RU2105559C1 - Method of cytochrome c preparing - Google Patents
Method of cytochrome c preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2105559C1 RU2105559C1 RU95100463A RU95100463A RU2105559C1 RU 2105559 C1 RU2105559 C1 RU 2105559C1 RU 95100463 A RU95100463 A RU 95100463A RU 95100463 A RU95100463 A RU 95100463A RU 2105559 C1 RU2105559 C1 RU 2105559C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cytochrome
- extraction
- ammonium sulfate
- solution
- precipitate
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии. The invention relates to biotechnology.
Известен способ получения цитохрома C (авт. св. N 351546, кл. A 61 K 35/34) из сердец крупного рогатого скота. Способ включает измельчение сердца в фарш, экстракцию цитохрома C трихлоруксусной кислотой при pH 3,8-4,1; 2 высаливания балластных белков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохромата C 20%-ным раствором трихлоруксуной кислоты, отделение осадка центрифугированием. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают, размораживают и отфильтровывают, далее крепкий раствор цитохрома C оставят на диализ против физиологического раствора на сутки. Полученный раствор стерилизуют, фильтруют, фильтрат разводят физраствором до концентрации цитохрома 2,5 мг/мл, стерильно фильтруют, разливают во фланцы и лиофилизируют. A known method of producing cytochrome C (ed. St. N 351546, class A 61 K 35/34) from the hearts of cattle. The method includes grinding the heart into minced meat, extraction of cytochrome C with trichloroacetic acid at a pH of 3.8-4.1; 2 salting out of ballast proteins with crystalline ammonium sulfate, precipitation of cytochrome C with a 20% solution of trichloroacetic acid, separation of the precipitate by centrifugation. The collected precipitate is dissolved in distilled water, frozen, thawed and filtered, then a strong solution of cytochrome C will be left for dialysis against physiological saline for a day. The resulting solution was sterilized, filtered, the filtrate was diluted with saline to a concentration of cytochrome 2.5 mg / ml, sterile filtered, poured into flanges and lyophilized.
Этот способ не позволяет выделить цитохром из сердца гидробинтов. This method does not allow the isolation of cytochrome from the heart of the hydrobint.
Наиболее близким техническим решением является способ получения цитохрома C [1] Способ включает измельчение сердца морского котика в фарш, экстракцию цитохрома C трихлоруксусной кислотой при pH 3,8 4,1, нейтрализацию гидроксидом натрия до pH 6,0-7,0, высаливание балластных белков кристаллическим сульфатом аммония, осаждение цитохрома C 20%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, обработку осадка насыщенным раствором сульфата аммония, центрифугирование, отделение осадка центрифугированием. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают, размораживают и отфильтровывают, далее крепкий раствор цитохрома C ставят на диализ против физиологического раствора на сутки. Полученный раствор стерилизуют, фильтруют, фильтрат разводят физраствором до концентрации цитохрома 2,5 мг/мг, стерильно фильтруют, разливают во флаконы и лиолифилизируют. The closest technical solution is a method for producing cytochrome C [1] The method includes grinding the heart of a fur seal into minced meat, extraction of cytochrome C with trichloroacetic acid at pH 3.8 4.1, neutralization with sodium hydroxide to pH 6.0-7.0, salting out of ballast proteins with crystalline ammonium sulfate, precipitation of cytochrome C with a 20% solution of trichloroacetic acid, treatment of the precipitate with a saturated solution of ammonium sulfate, centrifugation, separation of the precipitate by centrifugation. The collected precipitate is dissolved in distilled water, frozen, thawed and filtered, then a strong solution of cytochrome C is put on dialysis against physiological saline for a day. The resulting solution was sterilized, filtered, the filtrate was diluted with saline to a concentration of cytochrome 2.5 mg / mg, sterile filtered, poured into vials and lyophilized.
Недостатком этого способа является невозможность выделения цитохрома C из сердца гидробионтов. The disadvantage of this method is the inability to isolate cytochrome C from the heart of aquatic organisms.
Задача, решаемая изобретением, получение цитохрома C из нового сырья - сердец гидробионтов, в котором аминокислотный состав соответствует цитохрому C человека. The problem solved by the invention, obtaining cytochrome C from a new raw material - the hearts of hydrobionts, in which the amino acid composition corresponds to human cytochrome C.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. The essence of the proposed method is as follows.
В качестве сырья используют сердце лососевых пород рыб. Сырье промывают от крови, измельчают (гомогенизируют). Фарш также отмывают от крови. К полученному фаршу добавляют 2,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) или 2% -ной серной кислоты до pH 4,8-5,5. Экстракт в течение 2 ч при периодическом перемешивании. As raw materials, the heart of salmon fish species is used. Raw materials are washed from the blood, crushed (homogenized). Stuffing is also washed from the blood. To the minced meat, add a 2.5% solution of trichloroacetic acid (TCA) or 2% sulfuric acid to a pH of 4.8-5.5. Extract for 2 hours with periodic stirring.
В экстракционную массу добавляют природный адсорбент-перлит в соотношении 4: 1. Экстракт отделяют фильтрованием, добавляют гидроокись натрия до pH 7,0 и осаждают белки кристаллическим сульфатом аммония. Natural adsorbent perlite was added to the extraction mass in a ratio of 4: 1. The extract was separated by filtration, sodium hydroxide was added to pH 7.0, and the proteins were precipitated with crystalline ammonium sulfate.
К фильтрату добавляют 20%-ный раствор ТХУ или 10% H2SO4. Выпадает осадок, который отделяют центрифугированием. Осадок обрабатывают раствором сульфата аммония и центрифугируют. Осадок цитохрома C растворяют в дистиллированной воде и замораживают при температуре минус 10 15oC, затем размораживают и фильтруют. Крепкий раствор цитохрома C ставят на диализ. Полученный раствор нагревают и фильтруют. Фильтрат разводят физиологическим раствором, стерильно фильтруют во флаконы и лиофилизуют.To the filtrate was added a 20% solution of TCA or 10% H 2 SO 4 . A precipitate formed which was separated by centrifugation. The precipitate is treated with a solution of ammonium sulfate and centrifuged. The precipitate of cytochrome C is dissolved in distilled water and frozen at a temperature of minus 10 15 o C, then thawed and filtered. A strong solution of cytochrome C is put on dialysis. The resulting solution was heated and filtered. The filtrate is diluted with physiological saline, sterilely filtered into vials and lyophilized.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Example 1
К 300 г фарша сердец лососевых (вид Oncorhynchus keta) добавляют 2,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты до pH 4,85 при t=18oC и два часа экстрагируют при периодическом перемешивании. В конце экстракции в экстракционную массу добавляют 60 г (из расчета 20 г на 100 г сырья) обработанного перлита марки Sil Flo 272. Выдерживают 30 мин. Экстракт отделяют на нутч-фильтре. Объем экстракта 280 мл.To 300 g of minced salmon hearts (type Oncorhynchus keta) add a 2.5% solution of trichloroacetic acid to a pH of 4.85 at t = 18 o C and extracted for two hours with periodic stirring. At the end of the extraction, 60 g (based on 20 g per 100 g of raw material) of treated perlite of the Sil Sil 272 brand are added to the extraction mass. They are aged 30 minutes. The extract is separated on a suction filter. The volume of the extract is 280 ml.
Для нейтрализации экстракта в него добавляют 10% NaOH до pH 7,05. Осаждают балластные белки кристаллическим сульфатом аммония (из расчета 500 г/л). На 200 мл экстракта добавляют 100 г сульфата аммония. Получают 230 мл фильтрата. To neutralize the extract, 10% NaOH is added thereto to a pH of 7.05. Ballast proteins are precipitated with crystalline ammonium sulfate (based on 500 g / l). 100 g of ammonium sulfate are added per 200 ml of extract. Receive 230 ml of the filtrate.
К полученному после первого высаливания прозрачному фильтрату при перемешивании 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 25 мл/л. Выпадает розовый осадок цитохрома C. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее осадок промывают раствором сульфата аммония из расчета 500 мл/кг сырья, центрифугируют, отделяют осадок. Собранный осадок растворяют в дистиллированной воде. Полученный раствор цитохрома замораживают. Размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор цитохрома C переливают в целлофановый пакетик и ставят на сутки на диализ против физраствора. Выход цитохрома 0,1 г/кг исходного сырья. To the clear filtrate obtained after the first salting out, with stirring, a 20% solution of trichloroacetic acid at a rate of 25 ml / l. A pink precipitate of cytochrome C precipitates. The precipitate is separated by centrifugation at 3000 rpm. Next, the precipitate is washed with a solution of ammonium sulfate at the rate of 500 ml / kg of raw material, centrifuged, the precipitate is separated. The collected precipitate is dissolved in distilled water. The resulting cytochrome solution is frozen. Defrost and filter. A strong solution of cytochrome C is poured into a plastic bag and put on dialysis against saline for a day. The output of cytochrome 0.1 g / kg of feedstock.
Природный адсорбент перлит обрабатывают следующим образом: перлит отмывают дистиллированной водой до pH 6, затем замачивают в подкисленной серной кислотой до pH 5,8 воде и выдерживают при помешивании 1 ч. Перлит отжимают через бязь или капрон и добавляют в фарш. The natural perlite adsorbent is treated as follows: perlite is washed with distilled water to pH 6, then soaked in acidified sulfuric acid to pH 5.8 and kept under stirring for 1 hour. Perlite is squeezed through calico or capron and added to the minced meat.
Пример 2. Example 2
Берут 100 г фарша из сердец лососевых (вид Oncorhynchus nerca) со сроком хранения 4,5 месяца в морозильнике при t=-8oC. Проводят экстракцию 2,5% ТХУ при pH 5,5 в течение 2 ч. В конце экстракции добавляют предварительно подготовленный, как и в примере 1, в количестве 25 г перлит марки Dicalite (США) и при перемешивании выдерживают 0,5 ч. Получают после фильтрации на нутч-фильтре 81 мл экстракта (pH 5,5).Take 100 g of minced meat from salmon hearts (type Oncorhynchus nerca) with a shelf life of 4.5 months in the freezer at t = -8 o C. Extraction is carried out with 2.5% TCA at pH 5.5 for 2 hours. At the end of extraction, add previously prepared, as in example 1, in an amount of 25 g of Dicalite brand perlite (USA) and kept under stirring for 0.5 hours. 81 ml of extract (pH 5.5) are obtained after filtration on a suction filter.
К экстракту добавляют 10% гидроксида натрия до pH 7,3. Для осаждения белков в экстракт добавляют кристаллический сульфат аммония из расчета 450 г/л, перемешивают и выдерживают 30 мин. Фильтруют через бумажные фильтры. Объем полученного фильтрата 62 мл. 10% sodium hydroxide was added to the extract to a pH of 7.3. To precipitate proteins, crystalline ammonium sulfate was added to the extract at a rate of 450 g / l, stirred and incubated for 30 minutes. Filter through paper filters. The volume of the obtained filtrate is 62 ml.
Из полученного фильтрата осаждают цитохром C 10% H2SO4, выпадает осадок цитохрома C, фильтруют, надосадочную жидкость сливают, а осадок обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония, центрифугируют. Собранный осадок цитохрома C растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Замораживают при t-12oC, размораживают и отфильтровывают для отделения криопреципитатных белков. Крепкий раствор цитохрома помещают в целлофановый пакетик, ставят на диализ против физраствора.Cytochrome C 10% H 2 SO 4 is precipitated from the obtained filtrate, a precipitate of cytochrome C precipitates, is filtered, the supernatant is drained, and the precipitate is treated with a saturated solution of ammonium sulfate and centrifuged. The collected cytochrome C precipitate was dissolved in 5 ml of distilled water. Freeze at t-12 o C, thaw and filter to separate cryoprecipitate proteins. A strong solution of cytochrome is placed in a plastic bag, put on dialysis against saline.
Выход цитохрома C от исходного сырья 0,090 г/кг исходного сырья. The yield of cytochrome C from the feedstock is 0.090 g / kg of feedstock.
Пример 3. Example 3
Берут 400 г свежих сердец лососевых (вид Oncorhynchus gorbuscha), промывают от крови, измельчают в фарш, еще раз промывают от крови. К приготовленному фаршу добавляют 2% H2SO4 до pH 4,9, t 23oC. Выход на режим 20 мин. В течение 2 ч проводят экстракцию. По окончании в экстракционную массу добавляют обработанный по примеру 1 перлит марки Flo R (Франция) из расчета 300 г/кг сырья, оставляют на 30 мин для осаждения белков. Отделяют жмых от экстракта через бязь. Далее проводят нейтрализацию экстракта 10% NaOH до pH 7,15.Take 400 g of fresh salmon hearts (a species of Oncorhynchus gorbuscha), washed from the blood, ground into minced meat, washed again from the blood. To the prepared minced meat add 2% H 2 SO 4 to a pH of 4.9, t 23 o C. Exit to the mode of 20 minutes Extraction is carried out for 2 hours. At the end, the perlite of the brand Flo R (France) treated in Example 1 is added to the extraction mass at the rate of 300 g / kg of raw material, left for 30 minutes to precipitate the proteins. Separate the cake from the extract through calico. Next, neutralize the extract with 10% NaOH to a pH of 7.15.
Проводят высаливание кристаллическим сульфатом аммония из расчета 450 г/л, на 280 мл фильтрата добавляют 126 г сульфата. После фильтрации объем фильтрата 335 мл. Salting out is carried out with crystalline ammonium sulfate at a rate of 450 g / l, 126 g of sulfate is added to 280 ml of the filtrate. After filtration, the filtrate volume is 335 ml.
Осаждают цитохром 20%-ной трихлоруксусной кислотой. К 330 мл фильтрата добавляют 6,6 трихлоруксусной кислоты из расчета 20 мл/л. Через 20-30 мин выпадает осадок цитохрома C. Отделяют его центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин и обрабатывают насыщенным раствором сульфата аммония до очистки от примесей. Собранный раствор в 1,7 мл дистиллированной воды. Полученный раствор цитохрома C замораживают при -12oC. Размораживают и отфильтровывают. Крепкий раствор цитохрома C переливают в целлофановый пакетик и ставят на сутки на диализ против физиологического раствора.Precipitated with cytochrome 20% trichloroacetic acid. 6.6 trichloroacetic acid was added to 330 ml of the filtrate at the rate of 20 ml / l. After 20-30 minutes, a precipitate of cytochrome C precipitates. Separate it by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes and treat it with a saturated solution of ammonium sulfate to remove impurities. The collected solution in 1.7 ml of distilled water. The resulting solution of cytochrome C is frozen at -12 o C. Thawed and filtered. A strong solution of cytochrome C is poured into a plastic bag and put on dialysis against saline for a day.
Выход цитохрома C 0,070 мг/кг сырья. The yield of cytochrome C is 0.070 mg / kg of raw material.
Claims (3)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU95100463A RU2105559C1 (en) | 1995-01-17 | 1995-01-17 | Method of cytochrome c preparing |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU95100463A RU2105559C1 (en) | 1995-01-17 | 1995-01-17 | Method of cytochrome c preparing |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU95100463A RU95100463A (en) | 1997-02-27 |
RU2105559C1 true RU2105559C1 (en) | 1998-02-27 |
Family
ID=20163940
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU95100463A RU2105559C1 (en) | 1995-01-17 | 1995-01-17 | Method of cytochrome c preparing |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2105559C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2528061C1 (en) * | 2013-05-29 | 2014-09-10 | Павел Андреевич Канаев | Method of production of cytochrome c |
-
1995
- 1995-01-17 RU RU95100463A patent/RU2105559C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2528061C1 (en) * | 2013-05-29 | 2014-09-10 | Павел Андреевич Канаев | Method of production of cytochrome c |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU95100463A (en) | 1997-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2094999C1 (en) | Method of collagen preparing | |
RU2409291C1 (en) | Method for production of water-soluble polypeptide complex of salmon fishes liver | |
US4216204A (en) | Medical protein hydrolysate, process of making the same and processes of utilizing the protein hydrolysate to aid in healing traumatized areas | |
RU2432956C1 (en) | Method of complex processing of echinus | |
RU2105559C1 (en) | Method of cytochrome c preparing | |
JPH05125100A (en) | High-purity pepsin soluble scale collagen and its production | |
CN103626861B (en) | A kind of preparation method of jellyfish hematoxin crude extract | |
RU2298939C2 (en) | Method for protein isolation from marrow cells | |
CN107286352A (en) | The method for extracting simultaneously separate active ingredients simultaneously from fish scale | |
RU1417244C (en) | Method of preparing of substance recovering prostate gland function | |
CN103613653B (en) | A kind of preparation method of jellyfish cardiovascular toxin crude extract | |
KR102580940B1 (en) | Extraction Method of high purity Poly Deoxy Ribo Nucleotide from meats of Salmonid fish | |
RU2726615C1 (en) | Method for recovering proteins from bone marrow of animals | |
RU2370092C1 (en) | Production method of iodinated food collagenic emulsion out of pond-fish skin | |
SU1227198A1 (en) | Method of producing polypeptides | |
RU2218811C2 (en) | Method for producing of protein concentrate from sunflower oil cake | |
SU1187824A1 (en) | Method of obtaining immunostimulator | |
RU2481119C1 (en) | Peptide, amino acid and phospholipid rich agent | |
SU174326A1 (en) | A METHOD FOR OBTAINING CRYSTALLINE HEMOGLOBIN | |
RU2115662C1 (en) | Method of preparing hyaluronic acid | |
SU271472A1 (en) | Method of isolating enzyme preparation Lipases | |
SU1657491A1 (en) | Method of producing taurin | |
SU351546A1 (en) | METHOD OF OBTAINING CYTOCHROME C | |
SU843994A1 (en) | Method of obtaining albuminous and peptide complex | |
RU2063439C1 (en) | Method of preparing enzyme-protein concentrate |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110118 |