RU2039714C1

RU2039714C1 - Method for decontamination of water and soil surfaces from oil

Info

Publication number: RU2039714C1
Application number: RU93041474A
Authority: RU
Inventors: А.С. Яненко; Э.И. Аракелян; Т.В. Герасимова; Т.А. Губанова; Н.Б. Кирсанов; А.Г. Казаков; Г.А. Ларикова; И.Н. Полякова; В.Н. Пауков; Ю.Д. Цыганков
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов; Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр
Priority date: 1993-08-25
Filing date: 1993-08-25
Publication date: 1995-07-20

Abstract

FIELD: decontamination of water and soil surfaces from oil. SUBSTANCE: method includes application of oil-oxidizing bacteria and fertilizer sources of nitrogen and phosphorus onto contaminated surfaces with oil. Oil oxidizing bacteria are used in form of strain RHODOCOCOUS SP. BKPM S-1267 in amount of 1 g of dry mass per square meter of contaminated surface. EFFECT: higher efficiency. 2 tbl

Description

Изобретение относится к способам очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений с использованием нефтеокисляющих микроорганизмов. The invention relates to methods for purifying water and soil from oil pollution using oil-oxidizing microorganisms.

Известен способ очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, основанный на внесении на загрязненные участки различных штаммов и микроорганизмов [1]
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению является способ очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, включающий внесение на загрязненные участки биомассы нефтеокисляющих бактерий и удобрений источников азота и фосфора [2]
Общим недостатком известных способов очистки является то, что используемые нефтеокисляющие микроорганизмы не способны эффективно разрушать нефть и нефтепродукты при пониженных температурах (5-18^оС) в северных регионах страны.A known method of purifying water and soil from oil pollution, based on the introduction of contaminated sites of various strains and microorganisms [1]
The closest in technical essence and the achieved result to the claimed invention is a method of purifying water and soil from oil pollution, including the introduction of contaminated biomass of oil-oxidizing bacteria and fertilizers sources of nitrogen and phosphorus [2]
A common drawback of the known purification methods is that the used oil-oxidizing microorganisms are not able to effectively destroy the oil and oil products at low temperatures (5-18 ° ^C) in the northern regions of the country.

Цель изобретения повышение эффективности очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений при низких температурах. The purpose of the invention is to increase the efficiency of water and soil purification from oil pollution at low temperatures.

Поставленная цель достигается тем, что в способе очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, включающем внесение на загрязненные участки биомассы нефтеокисляющих бактерий и удобрений, в качестве нефтеокисляющих бактерий используют штамм Rhodococcus sp.НХ7 в количестве 1 г по сухой массе на 1 м² обрабатываемой поверхности.This goal is achieved by the fact that in the method of purifying water and soil from oil pollution, including the application of oil-oxidizing bacteria and fertilizers to contaminated biomass sites, Rhodococcus sp.HX7 strain is used as oil-oxidizing bacteria in an amount of 1 g by dry weight per 1 m ^{2 of the} treated surface .

Анализ заявляемого и известных технических решений показывает, что не имеется сведений об использовании штамма Rhodococcus sp.НХ7 в качестве нефтеокисляющих бактерий в количестве 1 г по сухой массе на 1 м² обрабатываемой поверхности. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".Analysis of the claimed and known technical solutions shows that there is no information on the use of the strain Rhodococcus sp.HX7 as oil-oxidizing bacteria in an amount of 1 g by dry weight per 1 m ^{2 of the} treated surface. Therefore, the claimed invention meets the condition of patentability "novelty."

В литературе и практике отсутствуют сведения о способе очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, идентичных заявляемому, и они не следуют явным образом из уровня техники. Это позволяет сделать вывод о том, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". In the literature and practice there is no information about the method of purification of water and soil from oil pollution, identical to the claimed, and they do not follow explicitly from the prior art. This allows us to conclude that the claimed invention meets the condition of patentability "inventive step".

Изобретение обеспечивает достижение технического результата, может быть реализовано в промышленности, а также обеспечивает возможность его многократного воспроизведения, что позволяет сделать вывод об удовлетворении заявляемого изобретения условию патентоспособности "промышленная применимость". The invention ensures the achievement of a technical result, can be implemented in industry, and also provides the possibility of its multiple reproduction, which allows us to conclude that the claimed invention satisfies the patentability condition "industrial applicability".

Штамм Rhodococcus sp.НХ7, используемый в данном процессе, изолирован из образцов почвы, отобранных в тундре на севере Архангельской области вблизи нефтяных скважин, и депонирован под номером ВКПМ S-1267 в Российской коллекции промышленных микроорганизмов. The strain Rhodococcus sp.HX7 used in this process is isolated from soil samples taken in the tundra in the north of the Arkhangelsk region near oil wells and deposited under VKPM number S-1267 in the Russian collection of industrial microorganisms.

Для очистки почвы или воды, в загрязненные участки вносят штамм НХ7 в виде водной суспензии, содержащей 10⁷-10⁸ жизнеспособных клеток в 1 мл, в количестве 1 л суспензии на 1 м² загрязненной площади.To clean the soil or water, the HX7 strain is introduced into the contaminated areas in the form of an aqueous suspension containing 10 ⁷ -10 ⁸ viable cells in 1 ml, in the amount of 1 liter of suspension per 1 m ^{2 of} contaminated area.

Для создания оптимальных условий размножения и роста клеток НХ7 в загрязненные участки вносятся минеральные удобрения источники азота и фосфора, такие как: калиевая или натриевая селитра, нитроаммофоска, аммиачная вода, суперфосфат в количествах, зависящих от уровня загрязненности, но с таким расчетом, чтобы начальное соотношение между элементами углерод:азот:фосфор поддерживалось на уровне 100:10:1, что является оптимальным для роста бактериальных клеток. To create optimal conditions for the reproduction and growth of HX7 cells, mineral fertilizers are fed with nitrogen and phosphorus sources, such as potassium or sodium nitrate, nitroammophoska, ammonia water, superphosphate in quantities that depend on the level of contamination, but with the expectation that the initial ratio between the elements carbon: nitrogen: phosphorus was maintained at a level of 100: 10: 1, which is optimal for the growth of bacterial cells.

Содержание нефти в воде и почве определяли весовым методом, используя хлороформ для экстракции. The oil content in water and soil was determined by the gravimetric method using chloroform for extraction.

В результате внесения в загрязненные участки биомассы штамма НХ7 и комплекса удобрений источников азота и фосфора, происходит снижение содержания нефти в 10 раз через 1,5 мес. As a result of introducing the HX7 strain and the fertilizer complex of sources of nitrogen and phosphorus into the contaminated areas of the biomass, the oil content is reduced 10 times in 1.5 months.

Биомассу клеток штамма НХ7 выращивают в жидких питательных средах следующего состава:
Среда А, г/л: Калий азотнокислый 1
Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,6
Натрий фосфорнокис- лый двузамещенный 1,4 Магний сернокислый 0,3
Водопроводная
вода до 1 л, рН 7,0-7,2
Культивирование проводят при 30^оС в течение 48 ч при активной аэрации. Биомассу отделяют от культуральной жидкости любым подходящим способом сепарацией или центрифугированием.The biomass of cells of strain HX7 is grown in liquid nutrient media of the following composition:
Medium A, g / l: Potassium nitrate 1
Potassium phosphorus
sour monosubstituted 0.6
Disubstituted sodium phosphate 1.4 Magnesium sulfate 0.3
Tap
water up to 1 l, pH 7.0-7.2
Cultivation is carried out at 30 ^about C for 48 hours with active aeration. The biomass is separated from the culture fluid by any suitable method by separation or centrifugation.

Для получения биомассы в сухом виде, клетки высушивают с помощью лиофилизации. Получаемая биомасса содержит 10¹¹ жизнеспособных клеток в 1 г сухих клеток.To obtain biomass in dry form, the cells are dried by lyophilization. The resulting biomass contains 10 ¹¹ viable cells in 1 g of dry cells.

Штамм Phodococcus sp.НХ7 обладает следующими характеристиками. Морфологические и культуральные свойства. Клетки штамма НХ7 неподвижные, граммположительные, некислотоустойчивые, спор не образуют. При росте бактерии имеют выраженный цикл развития (палочки кокки). Деление осуществляется в основном по раскалывающемуся типу, в растущих культурах доминируют V-формы. The strain Phodococcus sp.HX7 has the following characteristics. Morphological and cultural properties. The cells of the strain HX7 are motionless, gram-positive, non-acid-resistant, do not form spores. With growth, bacteria have a pronounced development cycle (cocci bacilli). The division is carried out mainly by the splitting type, in the growing cultures V-forms dominate.

При росте на среде МПА, сусло-агаре образуют кремовые или телесные с розовым оттенком колонии, на среде Гаузе II розовые колонии. When growing on MPA medium, wort agar form creamy or flesh-colored colonies with a pink tint, pink colonies on Gauze II medium.

Физиологические свойства: аэроб, растет при 3-30^оС и рН 4,5-11. Штамм катализа положительный и оксидаза отрицательный. Желатин не разжижает, молоко не пентонизирует.Physiological properties: aerobic, grows at 3-30 ^o C and pH 4.5-11. Catalysis strain is positive and oxidase is negative. Gelatin does not thin, milk does not pentonize.

В качестве источников азота используют соединения аммония и нитраты. Образует кислоту из следующих углеводов: глюкозы, арабинозы, салицина, лактозы, галактозы. В качестве единственного источника углерода используют глюкозу, сахарозу. Штамм способен использовать для роста сырую нефть и различные фракции нефти: н-алканов, ароматических углеводородов, а также различные продукты переработки нефти дизельное, реактивное моторные топлива, мазуты. Штамм НХ7 способен расти в средах, содержащих до 90% нефти. As sources of nitrogen, ammonium compounds and nitrates are used. It forms acid from the following carbohydrates: glucose, arabinose, salicin, lactose, galactose. Glucose, sucrose are used as the sole carbon source. The strain is able to use crude oil and various oil fractions for growth: n-alkanes, aromatic hydrocarbons, as well as various products of oil refining, diesel, jet motor fuels, and fuel oils. Strain HX7 is able to grow in environments containing up to 90% of oil.

Химический состав клеточной стенки: в клеточной стенке содержится мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза (IV тип клеточной стенки). The chemical composition of the cell wall: the cell wall contains meso-diaminopimelic acid, arabinose and galactose (type IV cell wall).

На основании культурально-морфологических, физиологических и биохимических свойств, а также их сравнения с коллекционными культурами штамм НХ7 классифицирован как Phodococcus sp. Based on the cultural-morphological, physiological and biochemical properties, as well as their comparison with collection cultures, the HX7 strain is classified as Phodococcus sp.

Заявляемый штамм не относится к патогенным микроорганизмам. Штамм не обладает вирулентными и токсигенными свойствами, не дессеминирует во внутренних органах лабораторных животных, не обладает иммуногенным и аллергенным действием. The inventive strain does not apply to pathogenic microorganisms. The strain does not have virulent and toxigenic properties, does not deseminate in the internal organs of laboratory animals, does not have immunogenic and allergenic effects.

Клетки штамма НХ7 хорошо сохраняют жизнеспособность и нефтеокисляющую активность при -20^оС в 30%-ном растворе глицерина в течение года. Клетки также хорошо сохраняются в лиофилизованном состоянии в течение 3 лет.Cells of strain NH7 well retain viability and oxidizing activity at ^-20 ° C in 30% glycerol solution for one year. Cells are also well preserved in a lyophilized state for 3 years.

П р и м е р 1. В колбы Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащие 100 мл питательной среды А с 0,5% нефти, вносят 1 мл культуры штамма НХ7, предварительно выращенной на среде того же состава в течение 2 сут при 30^оС. Колбы инкубируют на качалке (100 об/мин) при 5^оС, 18 и 30^оС в течение 4 сут. В другую серию колб вносится штамм P.putida 36 и инкубируют при тех же условиях,
Через каждые сутки в колбах определяют титр клеток и содержание нефти. Оказалось, что штамм НХ7 способен расти на нефти при всех температурах культивирования (титр клеток возрастает в 50-100 раз). При всех температурах убыль нефти составляет не менее 98% В то же время штамм 36 (прототип) в этих условиях способен активно расти на нефти только при 30^оС (убыль нефти не менее 98% ). При 18^оС наблюдался незначительный рост клеток (убыль нефти не превышала 20%). При 5^оС рост штамма 36 плотностью отсутствовал, изменений в нефтяной пленке не наблюдали. Таким образом, в отличие от прототипа, штамм НХ7 способен расти и утилизировать нефть в широком интервале температур. Результаты представлены в табл. 1.PRI me R 1. In Erlenmeyer flasks (750 ml) containing 100 ml of culture medium A with 0.5% oil, add 1 ml of culture of strain HX7, previously grown on medium of the same composition for 2 days at 30 ^C. The flasks are incubated on a shaker (100 rev / min) at ⁵ ° C, 18 and 30 ^{° C} for 4 days. A strain of P.putida 36 is introduced into another series of flasks and incubated under the same conditions.
Every day in the flasks determine the titer of the cells and the oil content. It turned out that the HX7 strain is able to grow on oil at all cultivation temperatures (the cell titer increases by 50-100 times). At all temperatures, decrease the oil is at least 98% At the same time, the strain 36 (prototype) under these conditions is able to actively grow only in the oil at ³⁰ ° C (decrease of oil is not less than 98%). At 18 ^° C, insignificant cell growth was observed (oil loss did not exceed 20%). At 5 ^° C, there was no growth of strain 36 with density; no changes in the oil film were observed. Thus, unlike the prototype, the strain HX7 is able to grow and utilize oil in a wide temperature range. The results are presented in table. 1.

П р и м е р 2. В 10 колб Эрленмейера вносят по 100 мл питательной среды А с начальным значением рН 4-12. В каждую колбу добавляют 3% нефти и вносят по 1 мл культуры штамма НХ7, предварительно выращенной на среде того же состава (рН 7,0) в течение 2 сут при 30^оС. Колбы инкубируют на качалке (120 об/мин) при 18-20^оС. Через 4 сут в каждой колбе определяют содержание нефти. Результаты представлены в табл. 2.PRI me R 2. In 10 Erlenmeyer flasks contribute 100 ml of culture medium A with an initial pH of 4-12. To each flask was added 3% oil and introduced to 1 ml culture NH7 strain previously grown on a medium of the same composition (pH 7.0) for 2 days at 30 ^C. The flasks are incubated on a shaker (120 rev / min) at 18 -20 ° ^C. After 4 days in each flask determine oil content. The results are presented in table. 2.

Как видно из табл. 2, штамм НХ7 способен утилизировать нефть в широком интервале значений рН, что позволяет использовать данный штамм для очистки почв и воды различной кислотности без их предварительной нейтрализации. As can be seen from the table. 2, the HX7 strain is capable of utilizing oil in a wide range of pH values, which makes it possible to use this strain for cleaning soils and water of various acidity without their preliminary neutralization.

П р и м е р 3. Участок тундровой почвы загрязнен сырой нефтью с начальным содержанием нефти 60 г на 1 кг почвы. Для очистки почвы на 1 м² обрабатываемой площади вносится 1 л озерной воды, содержащей 1 г лиофилизированных клеток и 6 г нитроаммофоски. Средняя температура в период обработки составляла 13^оС. Через 1,5 мес содержание нефти в почве составляло 5,8-6 г на 1 кг почвы, т.е. около 90% нефти было разрушено.PRI me R 3. A plot of tundra soil contaminated with crude oil with an initial oil content of 60 g per 1 kg of soil. To clean the soil per 1 m ^{2 of the} cultivated area, 1 l of lake water is introduced, containing 1 g of lyophilized cells and 6 g of nitroammophos. The average temperature during treatment was 13 ° ^C. After 1.5 months the oil content of the soil was 5,8-6 g per 1 kg of soil, i.e. about 90% of the oil was destroyed.

П р и м е р 4. Амбар отстойника на нефтяной скважине объем 100 т, площадь 100 м² (Север России, тундра). Исходное содержание нефти в воде амбара составляло 14,5 мг/л. Над поверхностью амбара разбрызгивали клеточную суспензию (1 г/л), содержащую нитроаммофоску в концентрации 1,4 г/л с таким расчетом, чтобы на 1 м² обрабатываемой поверхности расходовалось 1 л суспензии. Через 20 дней после однократной обработки содержание нефтепродуктов в воде снизилось до 0,07 мг/л.PRI me R 4. The barn of the sump in an oil well with a volume of 100 tons, an area of 100 m ² (North of Russia, tundra). The initial oil content in the barn water was 14.5 mg / L. A cell suspension (1 g / l) containing nitroammophoska at a concentration of 1.4 g / l was sprayed over the barn surface so that 1 l of suspension was consumed per 1 m ^{2 of the} treated surface. 20 days after a single treatment, the oil content in the water decreased to 0.07 mg / L.

Таким образом, использование штамма Phodococcus sp. НХ7 в качестве нефтеокисляющих бактерий позволяет эффективно очищать воду и почву от нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах в северных регионах страны. Thus, the use of a strain of Phodococcus sp. HX7 as an oil-oxidizing bacteria allows you to effectively clean water and soil from oil and oil products at low temperatures in the northern regions of the country.

Claims

METHOD FOR CLEANING WATER AND SOIL FROM OIL POLLUTIONS, including the application of oil-oxidizing bacteria and fertilizers to contaminated biomass sites, characterized in that the strain Phodococcuc sp. Is used as oil-oxidizing bacteria. VKPM S-1267 in the amount of 1 g by dry weight per 1 m ^{2 of the} treated surface.