RU2019106462A - ФАКТОР ТРАНСКРИПЦИИ NtERF241 И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ - Google Patents

Claims (62)

1. Выделенная молекула кДНК для повышения содержания никотинового алкалоида в растении Nicotiana, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;

(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и

(c) нуклеотидной последовательности, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичной нуклеотидным последовательностям (а) или (b), и которая кодирует фактор транскрипции, положительно регулирующий биосинтез никотиновых алкалоидов,

где нуклеотидная последовательность функционально связана с гетерологичной нуклеиновой кислотой.

2. Вектор экспрессии для повышения содержания никотинового алкалоида в растении Nicotiana, содержащий молекулу кДНК по п. 1, функционально связанную с одной или более контролирующими последовательностями, подходящими для направления экспрессии в клетке-хозяине Nicotiana.

3. Генетически модифицированное растение Nicotiana, продуцирующее никотиновые алкалоиды, содержащее клетку, содержащую конструкцию химерной нуклеиновой кислоты, содержащую выделенную молекулу кДНК по п. 1.

4. Модифицированное растение Nicotiana по п. 3, представляющее собой растение Nicotiana tabacum.

5. Семена модифицированного растения Nicotiana по п. 3, содержащие конструкцию химерной нуклеиновой кислоты.

6. Табачный продукт, содержащий модифицированное растение Nicotiana по п. 3.

7. Способ повышения содержания никотинового алкалоида в растении Nicotiana, включающий:

(а) введение в растение Nicotiana вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;

(ii) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и

(iii) нуклеотидной последовательности, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичной нуклеотидным последовательностям (i) или (ii), и которая кодирует фактор транскрипции, положительно регулирующий биосинтез никотиновых алкалоидов; и

(b) выращивание растения в условиях, дающих возможность экспрессии фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез никотиновых алкалоидов из нуклеотидной последовательности;

где экспрессия фактора транскрипции приводит к повышенному содержанию никотиновых алкалоидов в растении по сравнению с контрольным растением, выращенным в аналогичных условиях.

8. Способ по п. 7, дополнительно включающий сверхэкспрессию в растении Nicotiana по меньшей мере одного из NBB1, А622, хинолат-фосфорибозилтрансферазы (QPT), путресцин-N-метилтрансферазы (РМТ) или N-метилпутресциноксидазы (МРО).

9. Способ по п. 7, дополнительно включающий сверхэкспрессию в растении Nicotiana по меньшей мере одного дополнительного фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез никотиновых алкалоидов.

10. Способ по п. 9, где дополнительный фактор транскрипции, положительно регулирующий биосинтез никотиновых алкалоидов, представляет собой по меньшей мере один из NtMYC1a, NtMYC1b, NtMYC2a или NtMYC2b.

11. Генетически модифицированное растение Nicotiana, полученное способом по п. 7, обладающее повышенной экспрессией фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез никотиновых алкалоидов, и повышенным содержанием алкалоидов по сравнению с контрольным растением.

12. Продукт, содержащий модифицированное растение по п. 11 или его части, имеющий повышенное содержание никотиновых алкалоидов по сравнению с продуктом, полученным из контрольного растения.

13. Семена от генетически модифицированного растения по п. 11.

14. Способ снижения содержания никотинового алкалоида в растении Nicotiana, включающий подавляющую регуляцию фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез алкалоидов, где экспрессию фактора транскрипции снижают путем:

(a) введения в клетку растения Nicotiana нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере приблизительно 15 последовательных нуклеотидов молекулы кДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;

(ii) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и

(iii) нуклеотидной последовательности, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичной нуклеотидным последовательностям (i) или (ii), и которая кодирует фактор транскрипции, положительно регулирующий биосинтез алкалоидов;

где последовательные нуклеотиды имеют смысловую ориентацию, антисмысловую ориентацию или обе;

(b) получение растения, содержащего растительную клетку; и

(c) выращивание растения в условиях, в которых нуклеотидная последовательность снижает уровни фактора транскрипции в растении по сравнению с контрольным растением, выращенным в аналогичных условиях.

15. Способ по п. 14, дополнительно включающий подавление в растении по меньшей мере одного из NBB1, А622, хинолат-фосфорибозилтрансферазы (QPT), путресцин-N-метилтрансферазы (РМТ) или N-метилпутресциноксидазы (МРО).

16. Способ уменьшения содержания никотинового алкалоида в растении Nicotiana, включающий подавляющую регуляцию фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез алкалоидов, где экспрессию фактора транскрипции снижают путем:

(а) введения в популяцию растительных клеток реагента для сайт-направленного мутагенеза мишени, содержащей по меньшей мере приблизительно 15 последовательных нуклеотидов молекулы кДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;

(ii) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и

(iii) нуклеотидной последовательности, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичной нуклеотидным последовательностям (i) или (ii), и которая кодирует фактор транскрипции, положительно регулирующий биосинтез алкалоидов; и

(b) выявления и отбора клетки с мутированной мишенью или растения, полученного из такой клетки, где растительная клетка или растение с мутированной мишенью имеют мутацию в гене, кодирующем фактор транскрипции, положительно регулирующий биосинтез алкалоидов, и уменьшенное содержание алкалоидов по сравнению с контрольным растением.

17. Способ по п. 16, где реагент представляет собой рекомбинагенное олигонуклеооснование или нуклеазу-мишень.

18. Мутированное растение, полученное способом по п. 16, имеющее уменьшенную экспрессию фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез никотиновых алкалоидов, и уменьшенное содержание алкалоидов по сравнению с контрольным растением.

19. Продукт, содержащий мутированное растение по п. 18 или его части, имеющий уменьшенный уровень никотинового алкалоида по сравнению с продуктом, полученным из контрольного растения.

20. Семена мутированного растения по п. 18.

21. Способ уменьшения уровней никотиновых алкалоидов в популяции растений Nicotiana, включающий:

(a) обеспечение популяции мутированных растений Nicotiana;

(b) выявление и отбор растения с мутированной мишенью в популяции, где (i) растение с мутированной мишенью имеет сниженную экспрессию фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез алкалоидов, по сравнению с контрольным растением, (ii) выявление включает использование молекулы кДНК в качестве праймера или зонда, и (iii) молекула кДНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;

(2) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и

(3) нуклеотидной последовательности, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичной нуклеотидным последовательностям (1) или (2), и которая кодирует фактор транскрипции, положительно регулирующий биосинтез алкалоидов; и

(с) селективное размножение растения с мутированной мишенью с получением популяции растений, имеющих сниженную экспрессию фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез алкалоидов, по сравнению с популяцией контрольных растений.

22. Мутированное растение Nicotiana, продуцирующее алкалоиды, полученное способом по п. 21, имеющее уменьшенную экспрессию фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез алкалоидов, и уменьшенное содержание алкалоидов по сравнению с контрольным растением.

23. Мутированное растение по п. 22, представляющее собой растение Nicotiana tabacum.

24. Табачный продукт, содержащий мутированное растение по п. 23 или его части, имеющий уменьшенный уровень никотинового алкалоида по сравнению с продуктом, полученным из контрольного растения.

25. Семена мутированного растения по п. 23.

26. Генетически модифицированное растение табака, сверхэкспрессирующее генный продукт, кодируемый SEQ ID NO: 2, где генетически модифицированное растение демонстрирует повышенную экспрессию генного продукта по сравнению с контролем, и генетически модифицированное растение содержит клетки, содержащие конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую, в направлении от 5' к 3':

(а) промотор, функционирующий в растительной клетке, и

(b) гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором, где гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

27. Потомство генетически модифицированного растения по п. 26, сверхэкспрессирующее генный продукт, кодируемый SEQ ID NO: 2.

28. Способ получения генетически модифицированной клетки табака с повышенным содержанием никотина, сверхэкспрессирующей генный продукт, кодируемый SEQ ID NO: 2, включающий введение в клетку молекулы кДНК по п. 1 для достижения сверхэкспрессии генного продукта, кодируемого SEQ ID NO: 2, путем генетической модификации.

29. Способ по п. 28, дополнительно включающий сверхэкспрессию в клетке табака по меньшей мере одного дополнительного фактора транскрипции, положительно регулирующего биосинтез никотиновых алкалоидов, путем генетической модификации.

30. Способ по п. 29, где дополнительный фактор транскрипции, положительно регулирующий биосинтез никотиновых алкалоидов, представляет собой по меньшей мере один из NtMYC1a, NtMYC1b, NtMYC2a или NtMYC2b.

31. Способ по п. 28, дополнительно включающий сверхэкспрессию в клетке табака одного или более ферментов биосинтеза никотиновых алкалоидов, выбранных из группы, состоящей из NBB1, А622, хинолат-фосфорибозилтрансферазы (QPT), путресцин-N-метилтрансферазы (РМТ) или N-метилпутресциноксидазы (МРО), путем генетической модификации.

32. Клетка растения табака, полученная способом по п. 28.