вместо рибосом аналогично методике, приведенной в примере 1, и получают полифенилаланин.
Рибосомы ферментатируют с помощью 1 мг/мл протеиназы К в присутствии 0,5% додецилсульфата натрия при 37oC в течение 1 час с целью отделения белка рибосомы. Реакцию проводят в присутствии р-РНК вместо рибосом аналогично методике, приведенной в примере 1, и получают полифенилаланин.
Пример 7.
В данном примере в качестве шаблона используют 0,4 мг/мл полиуридиловой кислоты, поставляемой фирмой Sigma Corp, а другие условия реакции те же, что и в примере 1.
По окончании реакции аликвоты полученного раствора подвергают тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем (Silica-Gel 60, Merck), элюируя смесью 1-бутанол/вода/уксусная кислота = 4/1/1, и обрабатывают проявителем (BAS 2000 фирмы Fuji Photo Film Co., Ltd).
Через 12 часов [14C]-полифенилаланин определяют по значению Rf, величина которого составляет более 0,58.
Если в реакционной системе отсутствуют рибосомы или пиридин, то реакция конденсации не наблюдается.
Примеры 8-19
В данных примерах реакции конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что концентрации ионов магния и ионов калия меняют в соответствии с данными, приведенными в таблице 1. Выход полифенилаланина рассчитывают по уровню радиоактивности.
В данных примерах реакции конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что концентрации ионов магния и ионов калия меняют в соответствии с данными, приведенными в таблице 1. Выход полифенилаланина рассчитывают по уровню радиоактивности.
Примеры 20-26
В данных примерах реакции конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что меняют температуру реакции в соответствии с данными, приведенными в таблице 2. Выход полифенилаланина рассчитывают по уровню радиоактивности.
В данных примерах реакции конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что меняют температуру реакции в соответствии с данными, приведенными в таблице 2. Выход полифенилаланина рассчитывают по уровню радиоактивности.
Примеры 27-33
В данных примерах реакции конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что в концентрации пиридина меняют в соответствии с данными, приведенными в таблице 3. Выход полифенилаланина рассчитывают по уровню радиоактивности.
В данных примерах реакции конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что в концентрации пиридина меняют в соответствии с данными, приведенными в таблице 3. Выход полифенилаланина рассчитывают по уровню радиоактивности.
Примеры 34
В данном примере реакцию конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что вместо пиридина используют третичный ароматический амин, такой как N, N-диметиланилин, 4-диметиламинопиридин, аденин, аденозин, аденозинтрифосфат, гуанидин, гуанозин и/или гуанозинтрифосфат, и получают полифенилаланин.
В данном примере реакцию конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что вместо пиридина используют третичный ароматический амин, такой как N, N-диметиланилин, 4-диметиламинопиридин, аденин, аденозин, аденозинтрифосфат, гуанидин, гуанозин и/или гуанозинтрифосфат, и получают полифенилаланин.
Пример 35
В данном примере реакцию конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что вместо целых рибосом, выделенных из E.coli, используют рибосомальную РНК, полученную удалением белков из целой рибосомы с помощью фенола, и получают полифенилаланин.
В данном примере реакцию конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что вместо целых рибосом, выделенных из E.coli, используют рибосомальную РНК, полученную удалением белков из целой рибосомы с помощью фенола, и получают полифенилаланин.
Пример 36
Реакцию конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, используя фенилаланин и лизин, блок-сополимер рибонуклеиновой кислоты, представленной формулой:
в качестве шаблона, и целую рибосому, фрагмент рибосомы или р-РНК, которые выделяют из E.coli.
Реакцию конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, используя фенилаланин и лизин, блок-сополимер рибонуклеиновой кислоты, представленной формулой:
в качестве шаблона, и целую рибосому, фрагмент рибосомы или р-РНК, которые выделяют из E.coli.
Получают чередующийся сополимер с очень высокой регулярной координацией, который состоит из чередующихся звеньев:
-(-Phe-Lys-)-.
-(-Phe-Lys-)-.
Примеры 37-48
В данных примерах реакции конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что концентрации ионов магния и калия составляют 200 мМ, время реакции составляет 12 час, а концентрацию третичного ароматического амина меняют в соответствии с данными, приведенными в таблице 4.
В данных примерах реакции конденсации проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, за исключением того, что концентрации ионов магния и калия составляют 200 мМ, время реакции составляет 12 час, а концентрацию третичного ароматического амина меняют в соответствии с данными, приведенными в таблице 4.
В таблице 4 приведены данные экспериментов, в которых используются пиридины, имидазолы, пуриновые основания и пиримидиновые основания, и также получают полифенилаланин.
Пример 49
Рибосомы ферментатируют с помощью 1 мг/мл протеиназы К в присутствии 0,5% додецилсульфата натрия при 37oC в течение 1 час с целью отделения белка рибосомы. Полученную указанным способом р-РНК используют вместо рибосом аналогично методике, приведенной в примере 7, и получают полифенилаланин.
Рибосомы ферментатируют с помощью 1 мг/мл протеиназы К в присутствии 0,5% додецилсульфата натрия при 37oC в течение 1 час с целью отделения белка рибосомы. Полученную указанным способом р-РНК используют вместо рибосом аналогично методике, приведенной в примере 7, и получают полифенилаланин.
Пример 50
В этом примере реакцию проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, используя вместо E.coli термофильную бактерию (Thermus thermophilus, HB 27), и получают полифенилаланин.
В этом примере реакцию проводят аналогично методике, приведенной в примере 7, используя вместо E.coli термофильную бактерию (Thermus thermophilus, HB 27), и получают полифенилаланин.
Пример 51
Полилизин получают из лизина по методике, аналогичной приведенной в примере 7, используя рибосомы E.coli или по методике, приведенной в примере 50, используя рибосомы термофильной бактерии (Thermus thermophilus, HB 27), и полиадениловую кислоту в качестве шаблона.
Полилизин получают из лизина по методике, аналогичной приведенной в примере 7, используя рибосомы E.coli или по методике, приведенной в примере 50, используя рибосомы термофильной бактерии (Thermus thermophilus, HB 27), и полиадениловую кислоту в качестве шаблона.
Пример 52
Редуктазу дегидрофолиевой кислоты получают из двадцати аминокислот, используя в качестве шаблона РНК-кодирование редуктазы дегидрофолиевой кислоты, а остальные условия аналогичны примеру 7.
Редуктазу дегидрофолиевой кислоты получают из двадцати аминокислот, используя в качестве шаблона РНК-кодирование редуктазы дегидрофолиевой кислоты, а остальные условия аналогичны примеру 7.
Пример 53.
Рибосомы, выделенные из E.соli, подвергают центрифугированию, используя 10%-20% градиент плотности сахарозы для выделения большего фрагмента и меньшего фрагмента. Из выделенных фрагментов только больший фрагмент обладает способностью интенсивно производить полифенилаланин при его использовании вместо рибосомы по методике, приведенной в примере 7.
Claims (6)
1. Способ получения полипептида, включающий поликонденсацию в свободной от клеток системе, отличающийся тем, что поликонденсацию предшественника, содержащего аминокислоту и адаптор на основе нуклеиновой кислоты, осуществляют в присутствии рибосом, или pPHK, или крупного фрагмента рибосомы, или белков рибосомы, а также третичного ароматического амина при отсутствии растворимых белковых факторов и соединения, являющегося источником энергии.
2. Способ получения полипептида, включающий поликонденсацию в свободной от клеток системе, отличающийся тем, что предварительно проводят взаимодействие аминокислоты с молекулой адаптора на основе нуклеиновой кислоты в присутствии аминоацил-ТPHK-синтетазы для получения предшественника, включающего аминокислоту и адаптор на основе нуклеиновой кислоты, а поликонденсацию предшественника осуществляют в присутствии рибосом, или pPHK, или крупного фрагмента рибосомы, или белков рибосомы, а также третичного ароматического амина при отсутствии растворимых белковых факторов и соединения, являющегося источником энергии.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что поликонденсацию проводят в присутствии молекулы-шаблона, представляющей собой нуклеиновую кислоту, соединенную с молекулой адаптора.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что третичный ароматический амин выбирают из группы, содержащей производные пиридина формулы I
где R выбирают из группы, содержащей атом водорода, атом галогена, алифатическую группу, содержащую от одного до четырех атомов углерода, аминогруппу, ациклическую углеводородную группу, содержащую от пяти до восьми атомов углерода, гидроксильную группу, меркаптогруппу и гетероциклическую группу, содержащую, по меньшей мере, один гетероатом, причем все указанные группы могут быть замещены, или R представляет собой группу -COQ, где Q выбирают из группы, содержащей атом водорода, алифатическую группу, содержащую от одного до четырех атомов углерода, аминогруппу, ациклическую группу, содержащую от пяти до восьми атомов углерода, ароматическую группу, содержащую от шести до десяти атомов углерода, гидроксильную группу, меркаптогруппу и гетероциклическую группу, содержащую, по меньшей мере, один гетероатом, причем все указанные группы могут быть замещены, а R означает целое число от 1 до 5,
или производные имидазола формулы II
где R имеет вышеуказанные значения,
R' выбирают из группы, содержащей атом водорода, алифатическую группу, содержащую от одного до четырех атомов углерода, ациклическую группу, содержащую от пяти до восьми атомов углерода, ароматическую группу, содержащую от шести до десяти атомов углерода и гетероциклическую группу, содержащую, по меньшей мере, один гетероатом, причем все указанные группы могут быть замещены, или R' представляет собой группу -COQ, где Q выбирают из группы, содержащей атом водорода, алифатическую группу, содержащую от одного до четырех атомов углерода, ациклическую группу, содержащую от пяти до восьми атомов углерода, ароматическую группу, содержащую от шести до десяти атомов углерода, и гетероциклическую группу, содержащую, по меньшей мере, один гетероатом, причем R и R' не зависят друг от друга;
m обозначает целое число от 1 до 3,
или производные пуриновых оснований формулы III
где R и R' имеют вышеуказанные значения и не зависят друг от друга;
m обозначает целое число от 1 до 3,
и формулы IV
где R и R' имеют вышеуказанные значения;
R'' соответствует значениям R', причем R, R' и R'' не зависят друг от друга;
k обозначает целое число от 1 до 2,
или производные пиримидиновых оснований формулы V
где R имеет вышеуказанные значения;
n обозначает целое число от 1 до 4,
или формулы VI
где R, R' и n имеют вышеуказанные значения, причем R и R' не зависят друг от друга,
или формулы VII
где R и R' имеют вышеуказанные значения и не зависят друг от друга;
m обозначает целое число от 1 до 3.
где R выбирают из группы, содержащей атом водорода, атом галогена, алифатическую группу, содержащую от одного до четырех атомов углерода, аминогруппу, ациклическую углеводородную группу, содержащую от пяти до восьми атомов углерода, гидроксильную группу, меркаптогруппу и гетероциклическую группу, содержащую, по меньшей мере, один гетероатом, причем все указанные группы могут быть замещены, или R представляет собой группу -COQ, где Q выбирают из группы, содержащей атом водорода, алифатическую группу, содержащую от одного до четырех атомов углерода, аминогруппу, ациклическую группу, содержащую от пяти до восьми атомов углерода, ароматическую группу, содержащую от шести до десяти атомов углерода, гидроксильную группу, меркаптогруппу и гетероциклическую группу, содержащую, по меньшей мере, один гетероатом, причем все указанные группы могут быть замещены, а R означает целое число от 1 до 5,
или производные имидазола формулы II
где R имеет вышеуказанные значения,
R' выбирают из группы, содержащей атом водорода, алифатическую группу, содержащую от одного до четырех атомов углерода, ациклическую группу, содержащую от пяти до восьми атомов углерода, ароматическую группу, содержащую от шести до десяти атомов углерода и гетероциклическую группу, содержащую, по меньшей мере, один гетероатом, причем все указанные группы могут быть замещены, или R' представляет собой группу -COQ, где Q выбирают из группы, содержащей атом водорода, алифатическую группу, содержащую от одного до четырех атомов углерода, ациклическую группу, содержащую от пяти до восьми атомов углерода, ароматическую группу, содержащую от шести до десяти атомов углерода, и гетероциклическую группу, содержащую, по меньшей мере, один гетероатом, причем R и R' не зависят друг от друга;
m обозначает целое число от 1 до 3,
или производные пуриновых оснований формулы III
где R и R' имеют вышеуказанные значения и не зависят друг от друга;
m обозначает целое число от 1 до 3,
и формулы IV
где R и R' имеют вышеуказанные значения;
R'' соответствует значениям R', причем R, R' и R'' не зависят друг от друга;
k обозначает целое число от 1 до 2,
или производные пиримидиновых оснований формулы V
где R имеет вышеуказанные значения;
n обозначает целое число от 1 до 4,
или формулы VI
где R, R' и n имеют вышеуказанные значения, причем R и R' не зависят друг от друга,
или формулы VII
где R и R' имеют вышеуказанные значения и не зависят друг от друга;
m обозначает целое число от 1 до 3.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что R обозначает атом водорода, метильную группу, аминогруппу и диметиламиногруппу, а R' и R'' независимо обозначают атом водорода, метильную группу, рибозильную группу, дезоксирибозильную группу, 5'-монофосфорибозильную группу, 5'-монофосфодезоксирибозильную группу, 5'-дифосфорибозильную группу, 5'-дифосфодезоксирибозильную группу.
6. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве пиридинов используют альфа-пиколин, бета-пиколин, гамма-пиколин, 2-аминопиридин, 3-аминопиридин-4-аминопиридин или 4-диметиламинопиридин, в качестве имидазолов используют имидазол или 1-метилимидазол, в качестве пуриновых оснований используют гуанидин, пурин, аденин, 9-метиладенин, 7-метиладенин, аденозин, 2'-дезоксиаденозин, аденозин-5'-монофосфат или аденозин-5'-дифосфат, а в качестве пиримидиновых оснований используют цитозин, урацил, тимин, цитидин, 2'-дезоксицитидин, цитидил-5'-монофосфат или цитидил-5'-дифосфат.
Приоритет по пунктам:
04.10.93 - по пп.1 - 3;
04.03.94 - по пп.4 - 6.
04.10.93 - по пп.1 - 3;
04.03.94 - по пп.4 - 6.
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05248168 | 1993-10-04 | ||
| JP248168/1993 | 1993-10-04 | ||
| JP24816893 | 1993-10-04 | ||
| JP034835/1994 | 1994-03-04 | ||
| JP3483494 | 1994-03-04 | ||
| JP034834/1994 | 1994-03-04 | ||
| JP06034834 | 1994-03-04 | ||
| JP102862/1994 | 1994-05-17 | ||
| JP102861/1994 | 1994-05-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94035681A RU94035681A (ru) | 1997-03-27 |
| RU2145976C1 true RU2145976C1 (ru) | 2000-02-27 |
Family
ID=26373698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94035681A RU2145976C1 (ru) | 1993-10-04 | 1994-10-03 | Способ получения полипептида (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2145976C1 (ru) |
-
1994
- 1994-10-03 RU RU94035681A patent/RU2145976C1/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94035681A (ru) | 1997-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5643744A (en) | Method for producing polypeptide | |
| Sharma et al. | Efficient introduction of aryl bromide functionality into proteins in vivo | |
| Izard | The crystal structures of phosphopantetheine adenylyltransferase with bound substrates reveal the enzyme’s catalytic mechanism | |
| Soulimane et al. | Cytochrome-c552fromThermus thermophilus: A Functional and Crystallographic Investigation | |
| Kwon et al. | Dissection of glutathionylspermidine synthetase/amidase from Escherichia coli into autonomously folding and functional synthetase and amidase domains | |
| CN103820410B (zh) | 3-甲硫酪氨酸翻译系统及其应用 | |
| EP0247819B1 (en) | Process for producing diadenosine tetraphosphate and derivatives thereof | |
| RU2145976C1 (ru) | Способ получения полипептида (варианты) | |
| Murthy | Protein synthesis in growing rat tissues: I. Effect of various metabolites and inhibitors on phenylalanine incorporation by brain and liver ribosomes | |
| JPH0329399B2 (ru) | ||
| Agris et al. | The modified nucleosides in transfer RNA | |
| Hori et al. | Synthesis of 5-methyluridine by a thermophile, Bacillus stearothermophilus JTS 859 | |
| Detke et al. | DNA-dependent RNA polymerases from Acanthamoeba castellanii: Properties and levels of activity during encystment | |
| Barbolina et al. | Serine 51 residue of Citrobacter freundii tyrosine phenol-lyase assists in C-α-proton abstraction and transfer in the reaction with substrate | |
| JP4066121B2 (ja) | グアノシン類及びその中間体の製造方法 | |
| Sugiyama et al. | Purification and characterization of streptomycin 6-kinase, an enzyme implicated in self-protection of a streptomycin-producing micro-organism | |
| Alcántara et al. | Carbamate kinase can replace in vivo carbamoyl phosphate synthetase. Implications for the evolution of carbamoyl phosphate biosynthesis | |
| Sagi et al. | Crystallography of ribosomes: Attempts at decorating the ribosomal surface | |
| Fukunaga et al. | Crystallization of leucyl-tRNA synthetase complexed with tRNALeu from the archaeon Pyrococcus horikoshii | |
| Moser et al. | Structure and function of glutamyl-tRNA reductase involved in 5-aminolaevulinic acid formation | |
| Cordoza et al. | Mechanistic and structural insights into a divergent PLP-dependent L-enduracididine cyclase from a toxic cyanobacterium | |
| Korber et al. | Crystallization of the NADP+-dependent glutamate dehydrogenase from Escherichia coli | |
| JPH01320995A (ja) | ヌクレオシド化合物の製造方法 | |
| JPH06261743A (ja) | 安定同位体標識酵母及びそのエキス並びに製造方法 | |
| JPS58146287A (ja) | Ｌ−システイン誘導体の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20121004 |