RU2074193C1 - Способ очистки альфа-фетопротеина человека - Google Patents
Способ очистки альфа-фетопротеина человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2074193C1 RU2074193C1 RU94023429A RU94023429A RU2074193C1 RU 2074193 C1 RU2074193 C1 RU 2074193C1 RU 94023429 A RU94023429 A RU 94023429A RU 94023429 A RU94023429 A RU 94023429A RU 2074193 C1 RU2074193 C1 RU 2074193C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- afp
- fetoprotein
- antibodies
- chromatography
- column
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: способ очистки альфа-фетопротеина, который заключается в том, что исходное сырье (сыворотка крови) предварительно разводят буферным раствором, подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-ионообменной колонке при рН 6,2-6,4 и иммуноаффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизационными антителами к АФП, в качестве которых использованы аффинно очищенные поликлональные моноспецифические антитела к АФП, причем элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят сантимолярным раствором соляной кислоты, а полученную фракцию АФП дополнительно очищают аффинной хроматографией на колонках с сорбентом на основе антител к белкам нормальной сыворотки крови человека и сорбентом, содержащим иммуноглобулины кролика к АФП человека, с последующей гельфильтрацией, концентрированием и лиофильным высушиванием целевого продукта. Способ позволяет получать препарат высокой степени очистки.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства лекарственных препаратов и диагностикумов на основе альфа-фетопротеина (АФП) человека.
Известен способ очистки альфа-фетопротеина человека с помощью последовательного применения хроматографии на Affi-Gel Blue c иммобилизированным красителем "цибокрон голубой F3GA" и иммуноаффинной хроматографии на Сефарозе с иммобилизованной антисывороткой против АФП [1] Недостатком способа [1] является низкая производительность и необходимость использования денатурирующих условий для элюции альфа-фетопротеина с иммуноаффинной колонки.
Известен также способ очистки АФП, включающий предварительную очистку с помощью ионообменной хроматографии и последующую окончательную очистку с помощью иммуноаффинной хроматографии [2]-прототип.
Недостатками способа [2] являются длительность и трудоемкость процесса выделения, низкая производительность и необходимость использования денатурирующих условий для элюции целевого продукта с иммуноаффинной колонки.
Технической задачей изобретения является упрощение и ускорение процесса очистки АФП, повышение выхода и чистоты целевого продукта.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе очистки альфа-фетопротеина человека, включающем предварительную очистку исходного сырья с помощью ионообменной хроматографии сыворотки крови, содержащей альфа-фетопротеин(АФП), и последующую иммуноаффинную хроматографию на сорбенте с иммобилизованными антителами к АФП, согласно изобретению предварительную очистку исходного сырья проводят в один этап на диэтиламиноэтил (ДЕАЕ)-ионообменной колонке при рН 6,2-6,4 методом ступенчатой концентрационной элюции, при этом исходное сырье перед нанесением на ДЕАЕ-ионообменную колонку разводят стартовым буферным раствором, сорбент для иммуноаффинной хроматографии приготавливают из аффинноочищенных поликлональных моноспецифических антител против АФП человека, элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят сантимолярным раствором соляной кислотой, полученную фракцию АФП дополнительно очищают аффинной хроматографией на колонках с антителами против белков нормальной сыворотки крови человека и анти-АФП-антител и гельфильтрацией.
При проведении предварительной очистки исходного сырья в один этап на ДЕАЕ-ионообменной колонке при рН 6,2-6,4 методом ступенчатой концентрационной элюции АФП сорбируется на ионнообменнике, в то время как 95-97% балластных белков выходят с колонки, не связываясь с ней. Это позволяет наносить на 1 объем ионообменного геля от 0,2 до 1 объема сырья без снижения эффективности очистки.
Разведение исходного сырья перед нанесением на ДЕАЕ-ионообменную колонку стартовым буферным раствором вместо используемого в прототипе диализа позволяет уменьшить величины рН и концентрации солей.
Изготовление иммуноаффинного сорбента на основе аффинно очищенных поликлональных моноспецифических антител против АФП человека позволяет изготовить аффинную колонку с высокой удельной емкостью.
Использование ступенчатого градиента элюции белка вместо более трудоемкого и длительного непрерывного градиента элюции совместно с выбором типа ионообменника,условий его работы, способа нанесения исходного сырья и снятия частично очищенного АФП позволяют почти на порядок повысить эффективность предварительной очистки.
Дополнительная очистка полученной фракции АФП аффинной хроматографией на колонках с антителами против белков нормальной сыворотки крови человека и анти-АФП-антител и гельфильтрация позволяет отделить основной продукт от димерных форм АФП.
Способ позволяет создать промышленную технологию получения АФП человека высокой чистоты.
Способ очистки альфа-фетопротеина человека реализуется следующим образом.
Сначала осуществляют предварительную очистку исходного сырья сыворотки крови, содержащую альфа-протеин АФП, в качестве которого может быть использована абортивная сыворотка, пуповинная сыворотка околоплодная жидкость и др. Исходное сырье разводят стартовым буферным раствором и затем наносят на диэтилоаминоэтил (ДЕАЕ)-ионообменную колонку при рН 6,2-6,4. После нанесения исходного сырья колонку промывают стартовым буферным раствором.
Полученную фракцию АФП наносят на иммуноаффинную колонку. Элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят сантимолярным раствором соляной кислоты, при этом для приготовления сорбента для иммуноаффинной хромотографии используют очищенные поликлональные моноспецифические антитела АФП человека.
Далее очищают выделенный АФП от возможных следовых количеств белков сыворотки или фрагментов иммуноглобулинов аффинной хроматографией на колонках с антителами против белков нормальной сыворотки крови человека и анти-АФП-антител и гельфильтрацией.
Способ иллюстрируется примерами.
П р и м е р 1. К 800 мл абортивной сыворотки с концентрацией АФП приблизительно 270 мгк/мл (общее количество АФП приблизительно 220 мг) добавили 1600 мл 0,04 М калий фосфатного буфера, рН 6,2 и нанесли на колонку, содержащую 4 литра ДЕАЕ-Сефарозы. Скорость нанесения сырья составляла 900 мл/ч.
После нанесения сыворотки колонку промывали 4 литрами 0,04 М калий-фосфатного буферного раствора, рН 6,2, содержащего 0,05 М хлористого натрия. Сорбировавшийся на колонке белок снимали 0,04 М калий-фосфатным буферным раствором, содержащим 0,2 М хлористого натрия. После начала нанесения снимающего буферного раствора 2 литра выходящего из колонки буфера отбрасывали, а следующие 4 литра, содержащие альфа-фетопротеин, собирали. Затем колонку уравновешивали 5 литрами 0,04 М калий-фосфатного буфера, рН 6,2.
Фракцию, содержащую АФП, концентрировали до объема 150 мл и добавляли в нее концентрированный раствор Трис-НСl рН 8,0 до конечной концентрации 0,05 М и концентрированный раствор хлористого натрия до конечной концентрации 0,5 М. Затем эту фракцию наносили на иммуноаффинную колонку 2,6х60 см с ковалентно связанными с ВrCN-активированной Сефарозой Сl-4B очищенными на иммуноаффинном сорбенте моноспецифическими поликлональными антителами кролика против АФП человека. Перед нанесением колонку промывали сначала 0,01 М раствором НСl, затем уравновешивали буферным раствором 0,05 Трис-НСl, рЕ 8,0. Скорость нанесения составляла 400 мл/ч.
После нанесения содержащей АФП фракции колонку промывали стартовым буфером до тех пор, пока оптическая плотность выходящего из колонки раствора не снижалась до 0,005 оптических единиц. Затем АФП снимали, пропуская через колонку 0,01 М раствор НСl. Профиль элюции контролировалиспектрофотометрически, по поглощению в 280 нм. Практически весь белок сходил с колонки в интервале рН от 6 до 5. Сразу после снятия белка с колонки, рН раствора поднимали до 8, добавляя концентрированный Трис-НСl буфер. Объем снятой с аффинной колонки фракции АФП составлял около 100 мл, концентрация приблизительно 1 мг/мл.
Для того, чтобы очистить выделенный АФП от возможных следовых количеств белков сыворотки или фрагментов иммуноглобулинов кролика, которые могли быть внесены на стадии аффинной хроматографии полученная фракция наносилась последовательно на аффинную колонку с антителами кролика.
Для того, чтобы перевести альфа-фетопротеин в низкомолекулярный буферный раствор и одновременно отделиться от возможных мономерных или деградированных форм АФП, полученный после аффинной хроматографии, белок концентрировали на концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до объема 5 мл и наносили на гельхроматографическую колонку с биогелем АсА-34, уравновешенную 0,005 М Na-фосфатным буферным раствором, рН 7,5. Сразу после стадии гельхроматографии белок был сконцентрирован в концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до конечной концентрации 45 мг/мл и лиофильно высушен. Общее количество выделенного АФП составило 98 мг (выход продукта 45%). Все операции проводили при 4-8oC.
П р и м е р 2. К 4 мл абортивной сыворотки с концентрации АФП 83 мкг/мл (общее количество АФП приблизительно 332 мг) добавили 8 л 0,04 М калий-фосфатного буфера, рН 6,2 и нанесли на колонку, содержащую 4 л ДЕАЕ-Сефаразы. Скорость нанесения сырья составляла 900 мл/ч. Дальнейшие действия в точности соответствуют действиям в примере 1. Общее количество выделенного АФП составило 126 мг (выход продукта 38%).
Claims (1)
- Способ очистки альфа-фетопротеина человека, включающий предварительную очистку исходного сырья сыворотки крови, содержащей альфа-фетопротеин, с помощью ионообменной хроматографии и последующую иммуноаффинную хроматографию на сорбенте с иммобилизованными антителами к АФП, отличающийся тем, что исходную сыворотку предварительно разводят стартовым буферным раствором, ионообменную хроматографию проводят на ДЭАЭ ионообменной колонке при pH 6,2 - 6,4 с использованием ступенчатой концентрационной элюции, для иммуноаффинной хроматографии используют сорбент на основе аффинно-очищенных поликлональных моноспецифических антител к АФП человека, причем элюцию АФП с иммуноаффинной колонки проводят сантимолярным раствором соляной кислоты, полученную фракцию АФП дополнительно очищают аффинной хроматографией на колонках с сорбентом на основе антител к белкам нормальной сыворотки крови человека и сорбентом, содержащим иммуноглобулины кролика к АФП человека, с последующей гельфильтрацией, концентрированием и лиофильным высушиванием целевого продукта.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU94023429A RU2074193C1 (ru) | 1994-06-21 | 1994-06-21 | Способ очистки альфа-фетопротеина человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU94023429A RU2074193C1 (ru) | 1994-06-21 | 1994-06-21 | Способ очистки альфа-фетопротеина человека |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU94023429A RU94023429A (ru) | 1996-06-27 |
RU2074193C1 true RU2074193C1 (ru) | 1997-02-27 |
Family
ID=20157491
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU94023429A RU2074193C1 (ru) | 1994-06-21 | 1994-06-21 | Способ очистки альфа-фетопротеина человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2074193C1 (ru) |
-
1994
- 1994-06-21 RU RU94023429A patent/RU2074193C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Leal J.A., Keel B.A. J. Med. Primot. 20, (1991), с. 35 - 41. 2. Purves L.R. E. van der Merve and I. Bersohn S.Afr.Med.J (1970), с. 1256. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU94023429A (ru) | 1996-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5118796A (en) | Efficient large-scale purification of immunoglobulins and derivatives | |
US4228154A (en) | Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography | |
US7125552B2 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates | |
JPH03128398A (ja) | 血漿蛋白の分画方法 | |
KR100234497B1 (ko) | Tgf-베타 2 및 tgf-베타3의 대형 잠복 복합체 | |
AU656552B2 (en) | Process for isolating human albumin from supernatant IV, in particular IV-4, or from COHN's fraction V or from an analogous supernatant or fraction | |
NO300041B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av renset albumin | |
RU2074193C1 (ru) | Способ очистки альфа-фетопротеина человека | |
US4264449A (en) | Antibody-specific solid phase immunoadsorbent, preparation thereof, and antibody purification therewith | |
JPS59231097A (ja) | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ21kおよびその製造法 | |
US4232004A (en) | Antibody-specific solid phase immunoadsorbent, preparation thereof, and antibody purification therewith | |
US20170349645A1 (en) | Novel method for efficient purification of human serum albumin | |
US4658017A (en) | Method for the large scale purification of human fibroblast interferon | |
JP5089924B2 (ja) | IgM型抗体の精製方法、IgM型抗体認識抗原の吸着材 | |
RU2094077C1 (ru) | Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина | |
RU2097049C1 (ru) | Способ выделения альфа-фетопротеина из сыворотки крови человека | |
RU2322504C1 (ru) | Способ получения генно-инженерного инсулина человека | |
WO2022222949A1 (zh) | 一种双特异性抗体的纯化方法 | |
RU2145610C1 (ru) | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека | |
Dimitrov et al. | Fractionation of some bee venom components on a new type of modified cellulose | |
JPH06256399A (ja) | ヒト・インターロイキン11の精製法 | |
RU2325171C1 (ru) | Способ выделения и очистки трофобластического бета-1-гликопротеина | |
KR0137855B1 (ko) | 저분자량-우로가스트론의 정제방법 | |
JP4154743B2 (ja) | インターロイキン6レセプターの精製方法 | |
RU2367449C1 (ru) | Способ выделения и очистки трофобластического бета-1-гликопротеина |