RU2022107351A - Штамм, продуцирующий фолат, его получение и применение - Google Patents

Claims (34)

1. Генетически модифицированный штамм для синтеза фолата, его соли, его прекурсора или его промежуточного продукта, в котором уровень экспрессии эндогенного гена folC в модифицированном штамме снижен и введен экзогенный ген folC, и модифицированный штамм имеет значительно более высокую способностью к выработке фолата, его прекурсора или его промежуточного продукта по сравнению со своим исходным штаммом.

2. Генетически модифицированный штамм по п. 1, где структурная формула фолата, его соли, его прекурсора или его промежуточного продукта представлена в виде формулы I:

в которой, если связь а является одинарной, то связь а' отсутствует, а если связь а' является одинарной, то связь а отсутствует;

если связь b является одинарной, то связь b' отсутствует, а если связь b' является одинарной, то связь b отсутствует;

R₁ выбирается из группы, состоящей из:: -Н, -СН₃ (5-метил), -СНО (5-формил), -СН= или =СН- (5,10-метенил), -СН₂- (5,10-метилен), CH=NH (5-формимино-) или их комбинации;

R₂ выбирается из группы, состоящей из: Н, СНО (10-формил), -СН=, =СН- (5,10-метенил), -CH₂- (5,10-метилен) или их комбинации.

3. Генетически модифицированный штамм по п. 1, в котором исходный штамм для получения модифицированного штамма выбирается из группы, состоящей из Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii и их комбинации.

4. Генетически модифицированный штамм по п. 1, в котором экзогенный ген folC получен из Ashbya gossypii или Lactobacillus reuteri.

5. Генетически модифицированный штамм по п. 1, в котором продукт экспрессии экзогенного гена folC содержит полипептид или производное полипептида, выбранное из группы, состоящей из: дигидрофолатсинтетазы (ДГФС - ЕС 6.3.2.12).

6. Генетически модифицированный штамм п. 5, в котором аминокислотная последовательность дигидрофолатсинтетазы соответствует SEQ ID NO.: 22 или 23.

7. Генетически модифицированный штамм по п. 1, в котором в модифицируемый штамм вводят ген, кодирующий фермент биосинтеза фолата, или активируют в нем указанный ген.

8. Генетически модифицированный штамм по п. 7, в котором ген биосинтеза фолата выбран из группы, состоящей из folE/mtrA, folB, folK, folP/sul, folA/dfrA и их комбинации.

9. Генетически модифицированный штамм по п. 7, в котором ген биосинтеза фолата получен из бактерии, предпочтительно из бактерии рода Bacillus, наиболее предпочтительно из Bacillus subtilis или Lactococcus lactis, или Ashbya gossypii.

10. Способ получения фолата, его соли, его прекурсора или его промежуточного продукта, включающий следующие этапы:

i) предоставление модифицированного штамма по п.;

(ii) культивирование модифицированного штамма, описанного на этапе (i), с получением в результате продукта ферментации, содержащего одно или несколько соединений фолата, его соли, его прекурсора или его промежуточного продукта;

(iii) необязательно, продукт ферментации, полученный на этапе (ii), подвергают сепарации и очистке с целью дальнейшего получения одного или более соединений фолата, его соли, его прекурсора или его промежуточных продукта;

(iv) необязательно, продукт полученный на этапах (ii) или (iii), помещают в кислую или щелочную среду с целью дальнейшего получения другого соединения фолата, его соли, его прекурсора или его промежуточных продуктов;

при этом структурная формула фолата, его соли, его прекурсора или его промежуточного продукта преставлена формулой I:

(I); и R₁, R₂, а, а', b, b' определяются, как указанно выше.

11. Способ по п. 10, в котором фолат, его соль, его прекурсор или его промежуточный продукт представляет собой фолиевую кислоту.

12. Способ получения фолата, его прекурсора или его промежуточного продукта, включающий следующие этапы:

i) предоставление модифицированного штамма по п. 1;

(ii) культивирование модифицированного штамма, описанного на этапе (i), с получением в результате продукта ферментации, содержащего фолат;

(iii) необязательно продукт ферментации, полученный на этапе (ii), подвергают сепарации и очистке с целью дальнейшего получения фолиевой кислоты, ее прекурсора или ее промежуточного продукта.

13. Способ по п. 12, в котором способ дополнительно включает стадию добавления парааминобензойной кислоты (ПАБК) в ходе процесса культивирования на стадии (ii).

14. Способ получения модифицированного штамма по п. 1, включающий следующие этапы:

(а) снижение уровня экспрессии эндогенного гена folC в исходном штамме и введение экзогенного гена folC с получением модифицированного штамма по п. 1.

15. Способ по п. 14, в котором способ дополнительно включает в себя стадию (b) введения или активации гена, регулирующего синтез фолата, в исходном штамме.

16. Применение модифицированного штамма по п. 1, который используется в качестве модифицированного штамма для ферментативного получения фолата, его соли, его прекурсора или его промежуточного продукта.

17. Генетически модифицированный микроорганизм, который был модифицирован для: i) получения пониженного уровня экспрессии эндогенного гена, кодирующего полипептид, обладающий как активностью дигидрофолатсинтетазы, так и активностью фолилполиглутаматсинтетазы по сравнению с идентичным во всем остальном микроорганизмом (эталонным микроорганизмом), и ii) экспрессирования гетерологичного полипептида, обладающего только активностью дигидрофолатсинтетазы.

18. Способ получения фолата или его соли, его прекурсора или его промежуточного продукта, включающий: i) культивирование генетически модифицированного микроорганизма согласно пятому аспекту настоящего изобретения в культуральной среде в подходящих условиях культивирования для получения продукта ферментации, содержащего указанную фолиевую кислоту, ее прекурсор или ее промежуточный продукт; и ii) необязательно разделение и/или очистку указанной фолиевой кислоты, ее прекурсора или ее промежуточного продукта.