RU2144079C1

RU2144079C1 - Strain of bacterium pseudomonas cepacia vdk vkpm b-7559 - destructor of phenol and formaldehyde

Info

Publication number: RU2144079C1
Application number: RU98110597A
Authority: RU
Inventors: И.И. Денисов; Н.Г. Тихонов; В.И. Илюхин
Original assignee: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Priority date: 1998-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2000-01-10

Abstract

FIELD: industrial microbiology, ecology. SUBSTANCE: invention relates to the novel strain Pseudomonas cepacia VDK that is able to utilize phenol and formaldehyde as the nutrient substrate simultaneously. This ensures to use its as a destructor of these toxicants in cleansing constructions. The strain is recommended to use for microbiological treatment of industrial and domestic sewages. The strain is not toxic and does not deteriorate ecological systems. EFFECT: preparing the strain of Pseudomonas genus that is able to utilize phenol and formaldehyde as nutrient substrate at rather high concentrations. 2 ex

Description

Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается получения нового штамма-деструктора, способного в качестве питательного субстрата использовать одновременно и фенол и формальдегид с исходной концентрации не менее 400-500 мкг/мл, соответственно. The invention relates to industrial microbiology and relates to the production of a new strain-destructor, capable of using both phenol and formaldehyde as a nutrient substrate with an initial concentration of at least 400-500 μg / ml, respectively.

Фенол и формальдегид - токсические соединения, получаются в результате разложении карбамидоформальдегидной смолы (КФС), карбамидного клея в отходах мебельных предприятий при изготовлении и отделке древесных плит. При этом токсиканты попадают в сточные воды и в атмосферу. Phenol and formaldehyde are toxic compounds obtained by the decomposition of urea-formaldehyde resin (CFS), urea glue in the waste of furniture enterprises in the manufacture and decoration of wood boards. At the same time, toxicants get into wastewater and into the atmosphere.

Штамм может быть использован в биореакторах для микробиологической очистки сточных вод, содержащих высокие концентрации фенола и формальдегида. The strain can be used in bioreactors for microbiological wastewater treatment containing high concentrations of phenol and formaldehyde.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и ему присвоен номер ВКПМ В-7559 (Москва, ГНИИ генетика - ВКПМ). The strain is deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms and assigned the number VKPM B-7559 (Moscow, GNII Genetics - VKPM).

Для эффективной микробиологической детоксикации стоков, содержащих токсиканты, относящиеся к различным по структуре соединениям, необходимы микроорганизмы-деструкторы с широким спектром субстратной специфичности. For effective microbiological detoxification of effluents containing toxicants belonging to compounds of different structures, microorganisms-destructors with a wide spectrum of substrate specificity are required.

В нашей стране и за рубежом ведутся работы по созданию микроорганизмов, которые приобретают деструктивные свойства по отношению к нескольким токсическим соединениям. Например, Якимов с соавт. предложил штамм бактерий Pseudomonas fluorescens, разлагающий стирол и этилбензол (а. с. СССР N 1375647, кл. C 12 N 1/20, 1988) и штамм бактерий Methylobacterium species, разлагающий метанол и/или формальдегид (а. с. СССР N 1017730, кл. C 12 N 1/20, 1982). Однако попытки получения штаммов-деструкторов, способных утилизировать одновременно фенол и метанол или формальдегид, которые относятся к различным по химической структуре токсикантам, оказались безуспешными (Березкина Н.Е., Григорьева С.П., Андреевская Е.А., Рудченко О.Н., Душников А. А. Выделение комплексов бактерий-деструкторов фенола и метанола // Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. - Т.28. Вып. 4. - С. 565-570). В лучшем случае предлагается для этой цели консорциум штаммов, например, "Консорциум штаммов бактерий Bacilus megaterium, Bacilus freudereichii, Agrobacterium ... (RU 2037472 C1,1995, C 02 F 3/34). In our country and abroad, work is underway to create microorganisms that acquire destructive properties with respect to several toxic compounds. For example, Yakimov et al. proposed a bacterial strain Pseudomonas fluorescens that decomposes styrene and ethylbenzene (a.c. USSR N 1375647, class C 12 N 1/20, 1988) and a bacterial strain Methylobacterium species that decomposes methanol and / or formaldehyde (a.a. USSR USSR 1017730 Cl. C 12 N 1/20, 1982). However, attempts to obtain destructive strains capable of simultaneously utilizing phenol and methanol or formaldehyde, which belong to toxicants with different chemical structures, were unsuccessful (Berezkina N.E., Grigoryeva S.P., Andreevskaya E.A., Rudchenko O.N. ., Dushnikov A. A. Isolation of complexes of bacteria-destructors of phenol and methanol // Applied Biochemistry and Microbiology. - 1992. - T. 28. Issue 4. - P. 565-570). In the best case, a consortium of strains is proposed for this purpose, for example, a "Consortium of bacterial strains Bacilus megaterium, Bacilus freudereichii, Agrobacterium ... (RU 2037472 C1.1995, C 02 F 3/34).

Целью изобретения является получение штамма из микроорганизмов рода псевдомонас, способного одновременно использовать в качестве питательного субстрата фенол и формальдегид в достаточно высоких концентрациях. The aim of the invention is to obtain a strain of microorganisms of the genus pseudomonas, capable of simultaneously using phenol and formaldehyde as a nutrient substrate in sufficiently high concentrations.

Для выявления и выделения клонов микроорганизмов, способных в качестве источника углерода и энергии использовать несколько различных по химической природе токсикантов, был использован предложенный нами способ, где проверяемые микроорганизмы, заключенные в минимальную питательную среду при способности использовать токсиканты в качестве питательного субстрата, формируют бактериальный рост вокруг носителей конкретных токсикантов, которыми пропитаны бумажные диски, накладываемые на поверхность минимальной среды с искомыми микроорганизмами. To identify and isolate clones of microorganisms capable of using several toxicants different in chemical nature as a source of carbon and energy, we proposed the method where tested microorganisms enclosed in a minimum nutrient medium with the ability to use toxicants as a nutrient substrate form bacterial growth around carriers of specific toxicants, which are impregnated with paper disks, superimposed on the surface of a minimal environment with the desired microorgan basics.

При проверке штаммов бактерий, относящихся к непатогенным видам рода Pseudomonas (коллекция микроорганизмов ВолгНИПЧИ), был обнаружен штамм P. cepacia 4176, который был способен использовать в качестве единственного источника углерода и энергии фенол и формальдегид. Выявленный штамм с полисубстратной специфичностью обладал типичными культуральными и биохимическими свойствами и был способен утилизировать фенол и формальдегид с исходных концентраций 80 и 100 мкг/мл, соответственно. Этот штамм при росте на МПГА формировал плотные колонии телесного цвета, в бульоне образовывал пленку. При электронной микроскопии взвеси бактерий этого штамма методом негативного контрастирования отмечено большое количество капсулоподобного материала вокруг клеточных скоплений и единичных клеток. На препаратах ультратонких срезов выявляется повышенная вакуолизация внутриклеточного содержимого бактерий, что, по-видимому, связано с происходящей перестройкой метаболической активности и, возможно, с активацией синтеза ферментов деструкции токсикантов. При изучении внехромосомного нуклеинового материала у P. cepacia ВДК бьша выявлена криптическая плазмида. When testing bacterial strains belonging to non-pathogenic species of the genus Pseudomonas (collection of microorganisms VolgNIPCHI), P. cepacia 4176 strain was discovered, which was able to use phenol and formaldehyde as the sole source of carbon and energy. The revealed strain with polysubstrate specificity had typical cultural and biochemical properties and was able to utilize phenol and formaldehyde from the initial concentrations of 80 and 100 μg / ml, respectively. When grown on MPGA, this strain formed dense skin-colored colonies and formed a film in the broth. Electron microscopy of the suspension of bacteria of this strain by the method of negative contrast showed a large number of capsule-like material around cell clusters and single cells. On preparations of ultrathin sections, increased vacuolization of the intracellular contents of bacteria is revealed, which, apparently, is associated with the ongoing restructuring of metabolic activity and, possibly, with the activation of synthesis of toxic degradation enzymes. When studying extrachromosomal nucleic material in P. cepacia VDK, a cryptic plasmid was revealed.

С помощью селекции на градиентных чашках, содержащих возрастающие концентрации фенола и формальдегида, из популяции выявленной культуры P. cepacia 4176 был получен клон, получивший в дальнейшем название P. cepacia ВДК, способный деградировать смесь фенола и формальдегида с исходной концентрацией 400 и 500 мкг/мл, соответственно. Using a selection on gradient plates containing increasing concentrations of phenol and formaldehyde, a clone was obtained from the population of the identified culture of P. cepacia 4176, later called P. cepacia VDK, capable of degrading a mixture of phenol and formaldehyde with an initial concentration of 400 and 500 μg / ml , respectively.

Культура Pseudomonas cepacia ВДК была принята на национальное патентное депонирование 17 марта 1988 года. Принятая культура получила во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов коллекционный соответственно номер: ВКПМ В-7559. The Pseudomonas cepacia VDK culture was accepted for national patent deposit on March 17, 1988. The adopted culture received in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms a collection number respectively: VKPM B-7559.

Характеристика штамма Pseudomonas cepacia ВДК ВКПМ В-7559. Среда для хранения: МПА и минеральная среда, содержащая по 0,01 фенола и метанола. Characterization of the strain Pseudomonas cepacia VDK VKPM B-7559. Storage medium: MPA and mineral medium containing 0.01 phenol and methanol each.

Культурально-морфологические признаки. Cultural and morphological characters.

Клетки грамотрицательные, неспорообразующие подвижные палочки размером 0,4 х 1,2 мкм. Рост на МПБ с образованием пленки. На МПА колонии на 2 сут роста до 3-5 мм в диаметре, гладкие, кремовые, в дальнейшем могут ослизняться. Gram-negative cells, non-spore-forming motile bacilli 0.4 x 1.2 μm in size. Growth on BCH with the formation of a film. On MPA, colonies on 2 days of growth up to 3-5 mm in diameter, smooth, cream, can later become mucus.

Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.

Аэроб, растет при 24-32^oC, оптимальное значение pH среды 6,8-7,3. Обладает оксидазной, твинэстеразной и липазной активностью. Восстанавливает нитраты в нитриты, не гидролизует крахмал, желатину. Усваивает глюкозу, арабинозу, маннозу, мальтозу, салицил, салициловую и бензойную кислоты, глицерин. При выращивании на минеральной среде с фенолом и метанолом использует их в качестве единственных источников углерода и энергии.Aerob, grows at 24-32 ^o C, the optimal pH of the medium is 6.8-7.3. It has oxidase, tweenesterase and lipase activity. Restores nitrates to nitrites, does not hydrolyze starch, gelatin. Absorbs glucose, arabinose, mannose, maltose, salicyl, salicylic and benzoic acids, glycerin. When grown on a mineral medium with phenol and methanol, it uses them as the sole sources of carbon and energy.

При внутрибрюшинном введении по 0,5 мл суточной миллиардной суспензии P. cepacia ВКПМ ВДК В-7559 белым беспородным мышам и морским свинкам животные не падали в течение 30 суток (срок наблюдения). В конце опыта животных усыпили хлороформом, вскрыли и произвели посевы внутренних органов на МПА отпечатками с целью выявления бактериального заражения. Чашки с посевами культивировали при 37^oC в течение 6 сут, рост микроорганизмов не обнаружен.After intraperitoneal administration of 0.5 ml of a daily billionth suspension of P. cepacia VKPM VDK B-7559 to white outbred mice and guinea pigs, the animals did not fall for 30 days (observation period). At the end of the experiment, the animals were euthanized with chloroform, opened and the internal organs were seeded on MPA with fingerprints in order to detect bacterial infection. Cups with crops were cultured at 37 ^o C for 6 days, the growth of microorganisms was not detected.

Промышленная применимость штамма подтверждается следующими примерами. The industrial applicability of the strain is confirmed by the following examples.

Пример 1. Example 1

Испытание утилизирующей активности штамма Р. cepacia ВДК ВКПМ В-7559. Утилизирующую активность испытывали при культивировании в колбах на шейкере (180 об/мин) при температуре 20-24^oC. Культуру штамма P. cepacia ВДК ВКПМ В-7559 в концентрации 10⁷ м.к. на 1 мл добавляли к смеси раствора фенола (400 мг/мл) и формальдегида (500 мг/мл). В качестве биогенных добавок использовали глицерин до 0,2% в конечной концентрации и фосфорную кислоту (25-30 мкл на 100 мл субстратной смеси). Через 3 сут концентрация токсикантов в смеси составила менее 1%.Test the utilizing activity of the strain P. cepacia VDK VKPM B-7559. Utilization activity was tested during cultivation in flasks on a shaker (180 rpm) at a temperature of 20-24 ^o C. Culture of the strain P. cepacia VDK VKPM B-7559 at a concentration of 10 ⁷ MK per 1 ml was added to a mixture of a solution of phenol (400 mg / ml) and formaldehyde (500 mg / ml). Glycerin up to 0.2% in final concentration and phosphoric acid (25-30 μl per 100 ml of substrate mixture) were used as biogenic additives. After 3 days, the concentration of toxicants in the mixture was less than 1%.

Пример 2. Контроль деструктирующей активности штамма Р. cepacia ВДК ВКПМ В-7559 путем проверки на токсичность культуральной среды после проведенной деструкции токсикантов. Токсичность культуральной среды определяли методом биотестирования с помощью стандартного промышленно изготавливаемого комплекта токсихромотест (Канада, ЕВРI) по методике, описанной Жмур Н.С. (Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестирования в России. М: Международный Дом Сотрудничества, 1997.-117 с.)
Бактериальные клетки удаляли центрифугированием при 7000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Контроль на токсичность показал отсутствие острой токсичности не разбавленной культуральной среды.Example 2. Monitoring the destructive activity of the strain P. cepacia VDK VKPM B-7559 by checking the toxicity of the culture medium after the destruction of toxicants. The toxicity of the culture medium was determined by bioassay using a standard industrially manufactured kit of toxichromotest (Canada, EBI) according to the method described by N. Zhmur (State and industrial control of water toxicity using bioassay methods in Russia. M: International House of Cooperation, 1997.-117 p.)
Bacterial cells were removed by centrifugation at 7000 rpm for 15 min at room temperature. A toxicity control showed the absence of acute toxicity of the undiluted culture medium.

Таким образом, представленный штамм P. cepacia ВДК ВКПМ В-7559 способен использовать в качестве питательного субстрата одновременно фенол и формальдегид в больших концентрациях, не обладает патогенными свойствами по отношению к экспериментальным животным (белым мышам, морским свинкам), что позволяет использовать его в качестве деструктора этих токсических веществ на очистных сооружениях. Этот штамм можно использовать для микробиологической очистки промышленных и бытовых стоков, содержащих фенол и формальдегид в достаточно высоких концентрациях. Thus, the presented strain of P. cepacia VDK VKPM B-7559 is able to use both phenol and formaldehyde as a nutrient substrate in high concentrations, does not have pathogenic properties in relation to experimental animals (white mice, guinea pigs), which makes it possible to use it as the destructor of these toxic substances in wastewater treatment plants. This strain can be used for microbiological treatment of industrial and domestic wastewater containing phenol and formaldehyde in sufficiently high concentrations.

Claims

The bacterial strain Psendomonas cepacia VDK VKPM B-7559, the toxic substance destructor is phenol and formaldehyde.