RU2045576C1

RU2045576C1 - Method for determining sensitivity of plague inducer to antibiotics

Info

Publication number: RU2045576C1
Authority: RU
Inventors: В.И. Щедрин; Г.И. Лямкин; И.А. Базиков
Original assignee: Щедрин Виталий Иванович; Лямкин Геннадий Иванович; Базиков Игорь Александрович
Priority date: 1991-05-06
Filing date: 1991-05-06
Publication date: 1995-10-10

Abstract

FIELD: medicine, microbiology. SUBSTANCE: tested antibiotics is applied to group of mouse, said antibiotics being not applied to control group. Then all the groups are injected by suspension of native material in physiologic solution, dosage being 0.5-1 ml. Said injection is carried out in back area. Mentioned above suspension is preliminary mixed with yolk at volume ratio 1:1.4 and with 25 mg of polyvinylpirrolidone and with 7 mg of cyclophosphane. Then smear are prepared from the area of injections. After their fixation immunofluorescent analysis is carried out to determine sensitivity to antibiotics. Method may be used if concentration of plague inducer is 10²-10¹ micr. cell/ml. EFFECT: improves efficiency of method. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии. The invention relates to medicine, namely to microbiology.

Известен дискодиффузионный способ определения антибиотикочувствительности возбудителя чумы, который не позволяет получить результаты при исследовании проб с небольшой концентрацией возбудителя и обсемененных посторонней микрофлорой. Known disk diffusion method for determining the antibiotic sensitivity of the plague pathogen, which does not allow to obtain results in the study of samples with a small concentration of the pathogen and seeded with extraneous microflora.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является иммунофлуоресцентный способ экспрессного определения чувствительности к антибиотикам и химио-препаратaм возбудителей опасных инфекционных заболеваний, включающий посев первичного исследуемого материала на пластинки твердой питательной среды, содержащие (опытные) и не содержащие (контрольные) испытуемые антибиотики с последующим термостатированием и изготовлением препаратов-отпечатков для иммунофлуоресцентного исследования. Closest to the proposed invention is an immunofluorescence method for the rapid determination of sensitivity to antibiotics and chemo drugs of pathogens of dangerous infectious diseases, including plating the primary test material on plates of solid nutrient medium containing (experienced) and not containing (control) tested antibiotics, followed by temperature control and manufacture fingerprint preparations for immunofluorescence studies.

Недостатками прототипа являются необходимость для его проведения высокой концентрации микробных клеток в исследуемой пробе (для возбудителя чумы 10⁷ микробных клеток в 1 мл); возможность несовпадения данных по чувствительности микробов к антибиотикам с клиническими наблюдениями, поскольку исследования проводят ин витро; невозможность определения антибиотикочувствительности возбудителей генетически измененных или покрытых оболочкой (инкапсулированных), поскольку они могут не давать роста на искусственных питательных средах.The disadvantages of the prototype are the need for its implementation of a high concentration of microbial cells in the test sample (for the causative agent of the plague 10 ⁷ microbial cells in 1 ml); the possibility of mismatch of data on the sensitivity of microbes to antibiotics with clinical observations, since studies are carried out in vitro; the impossibility of determining the antibiotic sensitivity of pathogens genetically modified or coated (encapsulated), since they may not produce growth on artificial nutrient media.

Целью предлагаемого изобретения является повышение чувствительности способа. The aim of the invention is to increase the sensitivity of the method.

Сущность изобретения состоит в том, что исследование нативного материала осуществляют путем введения опытным белым мышам, обработанным испытуемым антибиотикам в лечебной дозе, и контрольным мышам подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, причем суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в объемном соотношении 1:1,4 с 25 мг поливинилпирролидона и с 7 мг циклофосфана, мазки-отпечатки готовят с места введения, а антибиотикочувствительность определяют по отсутствию возбудителя чумы в мазках-отпечатках опытных мышей при обнаружении его у контрольных. The essence of the invention lies in the fact that the study of native material is carried out by introducing to experimental white mice treated with the tested antibiotic in a therapeutic dose, and to the control mice subcutaneously in the back, 0.5-1 ml of a suspension of the test material in physiological solution, the suspension being pre-mixed with yolk chicken eggs in a volume ratio of 1: 1.4 with 25 mg of polyvinylpyrrolidone and with 7 mg of cyclophosphamide, fingerprint smears are prepared from the injection site, and antibiotic sensitivity is determined by the absence of excitation A plague in smears of mice experienced when it detects it in control.

Отличительные признаки заключаются в том, что исследование нативного материала осуществляют путем введения опытным белым мышам, обработанным испытуемым антибиотикам в лечебной дозе, и контрольным мышам подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, причем суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в объемном соотношении 1: 1,4 с 25 мг поливинилпирролидона и с 7 мг циклофосфана, мазки-отпечатки готовят с места введения, а антибиотикочувствительность определяют по отсутствию возбудителя чумы в мазках-отпечатках опытных мышей при обнаружении его у контрольных. Distinctive features are that the study of the native material is carried out by introducing experimental white mice treated with the tested antibiotics in a therapeutic dose and control mice subcutaneously in the back region of 0.5-1 ml of a suspension of the test material in physiological solution, and the suspension is pre-mixed with yolk chicken eggs in a volume ratio of 1: 1.4 with 25 mg of polyvinylpyrrolidone and with 7 mg of cyclophosphamide, fingerprint smears are prepared from the injection site, and antibiotic sensitivity is determined by the absence of causative agent of the plague in smears, fingerprints of experimental mice when it is detected in the control.

Изобретение осуществляется следующим образом. The invention is as follows.

Испытуемый антибиотик вводят по схеме лечения больных бубонной формой чумы 3 опытным белым мышам в лечебной дозе, рассчитанной для этих животных. Трем контрольным мышам антибиотик не вводят. Исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:1,4. К полученной смеси добавляют поливинилпирролидон и циклофосфан из расчета 25 и 7 мг соответственно на одно животное. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят подкожно в область спины 6 указанным белым мышам, начиная с контрольных. The test antibiotic is administered according to the treatment regimen for patients with a bubonic form of plague to 3 experimental white mice in a therapeutic dose calculated for these animals. Three control mice are not given an antibiotic. The test material in an amount of 0.5-1 ml is mixed with the yolk of a chicken egg in a ratio of 1: 1.4. Polyvinylpyrrolidone and cyclophosphamide are added to the resulting mixture at the rate of 25 and 7 mg per animal, respectively. The resulting suspension is drawn into a syringe and injected subcutaneously into the back 6 of the indicated white mice, starting from the control.

По одному животному из контрольной и опытных групп вскрывают через 8,24,48 ч после введения исследуемого материала. Грызунов умерщвляют одним из известных способов и прикрепляют к вскрывочной доске спиной кверху. Отсепаровывают кожу спины и кожный лоскут отбрасывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживают место введения, мазки-отпечатки которого фиксируют в хлороформе в течение 10-20 мин и окрашивают по Граму и чумной люминесцирующей сывороткой. One animal from the control and experimental groups is opened 8.24.48 hours after administration of the test material. Rodents are killed by one of the known methods and attached to the cutting board with their backs up. Separate the skin of the back and skin flap discarded on the head of the rodent. In this case, the injection site is easily detected, the smears of which are fixed in chloroform for 10-20 minutes and stained with Gram and plague luminescent serum.

Обнаружение возбудителя чумы в какой-либо из указанных сроков у контрольных животных при отсутствии его у опытных свидетельствует об эффективности испытуемого антибиотика. При неэффективности антибиотика возбудитель чумы обнаруживают как в контроле, так и в опыте. Detection of the causative agent of the plague in any of the indicated periods in the control animals in the absence of it in the experimental animals indicates the effectiveness of the tested antibiotic. If the antibiotic is ineffective, the plague pathogen is detected both in the control and in the experiment.

Результаты приведены в таблице. The results are shown in the table.

При определении чувствительности возбудителя чумы в дозе от 10¹ до 10⁹ м.кл./мл к каждому из испытанных антибиотиков установлено, что для известного способа пороговая концентрация составляет 10⁷ м.кл./мл, предлагаемым же методом эффективность антибиотиков можно установить при всех указанных концентрациях (10¹-10⁹), при этом сроки выдачи результатов могут колебаться от 8 до 48 ч (в зависимости от дозы возбудителя в 1 мл).When determining the sensitivity of the causative agent of the plague at a dose of 10 ¹ to 10 ⁹ μl / ml for each of the tested antibiotics, it was found that for the known method the threshold concentration is 10 ⁷ μl / ml, the proposed method can be used to determine the effectiveness of antibiotics all these concentrations (10 ¹ -10 ⁹ ), while the timing of the results can vary from 8 to 48 hours (depending on the dose of the pathogen in 1 ml).

Использование предлагаемого способа, в частности введение исследуемого материала биопробным мышам вместе с желтком куриного яйца, поливинилпирролидоном и циклофосфаном вызывает задержку, размножение и накопление микробных клеток чумы в первые двое суток только на месте введения, что облегчает поиск возбудителя. При этом создаются оптимальные условия для размножения возбудителя чумы и интенсивного синтеза видоспецифического антигена-фракции I, резко повышается чувствительность биологического метода. Так, иммунофлуоресцентным методом чумной микроб при его концентрации 10⁹-10⁷ в 1 мл может быть обнаружен через 6-8 ч, а при концентрации 10⁶-10² и 10¹ соответственно через 24 и 48 ч. Такая высокая чувствительность помимо того, что дает возможность проводить индикацию, позволяет определять антибиотикочувствительность возбудителя чумы в живом организме (ин виво). При этом при больших концентрациях (10⁹-10⁷) результат можно получить уже через 6-8 ч (экспрессное определение). Применение предлагаемого способа позволяет проводить экспрессное определение антибиотикочувствительности возбудителя чумы при его минимальной (10²-10¹ м.кл./мл) концентрации в исследуемом нативном материале; исключает несовпадение данных по чувствительности микробов чумы к антибиотикам с клиническими наблюдениями, поскольку исследования проводят ин виво; дает возможность определения антибиотикочувствительности возбудителей генетически измененных или покрытых оболочкой (инкапсулированных), которые могут не расти на искусственных питательных средах и поэтому их чувствительность к антибиотикам не может быть определена в опытах ин витро.Using the proposed method, in particular, the introduction of the test material to the test mice along with the yolk of a chicken egg, polyvinylpyrrolidone and cyclophosphamide causes a delay, reproduction and accumulation of plague microbial cells in the first two days only at the injection site, which facilitates the search for the pathogen. At the same time, optimal conditions are created for the propagation of the plague pathogen and intensive synthesis of the species-specific antigen-fraction I, and the sensitivity of the biological method sharply increases. Thus, using the immunofluorescence method, a plague microbe at a concentration of 10 ⁹ -10 ⁷ in 1 ml can be detected after 6-8 hours, and at a concentration of 10 ⁶ -10 ² and 10 ^1, respectively, after 24 and 48 hours. Such high sensitivity, in addition to which makes it possible to carry out an indication, allows one to determine the antibiotic sensitivity of the plague pathogen in a living organism (in vivo). Moreover, at high concentrations (10 ⁹ -10 ⁷ ), the result can be obtained after 6-8 hours (rapid determination). The application of the proposed method allows for the rapid determination of the antibiotic sensitivity of the plague pathogen at its minimum (10 ² -10 ¹ μl / ml) concentration in the studied native material; eliminates the inconsistency of data on the sensitivity of plague microbes to antibiotics with clinical observations, since studies are conducted in vivo; makes it possible to determine the antibiotic sensitivity of pathogens genetically modified or coated (encapsulated), which may not grow on artificial nutrient media and therefore their sensitivity to antibiotics cannot be determined in vitro experiments.

Claims

METHOD FOR DETERMINING ANTIBIOTIC SENSITIVITY OF A PLAGUUM Causal Agent, including the study of native material, the manufacture and fixation of fingerprint smears, followed by immunofluorescence analysis, characterized in that, in order to increase the sensitivity of the method, the study of the native material is carried out by introducing an experienced white mouse treated with an antibiotic to the test patient , and control mice subcutaneously in the back region of 0.5 to 1.0 ml of a suspension of the test material in physiological saline, and the suspension redvaritelno mixed with egg yolk in a ratio of 1 to 1.4 mg of polyvinylpyrrolidone 25, and 7 mg of cyclophosphamide, smears are prepared from the injection site, and antibiotic sensitivity is determined by the absence of pathogen in the swine smears mice experienced when detecting it in the controls.