RU2022110804A

RU2022110804A - Производство щелочных фосфатаз

Info

Publication number: RU2022110804A
Application number: RU2022110804A
Authority: RU
Inventors: Пратик ДЖАЛУРИЯ; Сыгуан СУЙ
Original assignee: Алексион Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2022-04-21
Publication date: 2023-10-23

Claims

1. Рекомбинантный полипептид, полученный в культуре клеток млекопитающих, причем рекомбинантный полипептид содержит асфотазу альфа (SEQ ID NO: 1) и имеет по меньшей мере одну характеристику, выбранную из группы, включающей:

a. общее содержание сиаловой кислоты (TSAC) между приблизительно 0,9 до приблизительно 3,5 моль сиаловой кислоты/моль мономера белка;

b. изоэлектрическую фокусировку (IEF) между приблизительно 5,2 и приблизительно 6,7;

c. крупную гликановую структуру, как показано на фиг. 41 или фиг. 42;

d. профиль хроматограммы 2-AB-меченного олигосахарида, как показано на фиг. 38 или фиг. 39;

e. MALDI-ToF фингерпринтный профиль гликопептида, показанный на фиг. 40 или фиг. 44-49;

f. основную полосу на SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, имеющую молекулярную массу приблизительно 88-108 кДа и не менее чем приблизительно 85% от общего количества полученного рекомбинантного полипептида;

g. основную полосу на SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, имеющую молекулярную массу приблизительно 194 кДа до приблизительно 273 кДа и не менее чем приблизительно 85% от общего количества полученного рекомбинантного полипептида;

h. не менее чем приблизительно 95,0% для димеров рекомбинантного полипептида и не более чем приблизительно 5,0% для агрегатов как определено с помощью высокоэффективной жидкостной эксклюзионной хроматографии (ВЭЖХ);

i. чистоту не менее чем приблизительно 95,0% как определено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC);

j. не менее чем приблизительно 90,0% для главного пика, не более чем приблизительно 6,0% для кислотных пиков и не более чем приблизительно 4,0% для основных пиков как определено с помощью анион-обменной хроматографии (AEX);

k. процент связывания гидроксиапатита (НА) от приблизительно 75 до приблизительно 125%;

l. специфическую активность продукта (pNPP) от приблизительно 620 единиц/мг до приблизительно 1250 единиц/мг;

m. K_mот приблизительно 13 мкМ до приблизительно 69 мкМ в анализе гидролиза неорганического пирофосфата (PPi);

n. K_catот приблизительно 65 с^-1 до приблизительно 165 с^-1в анализе гидролиза неорганического пирофосфата (PPi);

o. диапазон pI от приблизительно 6,45 до приблизительно 6,95 для всех пиков при капиллярном электрофорезе;

p. пики на масс-спектре MALDI-TOF, как показано на фиг. 34A после дегликозилирования;

q. пики на масс-спектре MALDI-TOF, как показано на фиг. 34B, после восстановления и дегликозилирования;

r. пики на масс-спектре MALDI-TоF, как показано на фиг. 35;

s. профиль фосфорилирования, как показано на фиг. 36;

t. профиль сиалированного гликана на отрицательном масс-спектре MALDI-TоF, как показано на фиг. 37A;

u. профиль нейтральных гликанов на положительном масс-спектре MALDI-TоF, как показано на фиг. 37B;

v. молярное отношение магния на моль рекомбинантного полипептида от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,15;

w. молярное отношение кальция на моль рекомбинантного полипептида от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,5; и

x. молярное отношение цинка на моль рекомбинантного полипептида от приблизительно 0,5 до приблизительно 3,0.

2. Рекомбинантный полипептид по п. 1, имеющий от приблизительно 0,7 до приблизительно 1,19 свободного цистеина на половину молекулы.

3. Рекомбинантный полипептид по п. 1 или 2, имеющий фосфорилирование на Ser 93 в процентах от приблизительно 13,5% до приблизительно 35,7%.

4. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-3, имеющий не менее чем приблизительно 90,0% главного пика, не более чем приблизительно 6,0% для кислотных пиков и не более чем приблизительно 4,0% для основных пиков на хроматограмме AEX.

5. Рекомбинантный полипептид по п. 4, имеющий главный пик не менее чем приблизительно 93,7%, не более чем приблизительно 4,9% для кислотных пиков и не более чем приблизительно 3,4% для основных пиков на хроматограмме AEX.

6. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-5, имеющий общее содержание сиаловой кислоты (TSAC) между приблизительно 0,9 до приблизительно 3,5 моль сиаловой кислоты/моль мономера белка.

7. Рекомбинантный полипептид по п. 6, имеющий среднее значение общего содержания сиаловой кислоты (TSAC) от приблизительно 1,2 до приблизительно 3,0 моль сиаловой кислоты/моль на мономер.

8. Рекомбинантный полипептид по п. 7, имеющий среднее значение общего содержания сиаловой кислоты (TSAC) от приблизительно 1,9 до приблизительно 2,7 моль сиаловой кислоты/моль на мономер.

9. Рекомбинантный полипептид по п. 8, имеющий среднее значение общего содержания сиаловой кислоты (TSAC) от приблизительно 1,85 до приблизительно 2,28 моль сиаловой кислоты/моль на мономер.

10. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-9, имеющий молярное отношение магния менее чем приблизительно 0,15.

11. Рекомбинантный полипептид по п. 10, имеющий молярное отношение магния от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,10.

12. Рекомбинантный полипептид по п. 10, имеющий молярное отношение магния приблизительно 0,12.

13. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-12, содержащий по меньшей мере приблизительно 95,0% димеров рекомбинантного полипептида и приблизительно 5,0% или менее полипептидных агрегатов, как определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ.

14. Рекомбинантный полипептид по п. 13, содержащий по меньшей мере приблизительно 96,8% димеров рекомбинантного полипептида и приблизительно 3,2% или менее полипептидных агрегатов, в частности, как определено методом эксклюзионной ВЭЖХ.

15. Рекомбинантный полипептид по п. 14, содержащий по меньшей мере приблизительно 97,6% димеров рекомбинантного полипептида и приблизительно 2,4% или менее агрегатов, в частности, как определено методом эксклюзионной ВЭЖХ.

16. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-15, имеющий по меньшей мере приблизительно 95,0% чистоту, в частности, как определено с помощью RP-HPLC.

17. Рекомбинантный полипептид по п. 16, имеющий по меньшей мере приблизительно 97,6% чистоту, как определено с помощью RP-HPLC.

18. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-17, имеющий процент связывания гидроксиапатита (НА) от приблизительно 75% до приблизительно 125%.

19. Рекомбинантный полипептид по п. 18, имеющий средний % связывания гидроксиапатита от приблизительно 85% до приблизительно 97%.

20. Рекомбинантный полипептид по п. 19, имеющий средний % связывания гидроксиапатита от приблизительно 90% до приблизительно 91%.

21. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-20, имеющий специфическую активность (pNPP) от приблизительно 620 до приблизительно 1250 единиц/мг.

22. Рекомбинантный полипептид по п. 21, имеющий среднюю специфическую активность (pNPP) от приблизительно 904,0 до приблизительно 907,7 Ед/мг.

23. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид кодируется полинуклеотидом, кодирующим полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, или последовательность, полностью комплементарную SEQ ID NO: 1.

24. Рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что подпитываемый периодический реактор имеет объем от 200 л до 20000 л.

25. Рекомбинантный полипептид по п. 24, отличающийся тем, что подпитываемый периодический реактор имеет объем от 2000 л до 20000 л.

26. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный полипептид по любому из пп. 1-25, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.