RU2103367C1

RU2103367C1 - Solid diagnostic nutrient medium and a method of its preparing

Info

Publication number: RU2103367C1
Application number: RU95100460A
Authority: RU
Inventors: В.О. Виноходов; В.И. Батарин; Д.О. Виноходов
Original assignee: Виноходов Владимир Олегович
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1998-01-27
Also published as: RU95100460A

Abstract

FIELD: applied biotechnology, microbiology. SUBSTANCE: solid nutrient medium used for qualitative and quantitative analysis of enterobacteria has nitrogen source, lactose, mannitol, mineral salts, dyes (neutral red and bromothymol blue) and water. The following mineral salts were used, %: NaCl 30-50; Na₂HPO₄×12H₂O 5-6; (NH₄)₂SO₄ 10-15; K₂SO₄ 25-40; MgSO₄×7H₂O 5-6, and Na₂CO₃ 2-3. Components were taken at the following ratio, g/l: mineral salts 7.5-9.5; lactose 8-12; mannitol 0.3-0.7; neutral red 0.03-0.05; bromothymol blue 0.01-0.03; agar-agar 5-10, and water - the rest. Method of medium preparing involves agar mixing with dyes and mineral salts. Then the obtained mixture is dissolved in distilled water, boiled, filtered, pH value is brought about to 7.0-7.2, sterilized and mixed with preliminary sterilized lactose and mannitol solution at pH = 7.0-7.2. EFFECT: high quality of analysis, decreased analysis time. 3 cl, 6 tbl

Description

Изобретение относится к прикладной биотехнологии, а именно к микробиологии, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве. The invention relates to applied biotechnology, namely to microbiology, and can be used in medicine, agriculture.

Известно применение для диагностики бактерий в различных жидких и полужидких средах. Known application for the diagnosis of bacteria in various liquid and semi-liquid environments.

В частности, для диагностики E. coIi и сальмонелл применяют желчный бульон, среды Раппопорта, Мюллера, Штерна и т.д. [1]. In particular, for the diagnosis of E. coIi and salmonella, bile broth, Rappoport, Mueller, Stern, etc. are used. [1].

Недостатком указанных сред является невозможность их применения для широкого круга микроорганизмов и для проведения количественных исследований. С целью сочетания качественного и количественного анализа в практике используют, как правило, плотные питательные среды такие, как среда Эндо (мясопептонный агар с лактозой, фуксином и сульфитом натрия) для определения кишечной палочки, сальмонелл и шигелл; среда Левина - для протей и кишечной палочки (агар с эозиноном и метиленовым синим), среда с солями резурина и т. д. (Каталог питательных сред, выпускаемых в СССР, Махачкала, 1992; В.Г. Иванов, Ю.Н. Шихалеев. Ветеринария, 1979, N 11, с. 74). The disadvantage of these environments is the impossibility of their use for a wide range of microorganisms and for quantitative research. In order to combine qualitative and quantitative analysis, in practice they use, as a rule, dense nutrient media such as Endo medium (meat-peptone agar with lactose, fuchsin and sodium sulfite) for the determination of Escherichia coli, Salmonella and Shigella; Levin medium - for Proteus and Escherichia coli (agar with eosinone and methylene blue), medium with resurin salts, etc. (Catalog of culture media produced in the USSR, Makhachkala, 1992; V.G. Ivanov, Yu.N. Shikhaleev Veterinary Medicine, 1979, N 11, p. 74).

Недостатком указанных сред является узкий спектр микроорганизмов, которые могут быть диагностированы. The disadvantage of these environments is a narrow range of microorganisms that can be diagnosed.

Ближайшим аналогом изобретения является среда Левина, включающая агар, красители (метиленовый синий, эозин), углеводы (лактозу, сахарозу) и соли (K₂HPO₄) [2].The closest analogue of the invention is Levin’s medium, including agar, dyes (methylene blue, eosin), carbohydrates (lactose, sucrose) and salts (K ₂ HPO ₄ ) [2].

Среду готовят введением в агар-агар красителей с последующим введением смеси лактозы, сахарозы и солей. Среда используется для количественного и качественного анализа кишечной палочки,
E.coli - в малиново-красный,
Citrobacter - в оранжево-красный,
Klebsiella - красноватый или не изменяет цвета,
Hafnia - красный,
Proteus - грязно-зеленый,
Salmonella - лимонно-зеленый, стафилококки и
стрептококки цвета не меняют.The medium is prepared by adding dyes to agar-agar, followed by a mixture of lactose, sucrose and salts. The medium is used for quantitative and qualitative analysis of E. coli,
E.coli - in raspberry red,
Citrobacter - in orange red,
Klebsiella - reddish or does not change color,
Hafnia - Red
Proteus - dirty green,
Salmonella - lemon green, staphylococcus and
streptococci do not change color.

Данная плотная диагностическая среда может быть использована для проведения следующих бактериологических исследований:
выделение бактерий из патологического материала,
определение бакобсемененности, видового состава и количественного состава микрофлоры сыпучих материалов, жидкостей и воздуха.This dense diagnostic environment can be used to conduct the following bacteriological studies:
isolation of bacteria from pathological material,
determination of bacterial seeds, species composition and quantitative composition of microflora of bulk materials, liquids and air.

Указанные граничные интервалы компонентов являются оптимальными, так как их изменение либо снижает эффективность роста микроорганизмов, либо ухудшает эксплуатационные характеристики среды, например плотность геля, прозрачность и т.п. The indicated boundary intervals of the components are optimal, since their change either reduces the growth efficiency of microorganisms or degrades the operational characteristics of the medium, for example, gel density, transparency, etc.

Способ получения среды, ее эффективность и возможность практического применения иллюстрируется примерами. The method of obtaining the medium, its effectiveness and the possibility of practical application is illustrated by examples.

Пример 1. Приготовление питательных сред, получивших шифр ВБВ (содержание компонентов среды г/л). Example 1. The preparation of culture media that received the code VBV (content of the components of the environment g / l).

8 г агар-агара смешивают с 0.02 г бромтимолового синего, 0.04 г нейтрального красного, после чего добавляют 3,5 г NaCl, 0,2 г Na₂CO₃, 0,4 г Na₂HPO₄•12H₂O, 2,3 г (NH₄)₂SO₄, 0,2 г K₂SO₄, 0,4 г MgSO₄•7•H₂O.8 g of agar-agar are mixed with 0.02 g of bromothymol blue, 0.04 g of neutral red, after which 3.5 g of NaCl, 0.2 g of Na ₂ CO ₃ , 0.4 g of Na ₂ HPO ₄ • 12H ₂ O, 2, 3 g (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.2 g K ₂ SO ₄ , 0.4 g MgSO ₄ • 7 • H ₂ O.

Смесь растворяют в дистиллированной воде до 700 мл, кипятят 5-7 мин, фильтруют через марлю. Затем доводят pH до 7.0-7.2 0.1 н. раствором едкого натра и стерилизуют в автоклаве текучим паром в течение часа. Одновременно готовят смесь 10 г лактозы и 0.5 г маннита, разводят дистиллированной водой до 300 мл, доводят pH до 7.0 - 7.2 и стерилизуют текучим паром в течение 1 ч. Охлажденные до 50 - 60^oC растворы смешивают при контроле pH в вышеуказанном интервале, перемешивают и стерильно разливают по 3 мл в пробирки, по 20 мл в чашки Петри, по 3 - 10 мл в пластиковые чашки Петри или по 0.3-0.5 мл в луночные планшеты в каждую лунку. При этом чашки и планшеты культивируют в положении агаром вниз.The mixture is dissolved in distilled water to 700 ml, boiled for 5-7 minutes, filtered through cheesecloth. Then adjust the pH to 7.0-7.2 0.1 N. caustic soda solution and sterilized in an autoclave with fluid steam for an hour. At the same time, a mixture of 10 g of lactose and 0.5 g of mannitol is prepared, diluted with distilled water to 300 ml, adjusted to pH 7.0 - 7.2 and sterilized with steam for 1 hour. The solutions cooled to 50-60 ^° C are mixed under pH control in the above range, mixed and sterilely pour 3 ml into test tubes, 20 ml into Petri dishes, 3-10 ml into plastic Petri dishes or 0.3-0.5 ml into well plates in each well. In this case, cups and tablets are cultured in the agar position down.

Пример 2. В условиях примера 1 готовят минимальные и максимальные по составу среды. Состав полученных сред приведен в табл. 1. Example 2. In the conditions of example 1 prepare the minimum and maximum composition of the medium. The composition of the obtained media is given in table. one.

Пример 3. Проведение бактериологических исследований. Выделение бактерий из патологического материала. Высевы проводят пастеровской пипеткой на поверхность среды чашки Петри. Для этого наносят капли физиологического раствора на поверхность агара, затем той же пипеткой делают укол в исследуемый орган трупа или другого материала и полученный изолят переносят в каплю физиологического раствора на поверхности среды. Затем стерильным шпателем каплю распределяют по всей поверхности агара. Инкубируют при 37^oC 24 ч.Example 3. Conducting bacteriological studies. Isolation of bacteria from pathological material. Sowing is carried out with a Pasteur pipette on the surface of the medium of the Petri dish. For this, drops of physiological saline are applied to the surface of the agar, then an injection is made into the body of the corpse or other material with the same pipette, and the obtained isolate is transferred to a drop of physiological saline on the surface of the medium. Then, a drop is spread with a sterile spatula over the entire surface of the agar. Incubated at 37 ^o C for 24 hours

Определение обсемененности и видового состава микрофлоры кормов, примексов, мясо-костной муки, продуктов питания и других материалов. Determination of insemination and species composition of microflora of feed, additives, meat and bone meal, food and other materials.

Для исследования берут навески образцов и делают их последовательные разведения, кратные 10. Из разведений делают посевы на среду ВБВ (0.1 мл материала) в чашках Петри. Инкубируют при 27^oC 24 ч.For the study, take samples of samples and make their serial dilutions, multiples of 10. From dilutions, make crops on the medium of VBV (0.1 ml of material) in Petri dishes. Incubated at 27 ^o C for 24 hours

Определение обсемененности воды и других жидкостей. Determination of contamination of water and other liquids.

Разведение проб производят в физиологическом растворе, кратное 10. Посевы делают из разведений 0.1 мл материала на среду ВБВ в чашках Петри. Инкубируют при 37^oC 24 ч.Dilution of the samples is carried out in physiological saline, a multiple of 10. Crops are made from dilutions of 0.1 ml of material per WBV medium in Petri dishes. Incubated at 37 ^o C for 24 hours

Определение обсемененности воздуха в животноводческих помещениях. Determination of airborne contamination in livestock buildings.

Для анализа готовят среду ВБВ в чашках Петри. В исследуемом помещении 5 чашек со средой открывают, разместив их на расстоянии 50 - 100 см от пола, и держат их открытыми в течение различного времени: 1-ю чашку - 5 мин, 2-ю - 10 мин, 3-ю - 20 мин, 4-ю - 40 мин, 5-ю - 1 ч 20 мин. For analysis, the medium of VBV in Petri dishes is prepared. In the test room, 5 cups with the medium are opened, placing them at a distance of 50-100 cm from the floor, and keep them open for various times: 1st cup - 5 minutes, 2nd - 10 minutes, 3rd - 20 minutes , 4th - 40 min, 5th - 1 h 20 min.

При сильном бактериальном загрязнении можно инкубировать чашки в течение 5 и 10 мин. Затем чашки закрывают и инкубируют в термостате при 37^oC 24 ч.With severe bacterial contamination, plates can be incubated for 5 and 10 minutes. Then the cups are closed and incubated in an incubator at 37 ^o C for 24 hours

Результаты опытов приведены в табл. 2. The results of the experiments are given in table. 2.

Анализы воздуха были проведены в свинарнике совхоза Красносельский (Ленинградская область) по указанной методике. Данные приведены в табл. 3. Air analyzes were carried out in the pigsty of the Krasnoselsky state farm (Leningrad Oblast) according to the indicated procedure. The data are given in table. 3.

По вышеуказанной методике был проведен анализ жидкой искусственной смеси бактерий на средах разного состава. Результаты приведены в табл. 4 и 5. According to the above method, an analysis of a liquid artificial mixture of bacteria on media of different compositions was carried out. The results are shown in table. 4 and 5.

Пример 4. В условиях примера 1 готовили среды с использованием солей-заменителей. Состав полученных сред представлен в табл. 6. Example 4. Under the conditions of example 1, media were prepared using substitute salts. The composition of the obtained media is presented in table. 6.

Во всех опытах наблюдалось изменение цвета в местах роста бактерий в зависимости от их вида:
E.coli - малиново-красный,
Citrobacter - оранжево-красный,
Klebsiella - цвет не изменяется, или среда приобретает легкий красный оттенок,
Hafnia - красный,
Proteus - грязно-зеленый, характерная форма колоний,
Salmonella - лимонно-зеленый.In all experiments, a color change was observed in the places where bacteria grew, depending on their type:
E.coli - raspberry red
Citrobacter - Orange Red
Klebsiella - the color does not change, or the medium acquires a slight red tint,
Hafnia - Red
Proteus - dirty green, characteristic colony shape,
Salmonella - Lemon Green

Стафилококки и стрептококки, как правило, не изменяют цвета среды, поэтому для более полного анализа некоторые колонии можно исследовать микроскопически и приготовить мазки бактерий для морфологического исследования. Staphylococci and streptococci, as a rule, do not change the color of the medium, therefore, for a more complete analysis, some colonies can be examined microscopically and prepare smears of bacteria for morphological studies.

Claims

1. A dense diagnostic nutrient medium for the qualitative and quantitative analysis of enterobacteria, containing nitrogen sources, lactose, additional carbohydrate, mineral salts, water, agar-agar and dyes, characterized in that it contains mannitol as an additional carbohydrate, neutral red as dyes and bromothymol blue in the following ratio of ingredients, g / l:
Mineral salts 7.5 9.5
Lactose 8 12
Mannitol 0.3 0.7
Neutral Red 0.03 0.05
Bromothymol blue 0.01 0.03
Agar Agar 5 10
Water Else
2. The medium according to claim 1, characterized in that it contains 30 50% NaCl, 5 6% Na ₂ HPO ₄ • 12H ₂ O, 10-15% (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 25 40% as mineral salts K ₂ SO ₄ , 5 6% MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 3% Na ₂ CO ₃ of the total amount of mineral salts.

3. A method of obtaining a dense diagnostic nutrient medium for the qualitative and quantitative analysis of enterobacteria, including mixing the components of the medium, sterilization, characterized in that the agar is mixed with dyes and mineral salts, then the resulting mixture is dissolved in distilled water, boiled, filtered, adjusted pH to 7.0 7.2, sterilized and then mixed with a pre-sterilized solution of lactose and mannitol with pH 7.0 7.2.