RU2081909C1

RU2081909C1 - Strain of microorganisms acinetobacter species-28 showing capability to utilize hydrocarbons

Info

Publication number: RU2081909C1
Application number: RU95108472A
Authority: RU
Inventors: В.И. Батарин
Original assignee: Акционерное общество закрытого типа "Экоросс"
Priority date: 1995-05-24
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 1997-06-20

Abstract

FIELD: microbiology. SUBSTANCE: invention proposes the strain of microorganisms Acinetobacter species-28. EFFECT: increased rate of biodegradation of petroleum products mixture.

Description

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды. The invention relates to the field of applied microbiology, namely to strains of microorganisms capable of utilizing hydrocarbons.

Известна возможность ряда микроорганизмов утилизировать углеводороды. В частности, для этих целей используют Aspergillus niger, Aspergillus sp. Candida tropical, Pseudomonas putida /1 3/. It is known that a number of microorganisms can utilize hydrocarbons. In particular, Aspergillus niger, Aspergillus sp. Candida tropical, Pseudomonas putida / 1 3 /.

Наибольшую известность для указанных целей получили штаммы Ps. putida, на основе которых был получен препарат "Путидойл" /4/. Однако указанный препарат эффективно не действует на все виды углеводородов или их смесей, что заставляет искать более активные в указанном отношении микроорганизмы. The strains of Ps were best known for these purposes. putida, on the basis of which the preparation "Putidul" was obtained / 4 /. However, this drug does not effectively affect all types of hydrocarbons or mixtures thereof, which makes us search for more active microorganisms in this respect.

Бактерии рода Acinetobacter являются широко распространенными всеядными хемогетеротрофами с окислительным метатоблизмом. Они способны использовать в качестве источника углерода и энергии различные органические вещества, что делает их перспективными для использования для экологический целей, в частности переработки углеводородов нефти и нефтепродуктов /5, 6/. Bacteria of the Acinetobacter genus are widespread omnivorous chemoheterotrophs with oxidative metatobism. They are able to use various organic substances as a source of carbon and energy, which makes them promising for environmental use, in particular, the processing of petroleum hydrocarbons and oil products / 5, 6 /.

Из возможных областей применения Acinetobacter следует отметить способность Acinetobacter caleoaceticus NCIB 8250 расти на средах, содержащих до 1 мг/л фенола /7/. Among the possible applications of Acinetobacter, the ability of Acinetobacter caleoaceticus NCIB 8250 to grow on media containing up to 1 mg / l phenol / 7 / should be noted.

Использование Acinetobacter в качестве активного начала для нефтедеградирующих препаратов в просмотренной литературе не обнаружено. The use of Acinetobacter as an active principle for oil-degrading drugs in the scanned literature is not found.

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось получение штамма бактерий Acinetobacter, способного утилизировать углеводороды. The problem solved in the framework of the present invention was to obtain a strain of bacteria Acinetobacter, capable of utilizing hydrocarbons.

Указанная задача была решена получением штамма Acinetobacter sp. 28. This problem was solved by obtaining a strain of Acinetobacter sp. 28.

Штамм был выделен из образцов почвы Катангского района Иркутской области на среде, содержащей углеводороды, и селектирован по максимальной способности утилизировать пентадекан. The strain was isolated from soil samples of the Katanga district of the Irkutsk region on a medium containing hydrocarbons, and selected according to the maximum ability to utilize pentadecane.

Штамм выращивают при 28^oC в течение 48 часов на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат кильки 10,05 г; хлорид натрия 4,95 г; воды дистиллированной до 1 л; pH (до автоклавирования) -7,1.The strain is grown at 28 ^o C for 48 hours on a liquid nutrient medium containing a sprat hydrolyzate of 10.05 g; sodium chloride 4.95 g; distilled water up to 1 l; pH (before autoclaving) -7.1.

В бульоне однородная муть и слабый мелкодисперсный осадок. Консистенция бульона вязкая. При посеве в полужидкие среды (0,6% агар) и в толщу плотной питательной среды (1,5% агар) рост в толще агара отсутствует. Рост колоний наблюдается только на поверхности питательной среды. The broth has homogeneous turbidity and a weak finely divided precipitate. The consistency of the broth is viscous. When sowing in semi-liquid medium (0.6% agar) and in the thickness of a dense nutrient medium (1.5% agar), growth in the thickness of agar is absent. Colony growth is observed only on the surface of the nutrient medium.

На поверхности плотной питательной среды колонии имеют правильную круглую форму. Диаметр колоний 2 3 мм. Колонии гладкие, выпуклые, беловатые, окружены прозрачным ореолом неправильной формы. Край колоний гладкий, по мере старения колонии (через 6 суток) он становится волнистым. On the surface of a dense nutrient medium, the colonies have a regular round shape. The diameter of the colonies is 2 3 mm. The colonies are smooth, convex, whitish, surrounded by a transparent halo of irregular shape. The edge of the colonies is smooth, as the colony ages (after 6 days) it becomes wavy.

Пигмент, диффундирующий в питательную среду, отсутствует. The pigment diffusing into the nutrient medium is absent.

Морфология клеток грамотрицательные клетки округлой формы. Диаметр клетки 1,2 мкм. Жгутиков и пилей не имеют. Клетки одиночные и диплококки, неподвижные. Morphology of cells gram-negative cells of a rounded shape. The diameter of the cell is 1.2 microns. Flagella and pili do not have. Single cells and diplococci, motionless.

Физиологическая характеристика штамма: аэроб, неподвижный, каталозо-положительный, оксидазо-отрицательный, не разжижает желатину. Не растет на глюкозе, сахарозе, лактозе, мальтозе, L-арабинозе, манните, сорбите, глицерине, L-β-фенилаланине, цитрате натрия, L-гистидине, если они используются в качестве единственного источника углерода. Physiological characteristics of the strain: aerobic, motionless, catalose-positive, oxidase-negative, does not thin the gelatin. Does not grow on glucose, sucrose, lactose, maltose, L-arabinose, mannitol, sorbite, glycerin, L-β-phenylalanine, sodium citrate, L-histidine, if they are used as the sole carbon source.

При выращивании на минимальных средах может использовать в качестве единственного источника углерода метанол, этанол, твин-80, декан, додекан, пентадекан, гексадекан, вазелин. Растет в среде, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. When grown on minimal media, it can use methanol, ethanol, tween-80, decane, dodecane, pentadecane, hexadecane, petroleum jelly as the sole carbon source. It grows in a medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / ml.

Анаэробный тест Хью-Лейфсона отрицательный. Не образует индола, на среде Клингера не выделяет сероводорода. Гемолиз на кровяном агаре отсутствует. The Hugh-Leifson anaerobic test is negative. It does not form indole, does not emit hydrogen sulfide on the Klinger medium. Hemolysis on blood agar is absent.

Не имеет интратредуктазы, аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, триптофандезаминазы. It does not have intratreductase, arginine dehydrolase, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, tryptophandesaminase.

Штамм может расти в диапазоне pH 6,5 9,5. Оптимальное значение рН среды 7,2. The strain can grow in the range of pH 6.5 to 9.5. The optimal pH value of 7.2.

Диапазон температур 20 30^oC. Оптимальная температура роста - 28^oC.The temperature range is 20-30 ^o C. The optimum growth temperature is 28 ^o C.

Штамм не обладает азотфиксирующими свойствами. Не патогенен. The strain does not have nitrogen-fixing properties. Not pathogenic.

Штамм хранится при 4^oC на питательной среде, содержащей 0,06 0,09% общего азота с добавлением 0,2 0,4% агара. Срок хранения до 1 года.The strain is stored at 4 ^o C in a nutrient medium containing 0.06 0.09% of total nitrogen with the addition of 0.2 0.4% agar. Shelf life up to 1 year.

Длительное хранение (2 года и более) осуществляется в сублимимированном виде в запаянных ампулах. Защитная среда при высушивании 5,5% лактозы, 1,7% полиглюкина. Long-term storage (2 years or more) is carried out in sublimated form in sealed ampoules. Protective medium upon drying 5.5% lactose, 1.7% polyglucin.

Штамм выращивают при 28^oC на питательной среде в течение 24 часов или на посевной среде в течение 72 часов.The strain is grown at 28 ^o C on a nutrient medium for 24 hours or inoculum for 72 hours.

Жидкая питательная среда:
триптический гидролизат кильки 10,05 г,
натрия хлорид 4,95 г,
вода дистиллированная до 1 л,
рН (до автоклавирования) 7,1.Liquid culture medium:
tryptic sprat hydrolyzate 10.05 g,
sodium chloride 4.95 g,
distilled water up to 1 l,
pH (before autoclaving) 7.1.

Плотная питательная среда:
гидролизат кильки 17,9 г,
натрия хлорид 5,9 г,
агар 11, 2 г,
вода дистиллированная до 1 л,
рН (до автоклавирования) 7,2.Dense nutrient medium:
sprat hydrolyzate 17.9 g,
sodium chloride 5.9 g,
agar 11, 2 g,
distilled water up to 1 l,
pH (before autoclaving) 7.2.

Посевная среда:
азотнокислый калий 1,52 г,
аммоний фосфорнокислый однозамещенный 2,95 г,
калий фосфорнокислый двузамещенный 0,87 г,
натрий фосфорнокислый однозамещенный 1,2 г,
натрия хлорид 0,5 г,
магний сернокислый 0,1 г,
кальция хлорид 0,025 г,
дрожжевой экстракт 0,1 г,
пентадекан 0,5%
вода дистиллированная до 1 л,
рН (до автоклавирования) 7,0.Sowing medium:
potassium nitrate 1.52 g,
monosubstituted ammonium phosphate 2.95 g,
potassium phosphate disubstituted 0.87 g,
monosubstituted sodium phosphate 1.2 g,
sodium chloride 0.5 g,
magnesium sulfate 0.1 g,
calcium chloride 0.025 g,
yeast extract 0.1 g,
pentadecane 0.5%
distilled water up to 1 l,
pH (before autoclaving) 7.0.

Генетические особенности штамма в процессе селекции штамм не подвергался воздействию мутагенных факторов и методов генной инженерии. The genetic characteristics of the strain during the selection process, the strain was not exposed to mutagenic factors and genetic engineering methods.

Активность штамма определяется косвенным путем по появлению мутности в пробирке при выращивании культуры на посевной среде через 72 часа инкубации. The activity of the strain is determined indirectly by the appearance of turbidity in a test tube when growing culture on inoculum after 72 hours of incubation.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции микроорганизмов НИИСХНБ. The strain is deposited in the All-Russian Collection of microorganisms NIISHNB.

В настоящее время штамм используется для получения компонентов препарата, обладающего биоремедиационными свойствами по отношению к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами. Currently, the strain is used to obtain components of the drug, which has bioremediation properties in relation to environmental pollution by oil products.

Практическая применимость штамма иллюстрируется следующими примерами. The practical applicability of the strain is illustrated by the following examples.

Пример 1. Example 1

К суспензии клеток Acinetobacter sp. 28, выращенных на посевной среде с концентрацией 10³кл/мл, добавляли 1% толуола, после чего термостатировали на качалке при 20^oC в течение 32 часов.To a cell suspension of Acinetobacter sp. 28, grown on a seed medium with a concentration of 10 ³ cells / ml, was added 1% toluene, and then thermostatted on a shaker at 20 ^o C for 32 hours.

Степень биодеградации толуола составила через 8 часов 39% через 16 часов 87% через 24 часа -96% через 32 часа 99,5%
Пример 2.The degree of toluene biodegradation after 8 hours was 39% after 16 hours 87% after 24 hours -96% after 32 hours 99.5%
Example 2

В условиях примера 1 в колбу вводили 0,5% сланцевого масла и термостатировали при 20^oC в течение 48 часов. Степень деградации сланцевого масла составила через 16 часов 48% через 32 часа -86% через 48 часов 99,7%
Как показали эксперименты, штамм проявляет высокую биодеградирующую активность как в отношении индивидуальных углеводородов, так и их технологических смесей.Under the conditions of Example 1, 0.5% shale oil was introduced into the flask and thermostated at 20 ^° C. for 48 hours. The degree of degradation of shale oil was 48% after 16 hours, after 32 hours -86% after 48 hours, 99.7%
As experiments have shown, the strain exhibits high biodegradable activity both in relation to individual hydrocarbons and their process mixtures.

Источники информации
1. Ю.Н. Карасевич. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М. Наука, 1982.Sources of information
1. Yu.N. Karasevich. Fundamentals of the selection of microorganisms utilizing synthetic organic compounds. M. Science, 1982.

Biochem. Biophys. Res. Communs, 1977, v. 78, 1, p. 401 410. Biochem. Biophys. Res. Communs, 1977, v. 78, 1, p. 401 410.

Agr. Biol. Chem. 1968, v. 32, 8, p. 1033 1039. Agr. Biol. Chem. 1968, v. 32, 8, p. 1033 1039.

J. Bacteriol. 1976, v. 125, 3, p. 818. J. Bacteriol. 1976, v. 125, 3, p. 818.

Краткий определитель бактерий Берги. М. Мир, 1980, с. 244. A brief guide to Bergi bacteria. M. Mir, 1980, p. 244.

Р. Стейннер и др. Мир микробов. Т. 3, М. Мир, 1979, с. 142. R. Steinner et al. The world of microbes. T. 3, M. Mir, 1979, p. 142.

J. Gen. Microbiol. 1973, v. 74, 1, p. 139 148.0 J. Gen. Microbiol. 1973, v. 74, 1, p. 139 148.0

Claims

The strain of microorganisms Acinetobacter species N D "VNIISCHM-482", with the ability to utilize hydrocarbons.