RU2064264C1

RU2064264C1 - Штамм бактерий bacillus thuringiensis, предназначенный для получения препарата против личинок кровососущих двукрылых

Info

Publication number: RU2064264C1
Application number: RU9393053692A
Authority: RU
Inventors: Э.И. Соколова; Л.И. Чекалина; Н.М. Кулиева
Original assignee: Соколова Эльвира Ивановна
Priority date: 1993-11-25
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 1996-07-27

Abstract

Использование: биотехнология, в частности средства борьбы с комарами. Сущность: предложен штамм культуры Bacillus thuringiensis, обладающий энтомоцидной активностью. Штамм предназначен для получения препарата против личинок кровососущих двукрылых. 2 табл.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и касается биологических средств борьбы с кровососущими двукрылыми, в частности с комарами.

Кровососущие двукрылые, такие как комары, могут являться переносчиками возбудителей заболеваний человека и животных, и, например, распространением малярии, арбовирусов и других инфекционных заболеваний человек обязан комарам. В этой связи борьба с кровососущими переносчиками заболеваний является важной социально-медицинской проблемой.

Учитывая особенности цикла развития кровососущих комаров, основные усилия по контролю за их численностью направлены на уничтожение личинок комаров, обитающих в водной среде.

Известные химические средства борьбы с личинками кровососущих комаров загрязняют окружающую среду и могут обладать токсичностью по отношению к полезным растениям и животным.

Биологические ларвицидные средства не вызывают таких острых экологических проблем и предпочтительны в использовании.

Наиболее распространенные биологические препараты, токсичные в отношении кровососущих комаров, готовят на основе энтомопатогенных бактерий вида Bacillus thuringiensis серотипа Н-14.

Известен, например, штамм Bacillus thuringiensis Н-14 N 71, на основе которого создан отечественный ларвицидный препарат бактокулицид [1]
Штамм обладает выраженной энтомоцидной активностью в отношении личинок комаров, но проявляет довольно высокие требования к источникам питания, что затрудняет широкомасштабное производство препарата.

Наиболее близким к предлагаемому (прототипом) можно считать штамм Bacillus thuringiensis Н/14 BTS-393 N В-2547, предназначенный для производства энтомопатогенного препарата бактоларвицит против кровососущих комаров [2]
Штамм обладает высокой токсигенностью в отношении личинок комаров, пригоден для крупномасштабного культивирования, не токсичен для теплокровных животных и человека.

Как и типичные представители вида Васillus thuringiensis, упоминаемый штамм Н/14 BTS-393 N В-2547 спорогенный, и это является его относительным недостатком с точки зрения экологии.

Цель изобретения изыскать штамм Bacillus thuringiensis, coxpaняющий энтомоцидную активность штамма-прототипа, но не являющийся спорогенным.

Поставленная задача была решена в результате поисковой и селекционной работы, завершившейся выделением штамма Bacillus thuringiensis ИПМ-1501, отвечающего поставленным требованиям.

Селекционированный штамм Васillus thuringiensis ИПМ-1501 обладает типичными признаками микроорганизмов этого вида.

Морфологические признаки
Клетки палочковидные, прямые с закругленными концами, подвижные, расположенные одиночно, парами или цепочками, размером 2,0-5,0 х 1,0-1,3 мкм. Кристаллы округлые, неправильной формы, различающиеся по размерам от 0,3 до 1,1 мкм. Граммположительные. Перитрихии. Особенностью является отсутствие спор.

Культуральные и физиолого-биохимические признаки
На мясо-пептонном агаре колонии среднего размера, диаметр колоний достигает 4-12 мм у 5-суточной культуры, пигмента не образует. Край колоний ровный или слегка волнистый, структура мелкоэернистая, внутри вязкой консистенции.

На мясо-пептонном бульоне образует пленку. На коагулированном желтке и на ломтиках картофеля дает рост. Колонии гладкие. Пигмент на ломтиках картофеля не образует.

Молоко коагулирует и пептонизирует без образования пигмента. Слабо образует уреазу на среде с мочевиной. На яично-желтковых средах образует розовый пигмент. Желатину разжижает. Крахмал гидролизует. На средах с казеином образует зоны просветления. Хорошо усваивает глюкозу, мальтозу, маннозу, крахмал. Не использует сахарозу, лактозу, маннит, ксилозу, арабинозу, целлобиозу. Слабо активен в отношении эскулина и не разлагает салицин. Использует пептон, ферментативные и кислотные гидролизаты дрожжей, дрожжевой автолиэат, мясные отвары и бульоны, кукурузные, пшеничные и соевые экстракты.

Штамм выращивают на соево-крахмальной среде, содержащей, мас. соевую муку 3,5; кукурузный крахмал 1,2; зеленую патоку 0,9 по редуцирующим веществам; двузамещенный фосфат калия 0,13; сернокислый магний 0,02; хлористый кальций 0,008; сернокислый марганец 0,008 и водопроводную воду до 100. Значение ph среды до стерилизации составляет 7,7+0.1. Интенсивный рост культуры наблюдается к 12-15 часам культивирования при температуре 29+1^oC. Кристаллообразование отмечается к 19-22 часам и заканчивается к 36-38 часам культивирования. Свободные кристаллы составляют 60-70% от общего количества кристаллов. Споры не образуются.

Штамм хранится на косяках с мясо-пептонным агаром. Лиофилизированную культуру хранят при температуре 3-4^oC. В глицерине культуру хранят при -50^oC. После 12 мес хранения культура сохраняет основные морфолого-культуральные, физиологические и патогенные свойства.

Серологические свойства
Проявляет антигенное родство с сывороткой 14 сероварианта Васillus thuringiensis.

Антагонистические свойства
На личинках комаров Aedes aegypty 11 возраста ЛК-50 составляет не более 0,0008 мг/л.

Продуцирует дельта-эндотоксин и обладает инсектицидной активностью против личинок комаров родов Aedes, Anopheles, Culex.

Штамм депонирован в Коллекции промышленных микроорганизмов Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКМП В-6562.

На основе этого штамма могут быть приготовлены энтомогенные препараты в виде порошков, суспензий, паст или в других препаративных формах.

Сравнительные лабораторные испытания препарата на основе предложенного штамма Bacillus thuringiensis ИПМ-1501 и препарата на основе известного штамма Bacillus thuringiensis Н/14 BTS-393 N В-2547 показали их практически одинаковую эффективность, что следует из следующих данных табл. 1.

Аналогичные результаты были получены и при полевых испытаниях тех же препаратов на рисовых полях в Краснодарском крае, что видно из представленных в табл. 2 данных.

Полученные результаты показывают, что по эффективности предложенный штамм не уступает известному, а некоторые различия в эффективности по срокам лежат в пределах ошибки.

Следующие примеры дополнительно поясняют сущность изобретения.

Пример 1. В качестве посевного материала используют вегетативную культуру Bacillus thuringiensis ИПМ-1501, выращенную в течение 14 ч на мясо-пептонном агаре. Посевным материалом засевают колбы объемом 750 мл воду (до 100). Культивирование проводят в течение 41 ч при температуре 29+1^oC на качалке при 240 об/мин.

LK 50 культуральной жидкости для личинок комаров Aedes aegypti II возраста составляла 0,0004 мл/л.

Пример 2. Культуру Bacillus thuringiensis ИПМ-1501 выращивают в периодическом режиме в ферментере АПК-20. В качестве инокулята используют суспензию вегетативных клеток 12-часовой культуры, выращенных на мясо-пептонном агаре. Культивирование проводят в течение 42 ч на соево-крахмальной среде, описанной в Примере 1, при температуре 29+1^oC при числе оборотов мешалки 300-340 об/мин и при подаче 1 объема воздуха на 1 объем среды в час. Культуральную жидкость подвергают сепарации и получают пасту кремового цвета.

LK 50 полученной пасты для личинок комаров Anopheles messeae II возраста составляла 0,0003 мл/л.

По данным заявителя аспорогенные культуры Bacillus thuringiensis для приготовления биологических средств борьбы с кровососущими комарами ранее не использовались.

Claims

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-6562, предназначенный для получения препарата против личинок кровососущих двукрылых.