RU2069691C1

RU2069691C1 - Strain of bacterium pseudomonas putida - a destructor on nonionogenic surface-active substances

Info

Publication number: RU2069691C1
Application number: RU93039116A
Authority: RU
Inventors: О.В. Турковская; Л.В. Панченко
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 1996-11-27

Abstract

FIELD: microbiology, biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to isolation of new strain which shows destructive activity with regard to different types of nonionogenic surface-active substances. EFFECT: new bacterial strain indicated above.

Description

Изобретение относится к области микробиологической промышленности и заключается в получении нового штамма бактерий. The invention relates to the field of microbiological industry and consists in obtaining a new strain of bacteria.

Одним из крупномасштабных загрязнителей окружающей среды являются поверхностно-активные вещества (ПАВ), в том числе и неионогенные (НПАВ). Поэтому деградация НПАВ как в сточных водах, так и в объектах окружающей среды является весьма актуальной задачей. Одним из наиболее перспективных способов удаления ПАВ является микробная деструкция, основанная на использовании микроорганизмов, способных в качестве единственного источника углерода и энергии использовать поверхностно-активные ксенобиотики. One of the large-scale environmental pollutants is surface-active substances (surfactants), including non-ionic ones (nonionic surfactants). Therefore, the degradation of nonionic surfactants both in wastewater and in environmental objects is a very urgent task. One of the most promising methods for the removal of surfactants is microbial destruction, based on the use of microorganisms capable of using surface-active xenobiotics as the sole source of carbon and energy.

Известны зарубежные аналогичные штаммы-деструкторы НПАВ (пат. США N 4317885, Японии N 54-36674). Их недостатком является неспособность к деградации оксиэтилированных алкилфенолов (ОЭАФ), одних из наиболее трудноразлагаемых НПАВ. Известен также штамм-деструктор ОЭАФ (пат. США N 4483923). Его недостатком является недостаточно высокая активность: при концентрации ОЭАФ 200 мг/л и при периодическом культивировании убыль вещества составляет 40% за неделю, при концентрации 500 мг/л и непрерывном культивировании 88% за 41,5 ч. Known foreign similar strains-destructors of nonionic surfactants (US Pat. US N 4317885, Japan N 54-36674). Their disadvantage is the inability to degrade hydroxyethylated alkyl phenols (OEAA), one of the most difficult to decompose nonionic surfactants. The OAAF destructor strain is also known (US Pat. No. 4,483,923). Its disadvantage is not high enough activity: at a concentration of OEAF of 200 mg / l and with periodic cultivation, the loss of substance is 40% per week, at a concentration of 500 mg / l and continuous cultivation of 88% for 41.5 hours.

Известны отечественные аналогичные штаммы-деструкторы НПАВ [4,5] отличаясь высокой деструктивной активностью по отношению к ряду НПАВ, они не разрушают ОЭАФ. Known domestic analogous strains of destructive nonionic surfactants [4,5], characterized by high destructive activity in relation to a number of nonionic surfactants, they do not destroy OEAA.

Наиболее близким к заявленному штамму по деструктивной активности является штамм Pseudomonas putida ТШ-18 [6] При периодическом культивировании на синтетической среде следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ 6,0; KH₂PO₄ 3,0; NH₄Cl 1,0; NaCl 0,5; pH 7,2, штамм проявлял высокую деструктивную активность по отношению к ОЭАФ, добавляемому в среду в качестве единственного источника углерода и энергии (см. табл. 1).Closest to the claimed strain of destructive activity is a strain of Pseudomonas putida TS-18 [6] During periodic cultivation on a synthetic medium of the following composition (g / l): Na ₂ HPO ₄ 6.0; KH ₂ PO ₄ 3.0; NH ₄ Cl 1.0; NaCl 0.5; pH 7.2, the strain showed high destructive activity against OEAA, added to the medium as the sole source of carbon and energy (see table. 1).

Таким образом, у прототипа биодеградация ОЭАФ не превышала 87 88% за 41 48 ч при концентрации 0,5 г/л и достигала 100% за 24 ч лишь при концентрации 0,2 г/л. Thus, the prototype biodegradation of OAAF did not exceed 87 88% for 41 48 hours at a concentration of 0.5 g / l and reached 100% in 24 hours only at a concentration of 0.2 g / l.

Целью изобретения является выделение штамма с повышенной деструктивной активностью и широким субстратным спектром. The aim of the invention is the selection of a strain with high destructive activity and a wide substrate spectrum.

Предлагаемый штамм Pseudomonas putida ТП19 депонирован в центральном музее промышленных микроорганизмов под N ВКПМ В-6582 и характеризуется следующими свойствами. The proposed strain Pseudomonas putida TP19 deposited in the Central Museum of industrial microorganisms under N VKPM B-6582 and is characterized by the following properties.

Морфологические признаки. В мазках грамотрицательные палочки, короткие, располагающиеся поодиночке или короткими цепочками, спор и капсул не образуют, подвижные. Morphological signs. In smears, gram-negative bacilli, short, located singly or in short chains, do not form spores and capsules, mobile.

Культуральные свойства. Прототроф. Хороший рост на простых питательных средах. Оптимум роста 25 30^oC. При 42^oC рост отсутствует. На мясо-пептонном агаре колонии выпуклые, правильной округлой формы, блестящие, бесцветные. Диаметр колоний после 24 ч роста 1 2 мм. Рост при посеве уколом в столбик интенсивный на поверхности, на мясо-пептонном бульоне хороший с тонкой пленкой на поверхности.Cultural properties. Prototroph. Good growth on simple nutrient media. The optimum growth is 25-30 ^o C. At 42 ^o C there is no growth. On meat-peptone agar, colonies are convex, of regular rounded shape, shiny, colorless. The diameter of the colonies after 24 h of growth of 1 2 mm. Growth when sowing with an injection in a column is intense on the surface, on meat-peptone broth is good with a thin film on the surface.

Физиолого-биохимические свойства. Оксидазопозитивен. Продуцирует каталазу, аргинингидролазу, нитратредуктазу. Не образует уреазу, лецитиназу, желатиназу, орнитиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, индол, сероводород. На OF среде с глюкозой и мальтозой наблюдается кислотообразование, с рамнозой, арабинозой, сахарозой, ксилозой кислотообразование не отмечается. Physiological and biochemical properties. Oxidase positive. It produces catalase, arginine hydrolase, nitrate reductase. Does not form urease, lecithinase, gelatinase, ornithine decarboxylase, phenylalanine deaminase, indole, hydrogen sulfide. Acid formation is observed on an OF medium with glucose and maltose; acid formation is not observed with rhamnose, arabinose, sucrose, xylose.

В качестве источника углерода и энергии использует цитрат. It uses citrate as a source of carbon and energy.

Не растет в присутствии 6,5% NaCl. Отсутствует рост на безазотистой среде Эшби и среде Чапека. Не гидролизует крахмал. Не образует пиоцианин на среде Кинг А, образует флуоресцентные пигменты на среде Кинг В. Растет на среде Плоскирева. Не вызывает гемолиз эритроцитов. It does not grow in the presence of 6.5% NaCl. There is no growth on Ashby’s nitrogen-free environment and апapek’s environment. Does not hydrolyze starch. It does not form pyocyanin on King A medium; it forms fluorescent pigments on King B. medium. It grows on Ploskirev medium. Does not cause erythrocyte hemolysis.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Штамм устойчив к пенициллину, оксациллину, ампициллину, карбенициллину, эритромицину, олеандомицину, линкомицину, ристомицину, фузидину, левомицетину; штамм чувствителен к тетрациклину, доксициклину, стрептомицину, мономицину, гентамицину, канамицину, неомицину, полимиксину. Sensitivity to antibacterial drugs. The strain is resistant to penicillin, oxacillin, ampicillin, carbenicillin, erythromycin, oleandomycin, lincomycin, ristomycin, fusidine, chloramphenicol; the strain is sensitive to tetracycline, doxycycline, streptomycin, monomycin, gentamicin, kanamycin, neomycin, polymyxin.

Патогенные свойства. При внутрибрюшинном заражении беспородных белых мышей (10 животных) взвесью суточной культуры штамма в количестве 1 млрд микробных тел в 0,5 мл физиологического раствора на животное заболевания не обнаружено. Срок наблюдения 10 дн. Это дало основание считать культуру непатогенной. Pathogenic properties. When intraperitoneal infection of outbred white mice (10 animals) with a suspension of the daily culture of the strain in the amount of 1 billion microbial bodies in 0.5 ml of physiological saline per animal was not detected. The observation period is 10 days. This gave grounds to consider the culture as non-pathogenic.

Условия хранения. Культуру хранят на столбиках с полужидким 0,6% агаром под слоем стерильного вазелинового масла при 4^oC, пересевая 2 раза в год.Storage conditions. The culture is stored on columns with semi-liquid 0.6% agar under a layer of sterile liquid paraffin at 4 ^o C, replanting 2 times a year.

На основании комплекса морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств штамм был идентифицирован как Pseudomonas putida. Based on the complex of morphological-cultural and physiological-biochemical properties, the strain was identified as Pseudomonas putida.

Пример 1. Получение штамма ТП-19. Микроорганизм деструктор НПАВ выполнен методом накопительной культуры из микробного консорциума активного ила. Материал в количестве 1 мл вносят в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую 100 мл синтетической среды М9 следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ 6,0; KH₂PO₄ 3,0; NaCl 0,5; NH₄Cl 1,0; pH 7,2. В среду добавляется тритон Х-100 в концентрации 0,5 г/л. Культивирование проводится на качалке при 160 об/мин и температуре 28^oC. Через 3, 5, 10 сут из накопительной культуры отбирают пробы, которые высевают на агаризованную синтетическую среду того же состава. Одновременно пробы анализируют на деструкцию тритона и с помощью чашечных экспресс-методов выделяют чистые культуры бактерий. Деструктивную активность выделенных опять проверяют в жидкой синтетической среде. Количественное определение НПАВ проводили колориметрическим методом с фосфорномолибденовой кислотой (Клименко Н.А. Панченко Н.П. Текстильная промышленность, 1971, N 2, c. 85 86). Культуры отсевают на столбики с полужидким агаром и хранят под слоем вазелинового масла при 4^oC. Идентификацию проводили общепринятым способом (Buchanan and Gibbons (editors) Bergey's manual of determinative bacteriology, 8 th ed. The Williams and Wilkins Co. Baltimore, 1974).Example 1. Obtaining strain TP-19. The microorganism destructor nonionic surfactants is made by the method of cumulative culture from a microbial consortium of activated sludge. Material in an amount of 1 ml is introduced into an Erlenmeyer flask with a capacity of 500 ml, containing 100 ml of synthetic medium M9 of the following composition (g / l): Na ₂ HPO ₄ 6.0; KH ₂ PO ₄ 3.0; NaCl 0.5; NH ₄ Cl 1.0; pH 7.2. On Wednesday, triton X-100 is added at a concentration of 0.5 g / l. Cultivation is carried out on a rocking chair at 160 rpm and a temperature of 28 ^o C. After 3, 5, 10 days from the storage culture samples are taken, which are seeded on an agarized synthetic medium of the same composition. At the same time, the samples are analyzed for destruction of the newt and using pure cup methods, pure bacteria cultures are isolated. The destructive activity of the isolated ones is again checked in a liquid synthetic medium. Quantitative determination of nonionic surfactants was carried out by the colorimetric method with phosphoromolybdenum acid (Klimenko N.A. Panchenko N.P. Textile Industry, 1971, N 2, p. 85 86). Cultures were plated on semi-liquid agar columns and stored under a layer of liquid paraffin at 4 ^° C. Identification was carried out by the conventional method (Buchanan and Gibbons (editors) Bergey's manual of determinative bacteriology, 8th ed. The Williams and Wilkins Co. Baltimore, 1974).

Пример 2. Деструкция неионогенных и оксиэтилированных анионных ПАВ при периодическом культивировании штамма Ps. putida ТП 19. Культивирование проводят в среде М9 ПАВ добавляют в концентрации 0,5 1,0 г/л. Исходная концентрация клеток составляет 5•10⁸ кл/мл (0,70D₄₄₀). Инкубируют при 28^oC на качалке при 160 об/мин. Контроль осуществляют колориметрическим методом. Результаты деструкции приведены в таблице 2.Example 2. The destruction of nonionic and oxyethylated anionic surfactants during periodic cultivation of the strain Ps. putida TP 19. Cultivation is carried out in M9 medium. Surfactants are added at a concentration of 0.5 to 1.0 g / l. The initial cell concentration is 5 • 10 ⁸ cells / ml (0.70D ₄₄₀ ). Incubated at 28 ^° C. on a shaker at 160 rpm. The control is carried out by the colorimetric method. The results of the destruction are shown in table 2.

Пример 3. Деструкция повышенных концентраций тритона Х-100 штаммом Ps. putida ТП19 при периодическом культивировании. Культивирование проводилось в среде М9 при 28^oC на качалке при 160 об/мин. Исходная концентрация клеток составляла 7 10⁹ кл/мл. Тритон х-100 вносился в концентрации 5 10 г/л. Убыль вещества определялась через 24 ч инкубации. При концентрации тритона 5 г/л убыль составляла 98% при концентрациях 7 и 10 г/л 95 и 90% соответственно.Example 3. The destruction of high concentrations of triton X-100 strain Ps. putida TP19 during periodic cultivation. The cultivation was carried out in M9 medium at 28 ^o C on a rocking chair at 160 rpm. The initial cell concentration was 7 10 ⁹ cells / ml. Triton x-100 was introduced at a concentration of 5 to 10 g / l. The loss of substance was determined after 24 hours of incubation. At a triton concentration of 5 g / l, the decrease was 98% at concentrations of 7 and 10 g / l, 95 and 90%, respectively.

Пример 4. Деструкция НПАВ синтанола ДС-10 и неонола АФ₉-12 штаммом ТП19 при непрерывном культивировании. Непрерывное культивирование в лабораторных условиях осуществлялось в модельном растворе, представляющим собой минеральную среду М9, содержащую синтанол или неонол в концентрации 0,5 г/л. Процесс осуществлялся в биореакторе в условиях проточного культивирования. Аэрация осуществлялась компрессором при подаче воздуха 1 л/л среды в мин, температура составила 25^oC. Модельный раствор подается в биореактор со скоростью 0,04 ч^-1. Для засевания биореактора установки культурой деструктора, последнюю выращивают на мясо-пептонном агаре и полученную биомассу иммобилизуют на носителе в установке. Очищенная вода содержит НПАВ в концентрации 5 15 мг/л, что не превышает предельно-допустимых концентраций этих соединений для сброса на городские очистные сооружения. Эффективность очистки от синтанола и неонола при непрерывном культивировании составляет таким образом 97 99%
Таким образом, предлагаемый штамм ТП19 обладает деструктивной активностью по отношению к различным классам НПАВ при их концентрации 0,5 1,0 г/л; за 24 ч при периодическом культивировании оксиэтилированные жирные кислоты разрушаются на 65% оксиэтилированные спирты на 85 98% оксиэтилированные алкилфенолы на 65 98% оксиэтилированные амиды на 90% и оксиэтилированные АПАВ на 60% Отдельные представители ОЭАФ, в частности тритон х-100 разрушается на 90% при концентрации его до 10 г/л. При непрерывном культивировании эффективность разрушения НПАВ штаммом повышается для синтанола ДС-10 с 86 до 98% и для неонола АФ₉-12 c 87 до 98%
Таким образом, предлагаемый штамм обладает значительно большей деструктивной активностью по отношению к ОЭАФ и обладает более широким деструктивным спектром по сравнению с известными.Example 4. The destruction of nonionic surfactants syntanol DS-10 and neonol AF ₉ -12 strain TP19 during continuous cultivation. Continuous cultivation in laboratory conditions was carried out in a model solution, which is a mineral medium M9 containing syntanol or neonol at a concentration of 0.5 g / L. The process was carried out in a bioreactor under flow culture conditions. Aeration was carried out by the compressor with an air supply of 1 l / l of medium per minute, the temperature was 25 ^o C. The model solution is fed into the bioreactor at a speed of 0.04 h ^-1 . To seed the plant bioreactor with a destructor culture, the latter is grown on meat-peptone agar and the resulting biomass is immobilized on a carrier in the plant. The purified water contains nonionic surfactants in a concentration of 5–15 mg / l, which does not exceed the maximum permissible concentrations of these compounds for discharge to urban wastewater treatment plants. The efficiency of purification from syntanol and neonol during continuous cultivation is thus 97 99%
Thus, the proposed strain TP19 has a destructive activity against various classes of nonionic surfactants at a concentration of 0.5 to 1.0 g / l; 24 hours during periodic cultivation, ethoxylated fatty acids are destroyed by 65%; ethoxylated alcohols; 85 98%; ethoxylated alkyl phenols by 65; 98%; ethoxylated amides by 90%; and ethoxylated ACAS by 60%; at a concentration of up to 10 g / l. With continuous cultivation, the efficiency of destruction of nonionic surfactants by the strain increases for syntanol DS-10 from 86 to 98% and for neonol AF ₉ -12 from 87 to 98%
Thus, the proposed strain has a significantly greater destructive activity against OAAF and has a wider destructive spectrum compared to the known ones.

Claims

The bacterial strain Pseudomonas putida VKPM B-6582 is a destructor of nonionic surfactants.