RU2023100514A - Способы и композиции для увеличения урожайности низкорослых растений путем манипуляции метаболизма гиббереллина - Google Patents

Claims (84)

1. Конструкция рекомбинантной ДНК для совместной супрессии эндогенных генов оксидазы_3 GA20 и оксидазы_5 GA20, содержащая транскрибируемую последовательность ДНК, кодирующую некодирующую молекулу РНК, причем некодирующая молекула РНК содержит нацеливающую последовательность, которая:

(a) по меньшей мере на 80% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам первой молекулы мРНК, кодирующей первый эндогенный белок оксидазы GA в растении кукурузы или растительной клетке, при этом первый эндогенный белок оксидазы GA по меньшей мере на 80% идентичен SEQ ID NO: 9; и

(b) по меньшей мере на 80% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам второй молекулы мРНК, кодирующей второй эндогенный белок оксидазы GA в растении кукурузы или растительной клетке, при этом второй эндогенный белок оксидазы GA по меньшей мере на 80% идентичен SEQ ID NO: 15; и

при этом транскрибируемая последовательность ДНК функционально связана с конститутивным промотоом.

2. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 13 и 14.

3. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая (i) по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам первой молекулы мРНК; и/или (ii) по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам второй молекулы мРНК.

4. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.3, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая (i) по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 7 или 8; и/или (ii) по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 13 или 14.

5. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая на 100% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 13 и 14.

6. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая (i) на 100% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам первой молекулы мРНК; и/или (ii) на 100% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам второй молекулы мРНК.

7. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.5, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая (i) на 100% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 7 или 8; и/или (ii) на 100% комплементарна по меньшей мере 19 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 13 или 14.

8. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 13 и 14.

9. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая (i) по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам первой молекулы мРНК; и/или (ii) по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам второй молекулы мРНК.

10. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.9, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая (i) по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 7 или 8; и/или (ii) по меньшей мере на 90% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 13 или 14.

11. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая на 100% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 13 и 14.

12. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая (i) на 100% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам первой молекулы мРНК; и/или (ii) на 100% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам второй молекулы мРНК.

13. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.12, отличающаяся тем, что нацеливающая последовательность некодирующей молекулы РНК содержит последовательность, которая (i) на 100% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 7 или 8; и/или (ii) на 100% комплементарна по меньшей мере 21 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 13 или 14.

14. Конструкция рекомбинантной ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что конститутивный промотор выбран из группы, состоящей из: промотора актина, промотора 35S или 19S CaMV, растительного промотора убиквитина, растительного промотора Gos2, промотора FMV, промотора CMV, промотора MMV, промотора PCLSV, промотора Emu, промотора тубулина, промотора нопалинсинтазы, промотора октопинсинтазы, промотора маннопинсинтазы или алкогольдегидрогеназы маиса, или их функциональной части.

15. Конструкция рекомбинантной ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что конститутивный промотор содержит последовательность ДНК, которая является, по меньшей мере на 90% идентичной одной или более из SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 или SEQ ID NO: 83, или ее функциональной части.

16. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что некодирующая молекула РНК, кодируемая транскрибируемой последовательностью ДНК, представляет собой предшественника мРНК или миРНК, который процессируется или расщепляется в растительной клетке с образованием зрелой мРНК или миРНК.

17. Конструкция рекомбинантной ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что первый эндогенный белок оксидазы GA20 на 100% идентичен SEQ ID NO: 9, и/или второй эндогенный белок оксидазы GA20 на 100% идентичен SEQ ID NO: 15.

18. Трансгенное растение кукурузы, имеющее уменьшенную высоту растения по сравнению с контрольным растением дикого типа, содержащее конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

19. Часть трансгенного растения кукурузы из трансгенного растения кукурузы по п. 18.

20. Часть трансгенного растения кукурузы по п. 19, отличающееся тем, что часть трансгенного растения кукурузы представляет собой семя.

21. Трансгенная клетка растения кукурузы, имеющая сниженный уровень продукции GA по сравнению с контрольной клеткой растения кукурузы дикого типа, при этом трансгенная клетка растения кукурузы содержит конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

22. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что некодирующая молекула РНК снижает уровни экспрессии молекулы мРНК по меньшей мере в одной ткани трансгенного растения кукурузы по сравнению с контрольным растением, когда некодирующая молекула РНК экспрессируется в трансгенном растении кукурузы.

23. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что экспрессия некодирующей молекулы РНК в трансгенном растении кукурузы снижает уровень одного или более активных GA в трансгенном растении кукурузы, по сравнению с контрольным растением, когда некодирующая молекула РНК экспрессируется в трансгенном растении кукурузы.

24. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что некодирующая молекула РНК снижает уровень экспрессии эндогенного белка оксидазы GA поменьше мере в одной ткани трансгенного растения кукурузы, по сравнению с контрольным растением, когда экспрессируется в трансгенном растении кукурузы.

25. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет меньшую высоту растения по сравнению с контрольным растением.

26. Трансгенное растение кукурузы по п. 25, отличающееся тем, что высота трансгенного растения кукурузы по меньшей мере на 10% ниже, чем у контрольного растения.

27. Трансгенное растение кукурузы по п. 25, отличающееся тем, что высота трансгенного растения кукурузы по меньшей мере на 20% ниже, чем у контрольного растения.

28. Трансгенное растение кукурузы по п. 25, отличающееся тем, что высота трансгенного растения кукурузы по меньшей мере на 30% ниже, чем у контрольного растения.

29. Трансгенное растение кукурузы по п. 25, отличающееся тем, что высота трансгенного растения кукурузы по меньшей мере на 40% ниже, чем у контрольного растения.

30. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет повышенную устойчивость к полеганию по сравнению с контрольным растением.

31. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет уменьшенный излом стебля по сравнению с контрольным растением.

32. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет повышенный индекс сбора урожая по сравнению с контрольным растением.

33. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет более глубокие корни по сравнению с контрольным растением.

34. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет один или более из следующих признаков по сравнению с контрольным растением: увеличенную площадь листа, более раннюю сомкнутость полога, более высокую устьичную проводимость, более низкую высоту початка, повышенное содержание влаги в листве, повышенную устойчивость к засухе и снижение содержания антоцианов или площади антоцианов в листьях.

35. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет один или более из следующих признаков по сравнению с контрольным растением: увеличение массы початка, увеличение урожая, увеличение количества зерна и увеличение массы зерна.

36. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, диаметр стебля трансгенного растения кукурузы в одном или более междоузлиях стебля больше чем диаметр стебля на том же одном или более междоузлиях контрольного растения.

37. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что трансгенное растение кукурузы не имеет каких-либо значительных отклонений в по меньшей мере одном женском органе или початке.

38. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что диаметр стебля трансгенного растения кукурузы в одном или более из первого, второго, третьего и/или четвертого междоузлия ниже початка по меньшей мере на 5% больше, чем у того же междоузлия контрольного растения.

39. Трансгенное растение кукурузы по п. 18, отличающееся тем, что уровень одной или более активных GA в по меньшей мере одной ткани междоузлия стебля трансгенного растения кукурузы ниже, чем в той же ткани междоузлия контрольного растения.

40. Модифицированный продукт растительного происхождения, полученный из трансгенного растения кукурузы по п. 18.

41. Модифицированный продукт растительного происхождения, полученный из части трансгенного растения кукурузы по п. 18.

42. Модифицированный продукт растительного происхождения по п. 41, отличающийся тем, что часть трансгенного растения кукурузы представляет собой семя.

43. Модифицированный продукт растительного происхождения, содержащий конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

44. Композиция, содержащая конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

45. Нежизнеспособная часть растения кукурузы, содержащая конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

46. Модифицированный продукт растительного происхождения, содержащий нежизнеспособную часть растения кукурузы по п. 45.

47. Нерегенерируемая часть растения кукурузы, содержащая конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

48. Модифицированный продукт растительного происхождения, содержащий нерегенерируемую часть растения кукурузы по п. 47.

49. Нежизнеспособная и нерегенерируемая часть растения кукурузы, содержащая конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

50. Модифицированный продукт растительного происхождения, содержащий нежизнеспособную и нерегенерируемую часть растения кукурузы по п. 49.

51. Модифицированный протопласт кукурузы, содержащий конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

52. Модифицированное семя, содержащее конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

53. Вектор для трансформации, содержащий конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

54. Молекула ДНК, содержащая конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 1.

55. Способ получения трансгенного растения кукурузы, включающий: (a) трансформацию по меньшей мере одной клетки эксплантата с помощью конструкции рекомбинантной ДНК по п. 1 для создания трансформированного эксплантата, и (b) регенерацию или развитие трансгенного растения кукурузы из трансформированного эксплантата.

56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что по меньшей мере одна клетка эксплантата трансформирована с помощью опосредованной Agrobacterium трансформации или опосредованной Rhizobium трансформации.

57. Способ по п. 55, отличающийся тем, что по меньшей мере одна клетка эксплантата трансформирована посредством трансформации, опосредованной бомбардировкой частицами, или трансформации, опосредованной бомбардировкой микрочастицами.

58. Способ по п. 55, отличающийся тем, что конструкция рекомбинантной ДНК стабильно интегрирована в геном трансгенного растения кукурузы.

59. Способ по п. 55, отличающийся тем, что по меньшей мере одна клетка эксплантата была подвергнута сайт-направленной интеграции.

60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что сайт-направленная интеграция включает использование сайт-специфической нуклеазы.

61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что сайт-специфическая нуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы c цинковыми пальцами, мегануклеазы, нативной мегануклеазы, TALE-эндонуклеазы и РНК-направленной эндонуклеазы.

62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что РНК-направленная эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из Cas9 и Cpf1.

63. Способ по п. 61, отличающийся тем, что РНК-направленная эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, их гомологов или модифицированных версий.

64. Способ по п. 55, отличающийся тем, что молекула некодирующей РНК снижает уровень экспрессии молекулы мРНК по меньшей мере в одной ткани трансгенного растения кукурузы по сравнению с контрольным растением, когда некодирующая молекула РНК экспрессируется в трансгенном растении кукурузы.

65. Способ по п. 55, отличающийся тем, что экспрессия некодирующей молекулы РНК в трансгенном растении кукурузы снижает уровень одного или более активных GA в трансгенном растении кукурузы, по сравнению с контрольным растением, когда некодирующая молекула РНК экспрессируется в трансгенном растении кукурузы.

66. Способ по п. 55, отличающийся тем, что некодирующая молекула РНК снижает уровень экспрессии эндогенного белка оксидазы GA поменьше мере в одной ткани трансгенного растения кукурузы, по сравнению с контрольным растением, когда экспрессируется в трансгенном растении кукурузы.

67. Способ по п. 55, отличающийся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет меньшую высоту растения по сравнению с контрольным растением.

68. Способ по п. 67, отличающийся тем, что высота трансгенного растения кукурузы по меньшей мере на 10% ниже, чем у контрольного растения.

69. Способ по п. 67, отличающийся тем, что высота трансгенного растения кукурузы по меньшей мере на 20% ниже, чем у контрольного растения.

70. Способ по п. 67, отличающийся тем, что высота трансгенного растения кукурузы по меньшей мере на 30% ниже, чем у контрольного растения.

71. Способ по п. 67, отличающийся тем, что высота трансгенного растения кукурузы по меньшей мере на 40% ниже, чем у контрольного растения.

72. Способ по п. 55, отличающийся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет повышенную устойчивость к полеганию по сравнению с контрольным растением.

73. Способ по п. 55, отличающийся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет уменьшенный излом стебля по сравнению с контрольным растением.

74. Способ по п. 55, отличающийся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет повышенный индекс сбора урожая по сравнению с контрольным растением.

75. Способ по п. 55, отличающийся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет более глубокие корни по сравнению с контрольным растением.

76. Способ по п. 55, отличающийся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет один или более из следующих признаков по сравнению с контрольным растением: увеличенную площадь листа, более раннюю сомкнутость полога, более высокую устьичную проводимость, более низкую высоту початка, повышенное содержание влаги в листве, повышенную устойчивость к засухе и снижение содержания антоцианов или площади антоцианов в листьях.

77. Способ по п. 55, отличающийся тем, что трансгенное растение кукурузы имеет один или более из следующих признаков по сравнению с контрольным растением: увеличение массы початка, увеличение урожая, увеличение количества зерна и увеличение массы зерна.

78. Способ по п. 55, отличающийся тем, что диаметр стебля трансгенного растения кукурузы в одном или более междоузлиях стебля больше чем диаметр стебля на том же одном или более междоузлиях контрольного растения.

79. Способ по п. 55, отличающийся тем, что трансгенное растение кукурузы не имеет каких-либо значительных отклонений в по меньшей мере одном женском органе или початке.

80. Способ по п. 55, отличающийся тем, что диаметр стебля трансгенного растения кукурузы в одном или более из первого, второго, третьего и/или четвертого междоузлия ниже початка по меньшей мере на 5% больше, чем у того же междоузлия контрольного растения.

81. Способ по п. 55, отличающийся тем, что уровень одной или более активных GA в по меньшей мере одной ткани междоузлия стебля трансгенного растения кукурузы ниже, чем в той же ткани междоузлия контрольного растения.