RU2009143124A

RU2009143124A - БИНАРНЫЙ ВЕКТОР pBI-4CL, БИНАРНЫЙ ВЕКТОР pBI-Xeg, БИНАРНЫЙ ВЕКТОР pGS, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ПОНИЖЕННОЕ КОЛИЧЕСТВО ЛИГНИНА, ПОВЫШЕННОЕ КОЛИЧЕСТВО ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ПОВЫШЕННУЮ СКОРОСТЬ РОСТА

Info

Publication number: RU2009143124A
Application number: RU2009143124/10A
Authority: RU
Inventors: Константин Александрович Шестибратов (RU); Константин Александрович Шестибратов; Вадим Георгиевич Лебедев (RU); Вадим Георгиевич Лебедев; Татьяна Евгеньевна Шадрина (RU); Татьяна Евгеньевна Шадрина; Ирина Владимировна Булатова (RU); Ирина Владимировна Булатова; Олег Николаевич Окунев (RU); Олег Николаевич Окунев; Алексей Аркадьевич Леонтьевский (RU); Алексей Аркадьевич Леонтьевский; Александр Викторович Лисов (RU); Александр Викторович Лисов
Original assignee: Российская Федерация в лице Федерального агентства по науке и инновациям (RU); Российская Федерация в лице Федерального агентства по науке и инновациям
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2009-11-24
Publication date: 2011-05-27

Abstract

1. Бинарный вектор pBI-4CL размером 13864 и.о., Т-ДНК которого длиной 5118 п.о. содержит: а) экспрессионную кассету, способную ингибировать экспрессию гена 4-кумарат-КоА-лигазы Populus tomentosa, причем указанная кассета включает следующие конструктивные элементы: 5'-регуляторную область, содержащую промотор CaMV35S длиной 834 п.о., инвертированный фрагмент гена 4CL длиной 210 п.о., фрагмент гена GUS длиной 401 п.о., выполняющий функцию спейсера, прямой фрагмент гена 4CL длиной 210 п.о. и 3'-регуляторную область pAnos длиной 252 п.о., представляющую терминатор транскрипции нопалинсинтазы, причем 5'- и 3'-регуляторные области оперативно связаны со шпилечной конструкцией общей длиной 821 п.о. из инвертированных фрагментов гена 4CL Populus tomentosa и фрагмента гена GUS; б) экспрессионную кассету, придающую трансгенным тканям устойчивость к канамицину, содержащую следующие конструктивные элементы: 5'-регуляторную область, содержащую промотор NOS гена нопалинсинтазы длиной 306 п.о., ген неомицинфосфотрансферазы длиной 794 п.о. и 3'-регуляторную область pAnos длиной 252 п.о., представляющую терминатор транскрипции нопалинсинтазы, причем 5'- и 3'-регуляторные области оперативно связаны с геном неомицинфосфотрансферазы. ! 2. Вектор по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность фрагмента гена 4-кумарат-КоА-лигазы Populus tomentosa содержит фрагмент as4CL (SEQ ID NO: 1, фланкированый сайтами BamHI с 5'- и 3'-концов, и фрагмент sa4CL (SEQ ID NO: 2, фланкированный сайтами SnaBI с 5'-конца и SacI с 3'-конца. ! 3. Бинарный вектор pBI-Xeg размером 13687 п.о., Т-ДНК которого размером 5121 п.о. содержит следующие элементы: а) экспрессионную кассету, содержащую химерный ген ксилоглюканазы Penicillium canescens размером 824 п.о. с сигнальным пе

Claims

1. Бинарный вектор pBI-4CL размером 13864 и.о., Т-ДНК которого длиной 5118 п.о. содержит: а) экспрессионную кассету, способную ингибировать экспрессию гена 4-кумарат-КоА-лигазы Populus tomentosa, причем указанная кассета включает следующие конструктивные элементы: 5'-регуляторную область, содержащую промотор CaMV35S длиной 834 п.о., инвертированный фрагмент гена 4CL длиной 210 п.о., фрагмент гена GUS длиной 401 п.о., выполняющий функцию спейсера, прямой фрагмент гена 4CL длиной 210 п.о. и 3'-регуляторную область pAnos длиной 252 п.о., представляющую терминатор транскрипции нопалинсинтазы, причем 5'- и 3'-регуляторные области оперативно связаны со шпилечной конструкцией общей длиной 821 п.о. из инвертированных фрагментов гена 4CL Populus tomentosa и фрагмента гена GUS; б) экспрессионную кассету, придающую трансгенным тканям устойчивость к канамицину, содержащую следующие конструктивные элементы: 5'-регуляторную область, содержащую промотор NOS гена нопалинсинтазы длиной 306 п.о., ген неомицинфосфотрансферазы длиной 794 п.о. и 3'-регуляторную область pAnos длиной 252 п.о., представляющую терминатор транскрипции нопалинсинтазы, причем 5'- и 3'-регуляторные области оперативно связаны с геном неомицинфосфотрансферазы.

2. Вектор по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность фрагмента гена 4-кумарат-КоА-лигазы Populus tomentosa содержит фрагмент as4CL (SEQ ID NO: 1, фланкированый сайтами BamHI с 5'- и 3'-концов, и фрагмент sa4CL (SEQ ID NO: 2, фланкированный сайтами SnaBI с 5'-конца и SacI с 3'-конца.

3. Бинарный вектор pBI-Xeg размером 13687 п.о., Т-ДНК которого размером 5121 п.о. содержит следующие элементы: а) экспрессионную кассету, содержащую химерный ген ксилоглюканазы Penicillium canescens размером 824 п.о. с сигнальным пептидом целлюлазы тополя белого, причем указанная кассета включает следующие конструктивные элементы: 5'-регуляторную область, содержащую промотор CaMV35S длиной 834 п.о., 3'-регуляторную область pAnos длиной 252 п.о., представляющую терминатор транскрипции нопалинсинтазы, причем 5'- и 3'-регуляторные области оперативно связаны с химерным геном ксилоглюканазы; б) экспрессионную кассету, придающую трансгенным тканям устойчивость к канамицину, содержащую следующие конструктивные элементы; 5'-регуляторную область, содержащую промотор NOS гена нопалинсинтазы длиной 306 п.о., ген неомицинфосфотрансферазы длиной 794 п.о. и 3'-регуляторную область pAnos длиной 252 п.о., представляющую терминатор транскрипции нопалинсинтазы, причем 5'- и 3'-регуляторные области оперативно связаны с геном неомицинфосфотрансферазы.

4. Вектор по п.3, отличающийся тем, что фрагмент гена SP-Xeg ксилоглюканазы Penicillium canescens содержит последовательность SEQ ID NO: 9.

5. Бинарный вектор pGS размером 14039 п.о., Т-ДНК которого содержит: а) конструкт экспрессии, способный направлять конститутивную экспрессию гена глутаминсинтетазы GS, причем указанный конструкт включает 5'-регуляторную область размером 834 п.о., содержащую промотор CaMV35S, последовательность гена GS длиной 1423 п.о. и 3'-регуляторную область pAnos длиной 306 п.о., представляющую терминатор транскрипции нопалинсинтазы, причем 5'- и 3'-регуляторные области оперативно связаны с кодирующей последовательностью гена GS; б) экспрессионную кассету, придающую трансгенным тканям устойчивость к канамипину, содержащую следующие конструктивные элементы: 5'-регуляторную область, содержащую промотор NOS гена нопалинсинтазы длиной 306 п.о., ген неомицинфосфотрансферазы длиной 794 п.о. и 3'-регуляторную область pAnos длиной 252 п.о., представляющую терминатор транскрипции нопалинсинтазы, причем 5'- и 3'-регуляторные области оперативно связаны с геном неомицинфосфотрансферазы.

6. Вектор по п.5, отличающийся тем, что фрагмент гена GS глутаминсинтетазы Penicillium canescens содержит последовательность SEQ ID NO: 16.

7. Способ получения трансгенных растений, содержащих пониженное количество лигнина и повышенное количество целлюлозы, включающий формирование конструктов экспрессии в форме бинарных векторов, выращивание штаммов агробактерий, подготовку эксплантов, инокуляцию эксплантов в суспензии агробактерий с последующей кокультивацией эксплантов и микроорганизмов, регенерацию адвентивных побегов на селективной среде отличающийся тем, что растение одновременно трансформируют смесью конструктов экспрессии, включающих бинарные векторы, входящие в группу, состоящую из: бинарного вектора pBI-4CL, бинарного вектора pBI-Xeg, бинарного вектора pGS, и затем выращивают трансформированное растение в условиях, приводящих к экспрессии выбранных ДНК-последовательностей, при этом на стадии трансформации используют смесь трех конструктов экспрессии в пропорции 1:1:1, на стадии регенерации в среду добавляют канамицин в концентрации 25-100 мг/л, осуществляют молекулярно-биологический анализ с помощью ПЦР и отбирают линии, содержащие совместно интегрированные генетические конструкции ксилоглюканазы, глутаминсинтетазы, 4-кумарат-КоА-лигазы, проводят анализ химического состава растений и наличие нежелательных отклонений, при этом выделяют линии с пониженным содержанием лигнинов, повышенной долей целлюлозы, без сомаклональных отклонений.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансгенные растения выбирают из растений осины и березы.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что березу выбирают из группы, состоящей из видов, входящих в группу Betula pendula, Betula platyphylla, Betula papyrifera.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что осину выбирают из группы, состоящей из Populus tremula, Populus tomentosa, Populus tremuloides.

11. Способ по п.7, отличающийся тем, что маточные растения осины культивируют на среде WPM с добавлением 0,5 мг/л гибберреловой кислоты, а растения березы культивируют на безгормональной среде WPM.

12. Способ по п.7, отличающийся тем, что для инокуляции в качестве эксплантов используют междоузлия осины и листовые диски березы, при этом сразу перед инокуляцией наносятся повреждения.

13. Способ по п.7, отличающийся тем, что кокультивацию эксплантов с агробактериями проводят в течение 3-5 дней в темноте.

14. Способ по п.7, отличающийся тем, что экспланты осины сразу после кокультивации переносят на свет, а экспланты березы переносят на свет после 7-10 дней после инокуляции.

15. Способ по п.7, отличающийся тем, что регенерацию адвентивных побегов из инокулированных эксплантов проводят на селективной среде, при этом дополнительно используют регуляторы роста: А) зеатин 2 мг/л и ИМК 0,3 мг/л для осины, б) зеатин 5 мг/л, БАП 5 мг/л, ИМК 0,5 мг/л для березы повислой.

16. Способ по п.7, отличающийся тем, что на стадии мультипликации используют среды, выбираемые из: а) WPM с 0,5 мг/л БАП для осины, б) WPM с 0,6 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИМК для березы.

17. Способ по п.7, отличающийся тем, что после 3-5 пассажей мультипликации из каждой каллусной группы выделяют по три микропобега и проводят их мультипликацию еще в течение 2-3 пассажей.