RU2036649C1

RU2036649C1 - Method for manufacture of lydasa

Info

Publication number: RU2036649C1
Authority: RU
Inventors: Леонид Мендельевич Эпштейн; Николай Николаевич Ковалев; Анатолий Григорьевич Фарцейгер
Original assignee: Леонид Мендельевич Эпштейн; Николай Николаевич Ковалев; Анатолий Григорьевич Фарцейгер
Priority date: 1991-12-24
Filing date: 1991-12-24
Publication date: 1995-06-09

Abstract

FIELD: pharmaceutical industry. SUBSTANCE: essence of this method resides in that frozen reproductive tissue of commercial fish species such as Salmonidae, Gadidae and Carandidae and that of walrus, seal, akiba, sea hare, fur seal, common seal, and ringed seal) is comminuted, extracted in 1.5 to 2.0 volumes of 0.1n acetic acid during 4 h at temperature of 4 to 10 C, and ballast products are separated. Further steps are ultrafiltration to step up specific activity of hyaluronidase 1.5 to 2.0 times, as compared with that of stock, sterile filtration of concentrate, bottling at dosage of 64 specific units, and sublimation. EFFECT: ecologically safe manufacture, more extensive stock base, higher yield of end product, and greater specific activity of desired product with lower net cost.

Description

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине для получения препарата, обладающего гиалуронидазной активностью. The invention relates to the pharmaceutical industry and can be used in medicine to obtain a drug having hyaluronidase activity.

Известен способ получения гиалуронидазы, имеющей широкий спектр применения в тех случаях, когда необходимо разрушить шалуроновую кислоту, из сырья, например пиявки Gaffaio luches. Полученный таким образом препарат может применяться для лечения глаукомы. Он стабилен при высоких температурах и экстремальных значениях рН. Недостаток способа заключается в отсутствии сырья (этого вида свободно живущих пиявок) на территории нашей страны. A known method of producing hyaluronidase, which has a wide range of applications in cases where it is necessary to destroy chaluronic acid, from raw materials, such as leeches Gaffaio luches. Thus obtained drug can be used to treat glaucoma. It is stable at high temperatures and extreme pH. The disadvantage of this method is the lack of raw materials (this type of free-living leeches) in our country.

Известен способ получения лидазы, согласно которому замороженные семенники половозрелых быков измельчают, измельченную массу дефрастируют, добавляют раствор 12%-ной уксусной кислоты из расчета 100 мл на 1 кг сырья. Автолиз проводят в течение 18-20 ч при рН 4,5-4,6, при температуре 39-40^оС, после чего жидкую фракцию отделяют, стерилизуют путем фильтрации через фильтр типа Зейтца. Профильтрованный лизат охлаждают до температуры 1-3^оС и вливают в 4 объема ацетона с той же температурой, отстаивают 3-5 ч на холоду и жидкий слой отделяют. Осадок гиалуронидазы растворяют в дистиллированной воде, охлажденной до 2-3^оС из расчета 300 мл на 1 л исходного лизата. Раствор передают на стерильную фильтрацию, разливают во флаконы, сушат сублимационной сушкой. Недостаток способа высокая температура экстракции, что в сочетании с высокой концентрацией кислоты приводит к высокому выходу в раствор балластных белков и как следствие низкий выход по удельной активности конечного продукта (на мг/белка).A known method of producing lidase, according to which the frozen testes of mature bulls are crushed, the crushed mass is defrasted, a solution of 12% acetic acid is added at the rate of 100 ml per 1 kg of raw material. Autolysis is carried out for 18-20 hours at pH 4.5-4.6, at a temperature of 39-40 ^{° C,} after which the liquid fraction is separated and sterilized by filtration through a Seitz filter type. The filtered lysate was cooled to 1-3 ^{° C} and poured into a 4 volume of acetone at the same temperature, settled for 3-5 hours in the cold and the liquid layer was separated. The hyaluronidase precipitate is dissolved in distilled water, cooled to 2-3 ^° C at the rate of 300 ml per 1 liter of the initial lysate. The solution is transferred to sterile filtration, poured into vials, freeze-dried. The disadvantage of this method is the high extraction temperature, which in combination with a high acid concentration leads to a high yield of ballast proteins in the solution and, as a result, a low yield in specific activity of the final product (per mg / protein).

Наиболее близким по техническому решению является способ получения лидазы, включающий измельчение семенников половозрелых быков, экстракцию в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 4 ч при температуре 4-10^оС, фильтрование, осаждение сырца лидазы 99%-ным ацетоном из расчета 4 объема ацетона на 1 объем экстракта при температуре не выше 0^оС, перемешивание и отстаивание в течение не менее 4 ч при температуре не выше 5^оС, отделение осадка, растворение осадка в воде из расчета 200-250 мл на 1 кг исходного сырья, фильтрацию, переосаждение лидазы 99%-ным ацетоном из расчета 6 объемов ацетона на 1 объем фильтрата при температуре 0^оС, отстаивания в течение 4 ч при температуре не выше 5^оС, промывки 99%-ным ацетоном при температуре 0^оС, сушку, стерильный розлив во флаконы и сублимационную сушку конечного продукта. Недостатком этого способа является низкая активность исходного сырья 140000 у.е. в 1 кг, вследствие чего высокая себестоимость конечного продукта, большие затраты ацетона, вредность производства, низкий выход (по активности) конечного продукта.Closest to the technical solution is a method of producing lidase, including grinding the testes of mature bulls, extraction in 1.5-2.0 volumes of 0.1 N. acetic acid for 4 hours at a temperature of 4-10 ^{° C,} filtering, precipitation raw lidazy 99% acetone at 4 volume of acetone to 1 volume of extract at a temperature not higher than 0 ° ^C, stirring and sedimentation for at least 4 hours at a temperature of not higher than 5 ^{° C,} separating the precipitate, dissolving the precipitate in water at the rate of 200-250 ml per 1 kg of feedstock, filtering, reprecipitation lidazy 99% acetone at the rate of 6 volumes of acetone to 1 volume of the filtrate at ⁰ ° C , standing for 4 hours at a temperature of not higher than 5 ^{° C,} washing with 99% acetone n When a temperature of 0 ° ^C, drying, filling into sterile vials and freeze drying the final product. The disadvantage of this method is the low activity of the feedstock 140,000 cu in 1 kg, as a result of which the high cost of the final product, high costs of acetone, the harmfulness of production, low yield (activity) of the final product.

Задача, решаемая изобретением расширение сырьевой базы, создание экологически чистого производства, снижение себестоимости, повышение выхода и увеличение удельной активности конечного продукта. The problem solved by the invention is the expansion of the raw material base, the creation of environmentally friendly production, cost reduction, increased output and increased specific activity of the final product.

Сущность способа заключается в следующем: замороженную репродуктивную ткань (молоки рыб, гонады гребешка, яичники и семенники моржа, ларги и т.д.) измельчают, экстрагируют в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 4 ч при температуре 4-10^оС, отделяют балластные вещества, проводят ультрафильтрацию до увеличения удельной активности гиалуронидазы в 1,5-12 раз по сравнению с сырьевым, после чего концентрат стерильно фильтруют, разливают во флаконы (ампулы) из расчета 64 у.е. на флакон, сублимируют.The essence of the method is as follows: frozen reproductive tissue (milk of fish, scallop gonad, ovaries and testes of walrus, cows, etc.) is crushed, extracted in 1.5-2.0 volumes of 0.1 N. acetic acid for 4 hours at a temperature of 4-10 ^{° C,} separated ballast substances, ultrafiltration is carried out to increase the specific activity of hyaluronidase in 1.5-12-fold compared with the feed, the concentrate is sterile filtered, dispensed into vials (vials) of calculation 64 c.u. on the bottle, sublimate.

П р и м е р 1. В качестве сырья берется репродуктивная ткань рыб. 1 кг мороженных молок кеты измельчают на волчке. К измельченным молокам добавляют 1,5 л 0,1 н. (0,06% ) раствора уксусной кислоты. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании при температуре 8^оС в течение 4 ч. По окончании экстракции определяют активность гиалуронидазы для определения исходной активности сырья, которая равняется 32 у.е. Гомогенат для отделения балластных веществ фильтруют на нутч-фильтре через бязь. Фильтрат собирают в мерники. Полученный объем фильтрата равен 2,6 л. Фильтрат подвергают ультрафильтрации на волоконных фильтрах с диаметром пор 10-25 кД. Концентрат собирают в мерники (полученный объем 600 мл) и определяют активность гиалуронидазы (она равна 132 у.е.), затем стерильно фильтруют, разливают во флаконы из расчета 64 у.е. на флакон и сублимируют.PRI me R 1. As a raw material is taken the reproductive tissue of fish. 1 kg of frozen milk of chum salmon is ground in a spinning top. To the crushed milk add 1.5 l of 0.1 N. (0.06%) acetic acid solution. Extraction was carried out with constant stirring at a temperature of 8 ^{° C} for 4 hours. After extraction determine hyaluronidase activity to determine the activity of the original raw material, which is 32 cu The homogenate for separation of ballast substances is filtered on a suction filter through calico. The filtrate is collected in measuring tanks. The resulting filtrate volume is 2.6 liters. The filtrate is subjected to ultrafiltration on fiber filters with a pore diameter of 10-25 kD. The concentrate is collected in measuring tanks (the resulting volume of 600 ml) and the hyaluronidase activity is determined (it is equal to 132 c.u.), then it is sterilely filtered, poured into vials at the rate of 64 c.u. on the bottle and sublimate.

Таким образом, в предлагаемом способе исключены стадии производственного процесса, в которых используется ацетон; снижена себестоимость конечного продукта за счет использования более дешевого сырья с более высокой ферментативной активностью; выход по сравнению с прототипом увеличен в 3,5 раза (по прототипу и из 1 кг сырья получен выход 35.000 у.е. фермента, а из молок 118.000 у.е), а также увеличена удельная активность в 3,0 раза за счет использования нового вида сырья и введения ультрафильтрации вместо осаждения ацетоном. Thus, in the proposed method eliminated the stages of the production process in which acetone is used; the cost of the final product is reduced due to the use of cheaper raw materials with higher enzymatic activity; the yield compared to the prototype increased by 3.5 times (according to the prototype and from 1 kg of raw material, the yield of 35,000 cu of the enzyme was obtained, and from milk 118,000 cu), and the specific activity was increased by 3.0 times due to the use of a new type of raw material and the introduction of ultrafiltration instead of precipitation with acetone.

П р и м е р 2. Все операции по получению гиалуронидазы такие же, как и в примере 1. В качестве сырья используют семенники половозрелых моржей, ферментативная активность которых равна 64 у.е. После ультрафильтрации получен продукт с активностью 250 у. е. Выход по сравнению с прототипом выше в 2 раза, по удельной активности в 4 раза. PRI me R 2. All operations to obtain hyaluronidase are the same as in example 1. As a raw material, the seeds of mature walruses are used, the enzymatic activity of which is 64 cu After ultrafiltration, a product with an activity of 250 у was obtained. e. The yield compared to the prototype is 2 times higher, in specific activity 4 times.

П р и м е р 3. Все операции по получению гиалуронидазы, как в примере 1. В качестве сырья используют яичники тюленя с ферментативной активностью равной 128 у. е. Полученный после ультрафильтрации продукт имеет удельную активность 500 у.е. Выход по сравнению с прототипом увеличился в 1,5 раза, по удельной активности в 8 раз. Таким образом, предлагаемый способ позволяет решить проблему сырья для производства гиалуронидазы. Так как используются отходы от переработки промысловых рыб семейств Salmonidae, Gadidae, а также отходы от переработки морзверя: моржа, ларги, акибы, лахтака, морского котика, тюленя, нерпы, белухи, серого кита, кашалота. Предложенное изменение технологии позволяет создать экологически чистое производство, повысить выход и увеличить удельную активность конечного продукта. PRI me R 3. All operations to obtain hyaluronidase, as in example 1. As a raw material using ovaries of a seal with enzymatic activity equal to 128 at. e. The product obtained after ultrafiltration has a specific activity of 500 cu The output compared to the prototype increased by 1.5 times, in specific activity by 8 times. Thus, the proposed method allows to solve the problem of raw materials for the production of hyaluronidase. Since waste from the processing of commercial fish of the Salmonidae, Gadidae families is used, as well as waste from the processing of sea animals: walrus, largha, akiba, lahtak, fur seal, seal, seal, beluga whale, gray whale, and sperm whale. The proposed change in technology allows you to create environmentally friendly production, increase output and increase the specific activity of the final product.

Claims

METHOD FOR PRODUCING LIDASE from animal reproductive tissue, including purification of raw materials, grinding, extraction with an aqueous acid solution, filtration followed by sterile filtration of the target product and drying, characterized in that the reproductive tissue of aquatic organisms and marine mammals is used as raw material, and after separation of ballast substances the extract is subjected to ultrafiltration and concentrated to an increase in specific activity of 1.5 to 12.0 times compared with activity in the feedstock.