RU1499916C

RU1499916C - Strain of bacterium arthrobacter crystallopoietes used for sewage treatment from 2,6-dimethylpyridine, 2-methylpyridine and 4-methylpyridine

Info

Publication number: RU1499916C
Authority: RU
Inventors: Ф.М. Хасаева; Л.И. Воробьева; Е.В. Довгилевич; С.Д. Таптыкова; Л.В. Модянова; П.Б. Терентьев; Ю.Г. Бундель
Original assignee: Хасаева Фатимат Машировна
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1987-04-03
Publication date: 1994-10-15

Abstract

FIELD: microbiological industry. SUBSTANCE: new strain Arthrobacter crystallopoietes VKM AC-1098D (KM-4) is isolated from the soil of chemical-pharmaceutical plant. Strain quickly utilizes 3 compounds of pyridine order: 2,6-dimethyl- pyridine 0.3 vol.%; 2-methylpyridine 0.2 vol.% and 4-methylpyridine 0.15 vol.% as a single source of carbon and nitrogen for 24 h, and in the mixture also. EFFECT: widened spectrum of destruction activity of new strain. 8 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма, который может быть использован при биологической очистке промышленных сточных вод ряда производств микробиологической, коксохимической и медицинской отраслей промышленности от высокотоксичных 2,6-диметилпиридина, 2-метилпиридина и 4-метилпиридина. The invention relates to the microbiological industry and relates to the production of a new strain that can be used in the biological treatment of industrial wastewater from a number of microbiological, coke and medical industries from highly toxic 2,6-dimethylpyridine, 2-methylpyridine and 4-methylpyridine.

Целью изобретения является новый штамм бактерий, обладающий более широким спектром деструктивной активности и эффективно утилизирующий 2,6-диметилпиридин, 2-метилпиридин и 4-метилпиридин. Эти соединения полностью разрушаются штаммом как по отдельности, так и в смеси. The aim of the invention is a new strain of bacteria with a wider spectrum of destructive activity and effectively utilizing 2,6-dimethylpyridine, 2-methylpyridine and 4-methylpyridine. These compounds are completely destroyed by the strain, both individually and in mixture.

Штамм Arthrobacter crystallopoietes ВКМ Ас-1098D (КМ-4) выделен из образцов почв, отобранных с территории химико-фармацевтического завода методом накопительных культур, на минеральной среде следующего состава, г/л: Na₂HPO₄ 4,26; КН₂PO₄ 2,65; MgSO₄ х 7H₂O 0,2; MnSO₄ х 7H₂O 0,002; FeSO₄ х 7H₂O 0,01; CaCl₂ х H₂O 0,02; Na₂MoO₄ 0,001; дистиллированная вода до 1 л, рН 7,0-7,2. Источником углерода и азота является 2,6-диметилпиридин.The strain Arthrobacter crystallopoietes VKM Ac-1098D (KM-4) was isolated from soil samples taken from the territory of the chemical-pharmaceutical plant by the method of cumulative cultures on a mineral medium of the following composition, g / l: Na ₂ HPO ₄ 4,26; KH ₂ PO ₄ 2.65; MgSO ₄ x 7H ₂ O 0.2; MnSO ₄ x 7H ₂ O 0.002; FeSO ₄ x 7H ₂ O 0.01; CaCl ₂ x H ₂ O 0.02; Na ₂ MoO ₄ 0.001; distilled water up to 1 l, pH 7.0-7.2. The source of carbon and nitrogen is 2,6-dimethylpyridine.

В колбы емкостью 750 мл, содержащие 200 мл среды, вносят по 20 г почвы и инкубируют 15 дней на качалке 200 об/мин при температуре 28-30^оС. Затем из колб отбирают по 20 мл накопительной культуры и вносят в колбы со свежей средой. Пересевы повторяют до появления видимого роста бактерий. Чистую культуру выделяют из отдельной колонии, полученной путем рассева накопительной культуры на чашки с агаризованной минеральной средой с 2,6-диметилпиридином.The 750 ml flasks containing 200 ml of medium, is made of 20 g soil and incubated for 15 days on a shaker of 200 revolutions / minute at a temperature of ^about 28-30 C. Then is taken from the flasks on 20 ml batch culture and introduced into the flask with fresh medium . Reseeding is repeated until the appearance of visible growth of bacteria. A pure culture is isolated from a separate colony obtained by sieving the accumulation culture into plates with agarized mineral medium with 2,6-dimethylpyridine.

Штамм хранят как методами лиофилизации и криоконсервации в лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита, так и субкультивированием. Для субкультивирования штамм выращивают на минеральной среде с 3 г/л 2,6-диметилпиридина в течение 24-28 ч. Выращенную культуру разливают в мицелиальные пробирки по 20 мл и хранят при 4^оС. Пересевают 1 раз в 3 мес.The strain is stored both by lyophilization and cryopreservation methods in horse serum with 5% meso-inositol, and subculture. For subculturing strain was grown on a mineral medium with 3 g / l of 2,6-dimethylpyridine during 24-28 hours. The grown culture filled into filamentous tubes of 20 ml and stored at 4 ° ^C. 1 passaged every 3 months.

Штамм А. crystallopoietes КМ-4 имеет следующие признаки. Strain A. crystallopoietes KM-4 has the following characteristics.

Морфолого-культуральные признаки. Morphological and cultural characteristics.

Клетки грамположительные, неподвижные, бесспоровые, некислотоустойчивые, подвергаются морфологическому изменению во время роста: старые культуры (обычно 2-7 дней) состоят полностью или главным образом из кокковидных клеток. При пересевах на свежую среду рост происходит путем увеличения кокковидных клеток, встречается V-образное деление. Размеры клеток (0,5-0,8)х(1,2-4,0) мкм. В жидкой минеральной среде с 2,6-диметилпиридином штамм растет, образуя муть, осадок, который при взбалтывании легко взмучивается. Наблюдается образование светло-желтого пигмента. На агаризованной минеральной среде с 2,6-диметилпиридином культура однородна, колонии круглые, блестящие, гладкие, выпуклые, желтые, 0,5-3,0 мм, пастообразной консистенции, растут за 60 ч. На МПА характер колоний культуры не меняется, однако их размер больше (1-4 мм), растут за 36 ч. На МПБ образуется светло-желтая пленка, небольшой осадок. Gram-positive cells, motionless, indisputable, non-acid-resistant, undergo a morphological change during growth: old cultures (usually 2-7 days) consist entirely or mainly of cocciform cells. When reseeding on fresh medium, growth occurs by increasing cocciform cells, V-shaped division occurs. Cell sizes (0.5-0.8) x (1.2-4.0) microns. In a liquid mineral medium with 2,6-dimethylpyridine, the strain grows, forming turbidity, a precipitate that easily agitates when shaken. The formation of a light yellow pigment is observed. On an agarized mineral medium with 2,6-dimethylpyridine, the culture is homogeneous, the colonies are round, shiny, smooth, convex, yellow, 0.5-3.0 mm, pasty consistency, grow in 60 hours. The nature of the culture colonies does not change on IPA, however their size is larger (1-4 mm), they grow in 36 hours. A light yellow film and a small precipitate form on the BCH.

Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.

Строгий аэроб, оптимальная температура роста 28-30^оС, максимальная температура роста 41^оС. Оптимум рН 7,0-7,2. Рост не ингибируется при 6,5% NaCl. Каталазоположителен и оксидазоотрицателен. Не образует кислот при росте на галактозе, ксилозе, сахарозе, арабинозе, глюкозе, фруктозе, мальтозе, рибозе, рафинозе, манните, глицерине. Не образует ацетилметилкарбинол и индол. Нитраты восстанавливает до нитритов, желатину не разжижает, крахмал не гидролизует. Клеточная стенка содержит лизин, менахиноны-9(Н₂). Нуклеотидный состав ДНК (мол.% ГЦ) 63,2. Непатогенен. Признаки штамма устойчивы. В факторах роста не нуждается. Другие органические соединения, такие как бензол и его производные, пиридин и его производные (кроме 2,6-диметилпиридина, 2-метилпиридина и 4-метилпиридина), хинолин, хинальдин, пиперидин не поддерживают рост штамма. Антибиотики, такие как рифампицин, тетрациклин, канамицин и левомицетин сильно подавляют рост штамма. Штамм А. crystallopoietes полностью разрушает производные пиридина как индивидуально, г/л: 4,0 2,6-диметилпиридина за 76 ч; 3,0 2-метилпиридина за 66 ч; 1,5 4-метилпиридина за 52 ч, так и в смеси.Strict aerobe, optimum growth temperature 28-30 ^{° C,} maximum growth temperature is 41 ° ^C Optimum pH 7.0-7.2. Growth is not inhibited with 6.5% NaCl. Catalase-positive and oxidase-negative. Does not form acids when grown on galactose, xylose, sucrose, arabinose, glucose, fructose, maltose, ribose, raffinose, mannitol, glycerin. Does not form acetylmethylcarbinol and indole. It restores nitrates to nitrites, does not dilute gelatin, and does not hydrolyze starch. The cell wall contains lysine, menaquinones-9 (H ₂ ). The nucleotide composition of DNA (mol.% HZ) 63.2. Non-pathogenic. The signs of the strain are stable. It does not need growth factors. Other organic compounds, such as benzene and its derivatives, pyridine and its derivatives (except 2,6-dimethylpyridine, 2-methylpyridine and 4-methylpyridine), quinoline, quinaldine, piperidine do not support strain growth. Antibiotics such as rifampicin, tetracycline, kanamycin and chloramphenicol strongly inhibit the growth of the strain. Strain A. crystallopoietes completely destroys the pyridine derivatives individually, g / l: 4.0 2,6-dimethylpyridine in 76 hours; 3.0 2-methylpyridine in 66 hours; 1.5 4-methylpyridine in 52 hours, and in a mixture.

П р и м е р 1. Разложение метилпиридинов в колбах при аэрации. PRI me R 1. The decomposition of methylpyridines in flasks during aeration.

Штамм А. crystallopoietes выращивают на приведенной выше минеральной среде. В качестве источника углерода и азота используют одно из производных пиридина: либо 2,6-диметилпиридин, либо 2-метилпиридин, либо 4-метилпиридин. Культивирование проводят в качалочных колбах с 200 мл среды при 28-30^оС на качалке 200 об/мин.Strain A. crystallopoietes is grown in the above mineral medium. As a source of carbon and nitrogen, one of the pyridine derivatives is used: either 2,6-dimethylpyridine, or 2-methylpyridine, or 4-methylpyridine. Cultivation is carried out in rocking flasks with 200 ml of medium at 28-30 ^about C on a rocking chair 200 rpm.

Получение посевного материала для утилизации 2,6-диметилпиридина осуществляют следующим образом. Культуру штамма, хранившуюся в мицелиальных пробирках, переносят в колбы с 200 мл среды, где содержится 3 г/л данного субстрата. Посевной материал для утилизации 2-метилпиридина получают так же, только субстрата в среде содержится 2 г/л. Obtaining seed for the disposal of 2,6-dimethylpyridine is as follows. The strain culture stored in the mycelial tubes is transferred to flasks with 200 ml of medium containing 3 g / l of this substrate. Seeds for the utilization of 2-methylpyridine are obtained in the same way, only the substrate in the medium contains 2 g / l.

При получении посевного материала для утилизации 4-метилпиридина субстрат в среду вносят дробно по 1,0 г/л через каждые 24 ч культивирования. Upon receipt of the seed for the utilization of 4-methylpyridine, the substrate is introduced into the medium fractionally at 1.0 g / l after every 24 hours of cultivation.

Выращивание культур проводят на качалке 200 об/мин при 28-30^оС в течение 24-28 ч, для культуры, разрушающей 4-метилпиридин, 48-50 ч. Посевной материал вносят в объеме 10%.Growing cultures is carried on a rocker 200 rev / min at 28-30 ^{° C} for 24-28 hours, culture, destroying 4-methylpyridine, 48-50 hours. The inoculum is introduced into a volume of 10%.

Полноту потребления метилированных производных пиридина определяют в подкисленной НСl до рН 2,0 и отделенной от биомассы центрифугированием культуральной жидкости на спектрофотометре, а также с помощью хромато-масс-спектрометрии. The completeness of consumption of methylated pyridine derivatives is determined in acidified HCl to pH 2.0 and separated from the biomass by centrifugation of the culture fluid on a spectrophotometer, as well as by chromatography-mass spectrometry.

Время полного разрушения пиридиновых производных в зависимости от их концентрации представлено в табл. 1, 2, 3, а в табл. 4, 5, 6 дана динамика деструкции метилированных производных пиридина при максимально возможных концентрациях. The time of complete destruction of the pyridine derivatives, depending on their concentration, is presented in table. 1, 2, 3, and in table. 4, 5, 6 give the dynamics of the destruction of methylated pyridine derivatives at the maximum possible concentrations.

П р и м е р 2. Разложение метилпиридинов в смеси в колбах при аэрации. PRI me R 2. The decomposition of methylpyridines in a mixture in flasks during aeration.

Условия культивирования штамма те же, что в примере Х 1, но все 3 субстрата вносят вместе. Время полной утилизации пиридиновых производных в смеси в зависимости от концентрации дано в табл. 7, а динамика деструкции этих соединений в смеси при максимально возможной концентрации дана в табл. 8. The cultivation conditions of the strain are the same as in Example X 1, but all 3 substrates are added together. The time for complete utilization of the pyridine derivatives in the mixture, depending on the concentration, is given in table. 7, and the dynamics of the destruction of these compounds in the mixture at the maximum possible concentration is given in table. 8.

П р и м е р 3. Утилизация смеси пиридиновых производных в реальной сточной воде штаммом А. crystallopoietes. PRI me R 3. Disposal of a mixture of pyridine derivatives in real wastewater by strain A. crystallopoietes.

Процесс проводят в ферментере при аэрации. Посевным материалом в количестве 100 мл, приготовленным так, как описано в примере 1, засевают ферментер емкостью 3,0 л, содержащий 900 мл реальной сточной воды коксохимического завода, с рН 6-8, содержащей следующие компоненты: фенол 0,5-1,0 г/л бенз/a/пирен 20-2000 мкг/л, пиридиновые основания 40-500 мг/л, органические спирты: метанол 0,2-5 г/л, роданистые соли (тиоцианата) 100-700 мг/л, аммонийные соли 1-2 мг/л, температура 25-28^оС.The process is carried out in a fermenter during aeration. Inoculum in an amount of 100 ml, prepared as described in example 1, seeded fermenter with a capacity of 3.0 l, containing 900 ml of real wastewater of a coke plant, with a pH of 6-8, containing the following components: phenol 0.5-1, 0 g / l benz / a / pyrene 20-2000 μg / l, pyridine bases 40-500 mg / l, organic alcohols: methanol 0.2-5 g / l, thiocyanate thiocyanate salts 100-700 mg / l, ammonium salts of 1-2 mg / l, a temperature of 25-28 ^about C.

Режим культивирования: перемешивание 250 об/мин; аэрация 1 л/л сточной воды, мин; температура 28^оС. Было установлено, что данная культура с высокой скоростью разрушает пиридиновые основания в сточной воде так, что при начальной концентрации 90 мг/л через 6 ч культивирования в воде остается 0,9 мг/л, а к 24 ч наблюдают их полную утилизацию.Cultivation mode: stirring 250 rpm; aeration of 1 l / l of waste water, min; temperature 28 ° ^C. It was found that the culture is a high speed breaks pyridine bases in the waste water so that an initial concentration of 90 mg / l after 6 hours of culture in water is 0.9 mg / l and 24 hours to observe their full disposal.

Микрофлора сточной воды, включающая Pseudomonas sp., активно разрушающий фенол; Pseudomonas aeurogenosa, утилизирующий хинолин не оказывает влияния на жизнеспособность и биохимическую активность штамма А. crystallopoietes. Microflora of wastewater, including Pseudomonas sp., Actively destroying phenol; Pseudomonas aeurogenosa utilizing quinoline does not affect the viability and biochemical activity of A. crystallopoietes strain.

Фенол и другие органические ароматические соединения, содержащиеся в сточной воде, не ингибируют рост штамма, но не утилизируются данным штаммом. Phenol and other organic aromatic compounds contained in wastewater do not inhibit the growth of the strain, but are not utilized by this strain.

Claims

The bacterial strain Arthrobacter crystallopoietes VKM Ac-1098 used for wastewater treatment from 2,6-dimethylpyridine, 2-methylpyridine and 4-methylpyridine.