RU2032908C1

RU2032908C1 - Устройство для определения биологически активных соединений в биологических жидкостях и способ изготовления чувствительного элемента

Info

Publication number: RU2032908C1
Authority: RU
Inventors: С.В. Каспаров; Д.А. Фармаковский; А.А. Харламов; А.У. Дамирян; В.В. Ремень
Original assignee: Институт геохимии и аналитической химии им.В.И.Вернадского РАН
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1991-04-26
Publication date: 1995-04-10
Also published as: WO1992019959A1

Abstract

Использование: в медицинской биохимии. Сущность изобретения: устройство для определения биологически активных соединений в биологических жидкостях содержит рабочий элемент 1, который состоит из подложки 2, рабочего электрода 3, электрода 4 сравнения и вспомогательного электрода 5. На рабочем электроде 3 расположена пленка электропроводящего полимера, которая связана с биорецепторами, при этом на свободный от биорецепторов 7 поверхности пленки расположен блокирующий агент. Кроме того, устройство имеет блок управления, который состоит из усилителя 10, аналого-цифрового преобразователя 11, управляемого источника 12 тока и программируемого контроллера 13. Данное устройство обеспечивает повышение точности определения. Способ изготовления чувствительного рабочего элемента. Заключается в изготовлении подложки 2 из инертного материала, вспомогательного электрода 5 и рабочего электрода 3 путем нанесения на наружную поверхность подложки 2 слоя металла, последующего изготовления электрода 4 сравнения, нанесения на поверхность рабочего электрода 3 пленки полимерного покрытия, включения в пленку соответствующих биорецепторов и обработки пленки для придания заданных электрохимических и механических свойств. Данный способ обеспечивает расширение функциональных возможностей рабочего элемента, повышение точности определения и уменьшение времени анализа. 2 с. и 20 з.п. ф-лы, 9 ил.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к способам физиологических и лабораторных исследований, проводимых с целью диагностики, и к устройствам для их осуществления.

Известно устройство для определения биологически активных соединений в биологических жидкостях, содержащее чувствительный рабочий элемент (биосенсор) и регистрирующее устройство (потенциометр), при этом чувствительный рабочий элемент содержит рабочий электрод и электрод сравнения, биорецепторную искусственную мембрану в виде пленки электропроводящего полимер, расположенной на рабочем электроде, биорецепторы, связанные с пленкой, и блокирующее покрытие, расположенное на свободной от биорецепторов наружной поверхности пленки. Недостатком известного устройства являются: низкая точность проведения определений биологически активных соединений в анализируемой жидкости из-за отсутствия блока управления процесса определения и вспомогательного электрода, которые необходимы для получения объективных данных о наличии тех или иных компонентов в анализируемом объеме жидкости; низкая чувствительность определения, которая составляет всего 1,0˙10^-4 мг/мл; длительность процесса проведения всего цикла определения 20 мин.

Целью изобретения является повышение точности определения биологически активных соединений и уменьшение времени анализа.

Поставленная цель достигается тем, что устройство дополнительно снабжено подложкой произвольной формы и вспомогательным электродом, при этом рабочий и вспомогательный электроды расположены на подложке, имеют планарную форму и представляют собой нанесенные на подложку слои металла, а также блоком управления, состоящим из усилителя, аналого-цифрового преобразователя, управляемого источника тока и программируемого контроллера, при этом электрод сравнения связан с входом усилителя, выход которого связан с входом аналого-цифрового преобразователя, а выход преобразователя с входами контроллера, выходы которого в свою очередь соединены с входами регистрирующего устройства и с входом источника тока, а выход источника тока связан с рабочим электродом и со вспомогательным электродом.

На фиг. 1 изображено заявленное устройство; на фиг. 2 чувствительный рабочий элемент с электродом сравнения, расположенным на подложке; на фиг. 3 продольное сечение А-А рабочего элемента с расположением биорецептора на поверхности пленки; на фиг. 4 то же, с расположением биорецептора в толще пленки; на фиг. 5 алгоритм работы устройства; на фиг. 6 временная диаграмма работы устройства.

Устройство для определения биологически активных соединений в биологических жидкостях содержит чувствительный рабочий элемент 1, который состоит из подложки 2, рабочего электрода 3, электрода сравнения 4 и вспомогательного электрода 5. На рабочем электроде 3 расположена биорецепторная искусственная мембрана в виде пленки 6 электропроводящего полимера, которая связана с биорецепторами 7, которые являются элементами конструкции и которые могут находиться как на поверхности пленки 6 (см. фиг. 3), так и в толще пленки 6 (см. фиг. 4). На свободной от биорецепторов 7 поверхности пленки 6 расположено блокирующее покрытие 8. Оно используется только в тех случаях, когда биорецепторы расположены на наружной поверхности пленки 6 (см. фиг. 3). Кроме того, между поверхностью подложки 2 и электродами 3, 5 может быть нанесен подслой 9 неблагородного металла, например титан, никель, хром и т.д.

Устройство также имеет блок управления, который состоит из усилителя 10, аналого-цифрового преобразователя 11, управляемого источника 12 тока и программируемого контроллера 13, при этом электрод 4 сравнения связан с входом усилителя 10, выход которого связан с входом аналого-цифрового преобразователя 11, а выход преобразователя 11 с входом контроллера 13, выход которого в свою очередь соединен с входом регистрирующего устройства 14 и с входом источника 12 тока, а выход источника 12 тока связан с рабочим электродом 3 и со вспомогательным электродом 5. Наличие каждого отдельного блока известно в науке и технике.

Подложка 2 может быть выполнена из инертного диэлектрического материала, например ситалла или окиси кремния, а рабочий электрод 3 и вспомогательный электрод 5 могут быть выполнены из золота. Электрод 4 сравнения выполняют обычно из серебра, который покрывают слоем хлорида серебра. Подложка 2 может иметь произвольную форму, например форму прямоугольной пластины или форму диска. Как один из вариантов возможного выполнения формы электродов рабочий электрод 3 и вспомогательный электрод 5 могут иметь на свободном от соединения концах гребенчатое утолщение, при этом каждый гребень 15 вспомогательного электрода 5 размещен с зазором между двумя соседними гребнями 16 рабочего электрода 3. В том случае, когда электрод 4 сравнения размещен на подложке 2, он обычно размещается между электродами 3 и 5 и имеет ответвления 17, расположенные перпендикулярно его оси и направленные в противоположные стороны, при этом каждое ответвление 17 электрода 4 сравнения размещено с зазором между соседними гребнями рабочего 3 и вспомогательного электрода 5. Электрод 4 сравнения также может располагаться вне подложки 2 в непосредственной близости от нее.

В качестве пленки 6 токопроводящего полимера может использоваться или полипиррол, или политиофен, а в качестве биорецепторов 7 используют ферменты, антигены, антитела, вирусы, молекулы ДНК и т.д. В качестве блокирующего покрытия 8 могут быть использованы детергенты, бычий сывороточный альбумин, альбумин из сыворотки человека, денатурированная неспецифическая ДНК. Важно отметить, что наличие биорецепторов 7 и блокирующего покрытия в пленке 6 являются неотъемлемой частью устройства, так как они очень долгое время находятся в пленке без потери своих характеристик. В качестве регистрирующего устройства 14 можно использовать различные приспособления, например цифровые, световые, звуковые индикаторы и т.д.

Устройство используется следующим образом. При приведении рабочего чувствительного элемента 1 с электродами 3, 4, 5 в контакт с анализируемой жидкостью происходит "опознавание" определяемого вещества в присутствии других веществ. Протекающий на биорецепторе 7 процесс может сопровождаться изменением ряда электрохимических характеристик электродов (электрического потенциала, проводимости, емкости и т.д.), которое может быть установлено с помощью регистрирующего устройства 14. По величине и характеру этого изменения делается вывод о наличии или отсутствии определяемого вещества в исследуемом образце и его количественном содержании. Далее приводится подробное описание определения. Процесс измерения проводится импульсом гальваностатическом режиме.

При этом регистрируется изменение разности потенциалов между рабочим электродом 3 и электродом 4 сравнения при специфическом взаимодействии биорецептора 7, иммобилизованного на поверхности рабочего электрода 3 при помощи электропроводящей полимерной пленки 6 с определяемым соединением из анализируемой жидкости. Воздействие биорецептора 7 со специфичным к нему соединением в исследуемом растворе, а также взаимодействие мешающих компонентов раствора с поверхностью пленки 6 сопровождается изменением электрохимических параметров рабочего электрода 3 (емкости двойного электрического слоя, заряда на поверхности электрода). Регистрация изменения этих всех параметров осуществляется методом кривых заряжения, который основан на регистрации зависимости U U(t),
где U потенциал рабочего электрода 3, при импульсном включении тока между рабочим 3 и вспомогательным 5 электродами и последующей его фиксации (I const). Кривая U(t) отражает все электрохимические процессы, протекающие на рабочем электроде 3.

Метод регистрации биореакции на поверхности электрода 4 основан на определении меры близости кривой заряжения, полученной в ходе анализа U(t) с эталонными кривыми U₀(t) и U₁(t), где U₀(t) кривая заряжения рабочего электрода 4 в пробе, не содержащей определяемого соединения, а U₁(t) кривая заряжения рабочего электрода 3 в пробе, содержащей определяемое соединение. Мера близости кривых U(t), U₀(t) и U₁(t) может быть установлена при помощи вычисления значения ряда формальных параметров.

Принципиальная схема измерения.

Структурная схема управляющего и регистрирующего устройства для проведения импульсных гальваностатических измерений с использованием трехэлектродного измерительного чувствительного элемента представлен на фиг. 1. В схеме устройства используется управляемый источник 12 тока, включенный между рабочим электродом 3 и вспомогательным электродом 5. Напряжение, возникающее между рабочим электродом 3 и электродом 4 сравнения через буферный усилитель 10 подается на вход аналого-цифрового преобразователя 11. Программируемый контроллер 13 обеспечивает управление источником 12 тока и принимает данные аналого-цифрового преобразователя, производит обработку результатов измерения и обеспечивает отображение полученной информации на регистрирующем устройстве 14 дисплее.

П р и м е р 1. В фосфатный буферный регистр, содержащий глюкозооксидазу в концентрации 360 U/мл вводили предварительно очищенный пиррол до концентрации 0,3 моль/л и хлористый натрий 0,15 моль/л. Полученный раствор гомогенизировали перемешиванием на магнитной мешалке в течение 15 мин. В трехэлектродную ячейку из органического стекла, заполненную приготовленным раствором помещали планарную структуру, представляющую собой золотые рабочий 3 и вспомогательный 5 электроды, выполненные гребенчатой формы с расстоянием между гребенками 15 и гребенками 16 около 300 мкм. Толщина золотых электродов составляла 100 мкм. В качестве протвоэлектрода использовали платиновую проволоку.

Совместную электрохимическую полимеризацию пиррола и глюкозооксидазы проводили в гальваностатичеком режиме. Электроосаждение вели на рабочий электрод 3. Полученный электрод с пленкой 6 помещали в фосфатно-солевой буфер, не содержащий пиррола и глюкозооксидазы, и потенциостатировали при потенциале 0,7 В до стабилизации фонового тока электрода. Затем электрод промывали, высушивали и хранили при 4^оС в сухом виде. Приготовленный таким образом чувствительный рабочий элемент 1 использовали для измерений содержания глюкозы. Результаты определения выводятся на регистрирующее устройство 14 по указанной схеме.

На фиг. 7 представлены результаты измерения содержания глюкозы в фосфатно-солевом буферном растворе в том виде, в котором они выводятся на регистрирующее устройство 14. Кривая 1 соответствует измерению в чистом буферном растворе, кривая 2 соответствует измерению в растворе, содержащем лактозу в концентрации 1˙10^-6 моль/л, а кривая 3 соответствует измерению в растворе, содержащем глюкозу в концентрации 1˙10^-6 моль/л.

Различия между кривыми 1, 2 и 3 численно оценивали по изменению площади, ограниченной кривой заряжения. Разность между площадями, ограниченными кривыми 1 и 2 составляет 1,05 у.ед. а разность между площадями, ограниченными кривыми 1 и 3 составляет 96,59 у.ед.

П р и м е р 2. В фосфатно-солевой буфер (РВS, 0,003 М КН РО 2H O, 0,02 М NaНРО, 0,15 М NaCl Na вводили предварительно очищенный пиррол до концентрации 0,3 моль/л. Раствор пиррола гомогенизировали обработкой ультразвуком в течение 10 мин. Электрополимеризацию проводили с использованием планарной структуры и электрохимической ячейки, аналогичных описанным в примере 1. Процесс проводили в потенциодинамическом режиме с циклической разверткой потенциала в пределах (-200) (+800) мВ при скорости 100 МВ/с. Потенциал был приложен к рабочему электроду. После трех циклов развертки потенциала процесс завершали. Электрод промывали чистым РВS, переносили в ячейку, содержащую РВS без пиррола, потенциостатировали при потенциале +1В до стабилизации фонового тока электрода и высушивали при комнатной температуре.

Препарат двухнитевой ДНК в водном растворе с концентрацией 1 мг/мл денатурировали кипячением на водяной бане в течение 8 мин и охлаждали до 90^оС в ледяной воде. Каплю этого раствора объемом 20 мкл наносили на рабочий электрод 3 и высушивали при комнатной температуре. Затем проводили фиксацию ДНК на поверхности полимерной пленки нагреванием электрода в термостате до 60^оС в течение 30 мин. Электрод промывали в бидистиллированной воде и высушивали при комнатной температуре. Затем на электрод наносили каплю раствора предварительно денатурированной ДНК из тимуса теленка (концентрация 2 мг/мл), электрод высушивали и проводили фиксацию ДНК на поверхности полимерной пленки нагреванием в термостате при 60^оС в течение 30 мин. Электрод промывали бидистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре.

Полученный сенсор хранили в сухом виде при комнатной температуре и использовали для измерений содержания ДНК, комплементарной к иммобилизованной на поверхности сенсора.

На фиг. 8 приведены результаты измерения содержания ДНК в водном растворе в том виде, в котором они выводятся на регистрирующее устройство 14. Кривая 1 соответствует измерению в бидистиллированной воде. Потенциал рабочего электрода измерялся относительно электрода сравнения 4. После измерения на рабочий электрод наносили 15 мкл раствора, содержащего предварительно денатурированную ДНК, некомплементарную к иммобилизованной на рабочем электроде сенсора (ДНК из тимуса теленка, концентрация 0,2 мг/мл), и инкубировали в таком виде при комнатной температуре. После этого сенсор промывали и проводили измерение в бидистиллированной воде (кривая 2). Неспецифическое взаимодействие молекул ДНК с поверхностью рабочего электрода привело к существенному изменению формы кривой заряжения и смещению потенциала рабочего электрода. Далее на рабочий электрод наносили 15 мкл водного раствора предварительно денатурированной ДНК, комплементарной к ДНК, иммобилизованной на рабочем электроде (концентрация 0,1 мг/мл). Сенсор инкубировали в таком состоянии при комнатной температуре. Затем промывали, так как это было описано выше и проводили измерение в бидистиллированной воде (кривая 3). Специфическое связывание (гибридизация) на поверхности рабочего электрода привело к заметному сдвигу потенциала рабочего электрода (примерно на 80-100 мВ) и существенному изменению формы кривой заряжения. Различия между кривыми 1, 2 и 3 численно оценивали по изменению площади, ограниченной кривой заряжения. Разность между площадями, ограниченными кривыми 1 и 2 составила 90,11 у.е. а разность между площадями, ограниченными кривыми 1 и 3 составила 157,78 у.е.

П р и м е р 3. В раствор для электрохимической полимеризации, описанный в примере 2, вводили глутаровый альдегид до концентрации 10% Планарную золотую структуру с рабочим электродом и ячейку для полимеризации использовали аналогично примеру 1. Электроосаждение пиррола и глутарового альдегида проводили в потенциодинамическом режиме в интервале от (-200) 1200 мАВ при скорости развертки потенциала 100 мВ/c. После потенциостатирования в PBS, не содержащем пиррола, при потенциале -500 мВ до стабилизации фонового тока, электрод помещали в раствор рекомбинантных белков оболочки вируса НIV-1, p24, gp 41 gp120 с суммарной концентрацией 3,5 мг/мл и инкубировали в течение 48 ч при температуре 4^оС. Далее электрод промывали PBS, высушивали и помещали в 0,1 н. раствор NaBH. Инкубацию в растворе NaBH проводили в течение 24 ч при 4^оС. Затем электрод снова промывали РВS и помещали в раствор альбумина из сыворотки человека (НSА) с концентрацией 10 мг/мл на 24 ч. После этого электрод промывали PBS и высушивали при комнатной температуре.

Полученный сенсор хранили в сухом виде при комнатной температуре и использовали для определения содержания антител к вирусу HIV-1 в образцах сывороток крови людей, инфицированных вирусом HIV-1.

На фиг. 9 представлены результаты измерения содержания антител к вирусу НIV-1 в образцах сывороток крови людей, инфицированных к неинфицированных вирусом НIV-1. Измерения проводили в фосфатно-солевом буферном растворе. Потенциал рабочего электрода измерялся относительно электрода сравнения 4. Кривая 1 соответствует фоновому измерению в фосфатно-солевом буфере. После фонового измерения на поверхность рабочего электрода наносили 20 мкл разделенной 1: 2 сыворотки крови, не содержащей антител к вирусу HIV-1 (cыворотка 1) и инкубировали сенсор в таком состоянии при комнатной температуре. После этого сенсор промывали фосфатно-солевым буфером и проводили измерение (кривая 2). После этого измерения на поверхность рабочего электрода наносили 20 мкл разбавленной фосфатно-солевым буфером 1:2, сыворотки крови, содержащей антитела к вирусу HIV-1 (сыворотка 2). После инкубации при комнатной температуре сенсор промывали и проводили измерение (кривая 3). Как видно из фиг. 9 неспецифическое взаимодействие белков сыворотки 1 с поверхностью рабочего электрода практически не привело к изменению потенциала рабочего электрода и к изменению формы кривой заряжения. Специфическое связывание между рекомбинантными белками оболочки вируса НIV-1, иммобилизованными на поверхности рабочего электрода, и антителам к вирусу, содержащимися в сыворотке 2 привело к заметному сдвигу потенциала рабочего электрода и к изменению формы кривой заряжения. Различия между кривыми 1, 2 и 3 численно оценивали по изменению площади, ограниченной ими. Разность между площадями, ограниченными кривыми 1 и 2, составила 24,88 у.е. а разность между площадями, ограниченными кривыми 1 и 3, составила 125.21 у.е.

Таким образом, предложенное устройство обеспечивает сокращение времени определения (до 1-2 мин), повышает точность измерения за счет использования автоматизированной системы управления и регистрации и повышает чувствительность определения (до 1˙10 мг/мл).

Известен способ изготовления чувствительного рабочего элемента, заключающийся в изготовлении рабочего электрода и электрода сравнения, формировании на поверхности рабочего электрода пленки электропроводящего полимера путем электрохимической полимеризации мономера, растворенного в полярном растворителе, включении в пленку необходимого биорецептора и блокировки свободной от биорецептора наружной поверхности пленки. Недостатком известного способа является низкая функциональная возможность изготавливаемого элемента и ограниченная область применения, так как используется при определении только один класс биорецепторов, а именно, иммуноглобулины.

Целью изобретения является расширение области применения рабочего элемента, повышение точности определения и уменьшение времени анализа.

Поставленная цель достигается тем, что перед изготовлением рабочего электрода и электрода сравнения выполняют подложку из инертного материала, после чего изготавливают вспомогательный электрод и рабочий электроды путем нанесения на всю наружную поверхность подложки слоя металла. После этого проводят обработку пленки электропроводящего полимера для придания ей заданных электрохимических и механических свойств. Включение биорецепторов в пленку проводят одновременно с электрохимической полимеризацией мономера или адсорбцией биорецептора на поверхность пленки.

Способ изготовления чувствительного рабочего элемента осуществляется следующим образом. В начальной стадии осуществляют изготовление подложки 2 произвольной формы, например в виде прямоугольной пластины или в виде диска, из инертного диэлектрического материала, например ситалла или окиси кремния, после чего изготавливают вспомогательный электрод 5 и рабочий электрод 3 путем нанесения на наружную поверхность подложки 2 слоя металла, например золота. После этого изготавливают электрод 4 сравнения. После изготовления электродов осуществляют формирование на поверхности рабочего электрода 3 пленки 6 электропроводящего полимера путем электрохимической полимеризации мономера, растворенного в полярном растворителе, а затем включают в пленку 6 соответствующей биорецептор 7 и блокируют свободную от биорецептора наружную поверхность пленки 6. При этом включение в пленку 6 биорецептора 7 осуществляют одновременно с полимеризацией мономера путем добавления в растворитель необходимого биорецептора 7. Кроме того, включение в пленку биорецептора можно осуществить путем адсорбции биологического вещества на поверхность пленки и путем сшивания биорецептора с пленкой при помощи биофункциональных агентов, например глутарового альдегида, глиоксаля или малонового альдегида. В некоторых случаях биорецептор может быть включен в пленку путем инкубации рабочего электрода 3 с пленкой последовательно в растворе сшивающего агента и в растворе биоматериала.

Блокировку свободной поверхности пленки осуществляют путем погружения электрода 3 с пленкой и с биорецептором в раствор блокирующего агента (детергенты, бычий сывороточный альбумин, альбумин из сыворотки человека или денатурированный неспецифический ДНК). Контроль заполнения свободной поверхности пленки осуществляют путем регистрации изменения разности потенциалов между рабочим электродом 3 и электродом 4 сравнения, погруженный в раствор блокирующего агента. Следует также добавить, что электрод 4 сравнения можно изготовить из серебряной проволоки, покрытой слоем хлорида серебра. В качестве электропроводящего покрытия можно использовать полипиррол или политиофен, а толщина золотого покрытия электродов 3 и 5 составляет от 5 нм до 2 мкм.

В качестве полярного растворителя целесообразно использовать ацетонитрил, бензонитрил, тетрагидросульфон, дихлорметан, метанол, водный буферный раствор фосфатно-солевой, ацетатный. Следует отметить, что перед изготовлением электродов на поверхность подложки наносят подслой 9 неблагородного металла, например титана, никеля, кобальта или вольфрама, а перед электрохимической полимеризацией поверхность рабочего электрода обезжиривают.

Электрохимическую полимеризацию пленки на поверхность рабочего электрода проводят в гальваностатическом, потенциостатическом или потенциодинамическом режимах.

В качестве биорецепторов 7 используют ферменты, моноклональные антитела, антигены, белки вирусов, вирусы гепатита Б, вирусы СПИ (HIV-1) или однонитевые молекулы ДНК. Биорецепторы могут размещаться как на наружной поверхности пленки (фиг. 3), так и в ее толще (фиг. 4). Для придания пленке заданных электрохимических и механических свойств, например для увеличения или уменьшения электропроводности и механической прочности, пленку подвергают либо электрохимическому окислению, либо электрохимическому восстановлению.

Таким образом, предложенный способ расширяет функциональные возможности чувствительного рабочего элемента, расширяет область определяемых соединений, а именно можно определять однонитевые молекулы ДНК, сахара, инсулин и т.д. увеличивает точность определения и уменьшает время анализа.

Claims

1. Устройство для определения биологически активных соединений в биологических жидкостях, содержащее чувствительный рабочий блок управления, при этом чувствительный рабочий элемент содержит рабочий электрод и электрод сравнения, биорецепторную искусственную мембрану в виде пленки электропроводящего полимера, расположенной на рабочем электроде, биорецепторы, связанные с пленкой и блокирующее покрытие, расположенное на свободной от биорецепторов наружной стороне пленки, отличающееся тем, что, с целью повышения точности, оно снабжено подложкой и вспомогательным электродом, при этом рабочий и вспомогательный электроды расположены на подложке, имеют планарную форму и представляют собой нанесенные на подложку слои металла, блоком управления, состоящим из усилителя, аналого-цифрового преобразователя, управляемого источника тока и программируемого контроллера, при этом электрод сравнения связан с входом усилителя, выход которого связан с входом аналого-цифрового преобразователя, а выход преобразователя с входом контроллера, выход которого, в свою очередь, соединен с входом регистрирующего устройства и входом источника тока, а выход источника тока связан с рабочим и вспомогательным электродами.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что подложка выполнена из инертного материала, например ситалла.

3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что рабочий и вспомогательный электроды выполнены из золота.

4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что подложка имеет форму прямоугольной пластины.

5. Устройство по п.1, отличающееся тем, что подложка имеет форму диска.

6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что между поверхностью подложки и электродами расположен слой неблагородного металла, например титана, никеля или циркония.

7. Устройство по п.1, отличающееся тем, что рабочий и вспомогательный электроды имеют на своих свободных концах гребенчатое утолщение, при этом каждый гребень вспомогательного электрода размещен с зазором между двумя соседними гребнями рабочего электрода.

8. Устройство по п.1, отличающееся тем, что электрод сравнения размещен на подложке между рабочим и вспомогательным электродами и имеет ответвления, расположенные перпендикулярно его оси и направленные в противоположные стороны, при этом каждое ответвление электрода сравнения размещено с зазором между соседними гребнями рабочего и вспомогательного электродов.

9. Устройство по п.1, отличающееся тем, что электрод сравнения расположен вне плоскости подложки.

10. Устройство по п.1, отличающееся тем, что в качестве биорецепторов используют ферменты, антигены, антитела, вирусы, молекулы ДНК.

11. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве блокирующего покрытия используют детергенты, альбумин из сыворотки человека, денатурированные молекулы неспецифической к биорецептором ДНК.

12. Способ изготовления чувствительного рабочего элемента, заключающийся в изготовлении рабочего электрода и электрода сравнения, формировании на поверхности рабочего электрода пленки электропроводящего полимера в результате электрохимической полимеризации в гальваностатическом режиме, включении в пленку соответствующего биорецептора путем сшивания его с пленкой при помощи бифункциональных агентов и блокировки свободной от биорецептора наружной поверхности пленки, отличающийся тем, что, с целью расширения области применения рабочего элемента, увеличения точности измерения и уменьшения времени анализа, перед изготовлением рабочего электрода и электрода сравнения выполняют подложку из инертного материала, после чего изготавливают вспомогательный электрод путем нанесения на наружную поверхность подложки слоя металла, формирование пленки проводят в потенциостатическом и потенциодинамическом режимах, после нанесения пленки проводят ее обработку для придания ей заданных электрохимических и механических свойств, а включение соответствующих биорецепторов проводят одновременно с электрохимической полимеризацией и путем адсорбции биорецепторов на поверхность пленки.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве блокирующего агента используют детергенты, или бычий сывороточный альбумин, или альбумин из сыворотки человека, или денатурированную неспецифическую ДНК.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что контроль заполнения свободной поверхности плеки осуществляют путем регистрации изменения разности потенциалов между рабочим электродом и электродом сравнения, погруженных в раствор блокирующего агента.

15. Способ по п. 12, отличающийся тем, что рабочий и вспомогательный электроды выполняют из золота.

16. Способ по п. 12, отличающийся тем, что толшина золотого покрытия рабочего и вспомогательного электродов составляет 5 нм 2 мкм.

17. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве инертного материала подложки используют ситалл или окись кремния.

18. Способ по п.12, отличающийся тем, что перед изготовлением электродов на поверхность подложки наносят подслой неблагородного металла, например титана, никеля, кобальта, вольфрама.

19. Способ по п.12, отличающийся тем, что перед электрохимической полимеризацией поверхность рабочего электрода обезжиривают.

20. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве биорецептора используют ферменты, моноклональные антитела, антигены, белки вирусов, вирусы гепатита Б. вирусы СПИД или однонитьевые молекулы ДНК.

21. Способ по п.12, отличающийся тем, что обработку пленки осуществляют путем ее электрохимического окисления.

22. Способ по п.12, отличающийся тем, что обработку пленки осуществляют путем ее электрохимического восстановления.