RU2006117379A - Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа - Google Patents
Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2006117379A RU2006117379A RU2006117379/13A RU2006117379A RU2006117379A RU 2006117379 A RU2006117379 A RU 2006117379A RU 2006117379/13 A RU2006117379/13 A RU 2006117379/13A RU 2006117379 A RU2006117379 A RU 2006117379A RU 2006117379 A RU2006117379 A RU 2006117379A
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- clusters
- chips
- multichip
- probes
- code
- Prior art date
Links
Claims (52)
1. Способ изготовления многофункционального мультичипа для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, в соответствии с которым выбирают материал несущего элемента мультичипа и способ модификации его поверхности, выбирают форму и способ подготовки заготовки несущего элемента, изготавливают несущий элемент мультичипа и проводят модификацию его поверхности, выбирают тип зонда для анализа, по крайней мере одного типа биологического материала, выбирают структуру и размещение кластеров для выбранных типов зондов на поверхности рабочей зоны чипа, наносят зонды на поверхность рабочей зоны чипов, отличающийся тем, что при выборе формы и состава мультичипа определяют количество и расположение секторов для формирования N индивидуальных чипов на несущем элементе мультичипа, определяют количество и расположение зон для формирования выемок, или выемок и промежутков между чипами, или зон для формирования выемок, или выемок и промежутков между чипами и общей зоны мультичипа, выбирают типы зон для формирования выемок или выемок и промежутков между чипами из группы, состоящей из а) по крайней мере одной зоны, контактируемой с границами по крайней мере двух индивидуальных чипов, входящих в мультичип, б) по крайней мере одной зоны, контактируемой с границами по крайней мере двух индивидуальных чипов и границей общей зоны мультичипа или комбинации а и б, на этапе изготовления несущего элемента в зоне, контактируемой с границами чипов, или в зоне, контактируемой с границами чипов и общей зоной мультичипа, формируют выемки или выемки и промежутки между чипами, наносят на поверхность индивидуальных кластеров не менее одной точки выбранного типа зонда, на заключительном этапе изготовления и на этапе подготовки мультичипа к диагностике в зависимости от выбора параллельного или последовательного скрининга биополимеров на поверхность индивидуальных чипов или на поверхность индивидуальных чипов и поверхность общей зоны наносят идентификаторы, причем на поверхность индивидуальных чипов наносят первый или первый и второй идентификаторы, на поверхность общей зоны наносят третий идентификатор, который необязательно идентичен второму идентификатору.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве материала несущего элемента используют полимеры, стекло, керамику или их композиции.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полимеры выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полиметилметакрилат.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полимера используют поливинилхлорид.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что форма несущего элемента представляет собой прямоугольник, квадрат, многоугольник или круг.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что толщина несущего элемента составляет от 0,5 до 5 мм.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что значение N выбирают не менее 2.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификатор может быть выполнен в виде цифровых и/или буквенных обозначений или в виде штрих-кодов или их комбинаций.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные коды образуют уникальные 2 в степени N пар кодов, характеризующих многофункциональный чип.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение длин выемок и промежутков между чипами при их комбинации лежит в пределах от 1:10 до 10:1.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение ширины выемки к ширине промежутка составляет от 1:10 до 10:1.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что ширина выемки лежит в пределах от 0,1 до 5 мм.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что приемы изготовления выбранной формы несущего элемента мультичипа, форм выемок и промежутки между чипами выбирают из группы штамповки, термоформовки, отливки, механической обработки, лазерной обработки и их комбинации.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии модификации поверхности несущего элемента используется раствор соединения формулы Y-X-Si(OR)3, где Х - алкильный, арильный или алкиларильный мостик, R - алкил или арил, Y - требуемая функциональная группа, в подходящем растворителе.
16. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии модификации в качестве растворителя используется вода, ацетон, смесь воды со спиртом, выбираемым из группы, состоящей из метанола, этанола, пропанола.
17. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация модифицирующего агента составляет от 0,1 до 20 об.%.
18. Способ по п.1, отличающийся тем, что температура на стадии модификации лежит в диапазоне от 15 до 80°С.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что длительность стадии модификации лежит в диапазоне от 10 мин до 12 ч.
20. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве зонда используют олигонуклеотид, модифицированный по 5' или 3'-концу функциональной группой, входящей в набор, состоящий из фосфато-, карбокси-, амино-, гидрокси-, тио-, гидразо-, гидразино-, аминоокси- и др.
21. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация олигонуклеотида в объеме капель каждого зонда составляет от 0,5 до 100 мкмоль/л.
22. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммобилизацию олигонуклеотида проводят в присутствии по крайней мере одного конденсирующего агента, входящего в группу, состоящую из гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида, карбонилдиимидазола, мезитиленсульфонилтетразола, мезитиленсульфонилнитротриазола, триизопропилфенилтетразола, триизопропилфенилнитротриазола.
23. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммобилизацию олигонуклеотида проводят в присутствии по крайней мере одного бифункционального кросс-линкера, входящего в группу, состоящую из дитиобис(сукцинимидилпропионата), дисукцинимидилсуберата, дисукцинимидилтартрата, бис[(2-(сукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфоната, этиленгликольбис(сукцинимидилсукцината), дисукцинимидилглутарата, дисукцинимидилкарбоната, гидрохлорида диметиладипимидата, гидрохлорида диметилпимелимидата, диметил-3,3'-дитиобис(пропионимидата), 1,4-бис[3'-(2'-пиридилдитио)-пропионамидо]бутана, бисмалеимидогексана, гидрохлорида гидразида 4-(4-N-малеимидо-фенил)-бутановой кислоты, 1,5-дифтор-2,4 динитробензола, диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, карбогидразида, дигидразида адипиновой кислоты, N-сукцинимидил-3- (2-пиридилдитио)-пропионата, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)- циклогексан-1-карбоксилата, N-м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида,дигидрохлорида диметилсуберимидата, сукцинимидил-(4-иодоацетил)-аминобензоата, сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)-бутирата, сукцинимидил-6-[(иодоацетил)амино]-гексаноата, сукцинимидил-4-[(иодоацетиламино)-метил]-циклогексан-1-карбоксилата, п-нитрофенилиодоацетата.
24. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии модификации поверхности несущего элемента модификацию проводят на всей поверхности несущего элемента или в рабочих зонах индивидуальных чипов.
25. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные и отрицательные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 100:1.
26. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество капель с зондами в каждом кластере не менее 2.
27. Способ по п.1, отличающийся тем, что объем капель каждого зонда составляет не менее 0,005 мкл.
28. Способ по п.1, отличающийся тем, что нанесение зондов осуществляют с помощью роботов.
29. Способ по п.1, отличающийся тем, что индивидуальные чипы получают посредством отделения чипа от несущего элемента мультичипа, причем отделение осуществляют отламыванием, отрезанием, отрубанием или их комбинацией.
30. Многофункциональный мультичип для последовательного или параллельного скрининга диагностических объектов для осуществления способа по любому из пп.1-29, отличающийся тем, что он выполнен на основе общего несущего элемента, на котором размещены N чипов, на поверхности которого выполнены выемки или выемки и промежутки между чипами, причем на каждом из N чипов размещен первый или первый и второй идентификаторы, а на поверхности общей зоны необязательно размещен третий идентификатор, необязательно идентичный второму идентификатору, причем первый идентификатор связан с первым кодом, второй идентификатор связан со вторым кодом, отличным от первого кода, указанные коды образуют уникальные N пар кодов, характеризующих результаты диагностики, проведенной на индивидуальном чипе или многофункциональном мультичипе, на поверхности индивидуальных кластеров размещены не менее 1 точки выбранных типов зондов относящихся к исследуемым биополимерам.
31. Микрочип по п.30, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет от 2 до 500.
32. Микрочип по п.30, отличающийся тем, что количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, составляет 15.
33. Микрочип по п.30, отличающийся тем, что в состав кластеров, размещенных на рабочей зоне чипа, выбирают из группы: кластеры зондов, кластеры положительных контролей, кластеры отрицательных контролей.
34. Микрочип по п.33, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1.
35. Микрочип по п.33, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают отрицательные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1.
36. Микрочип по п.34 или 35, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные и отрицательные контроли, составляет соответственно 6:1 или 12:1.
37. Микрочип по п.30, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхность каждого кластера составляет от 1 до 50.
38. Микрочип по п.37, отличающийся тем, что количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида в каждом кластере составляет 4 или 9.
39. Способ анализа нуклеиновых кислот и белков с использованием мультичипа, включающий этапы
а) отбора проб;
б) экстракции ДНК;
в) синтеза праймеров для проведения симметричной или асимметричной ПЦР;
г) проведения мультиплексной ПЦР с участием по крайней мере одной экстрагируемой ДНК;
д) очищения и приготовления растворов амплифицированных продуктов;
е) гибридизации амплифицированных продуктов с предварительно иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, размещенными в кластерах в пределах рабочей зоны, по крайней мере, одного индивидуального чипа;
ж) детекции результатов диагностики;
з) идентификации и интерпретации результатов,
отличающийся тем, что в указанном способе используют мультичип по п.30, состоящий из N пользовательских чипов, выполненных на общем несущем элементе, причем перед проведением этапов по пунктам е-з выбирают параллельный или последовательный способ проведения диагностических процедур и, в зависимости от способа, заносят данные диагностики и параметры первого, второго и необязательно третьего идентификаторов в базу данных, причем проводят анализ результатов в зависимости от стратегии проведения диагностики.
40. Способ по п.39, отличающийся тем, что проводят диагностику биологических объектов, полученных в молекулярной биологии, фармакологии, медицине, охране окружающей среды, криминалистике, пищевой промышленности, сельском хозяйстве.
41. Способ по п.40, отличающийся тем, что второй идентификатор содержит данные, выбираемые из группы, состоящей из а) кода номера партии и/или даты изготовления, б) кода фирмы-изготовителя, в) кода, идентифицирующего способ модификации поверхности, г) кода типа скрининга (последовательный, параллельный), д) кода количества индивидуальных чипов, е) кода количества кластеров.
42. Способ по п.40, отличающийся тем, что проводят диагностику в медицине.
43. Способ по п.39, отличающийся тем, что первый идентификатор содержит данные, выбираемые из группы, состоящей из а) кода болезни, б) кода, характеризующего объект, из которого взята проба (кровь, лимфа, соскоб, слюна и т.д.), в) кода пациента или кода данных, идентифицирующего пациента (ФИО, возраст), г) кода медицинского учреждения и/или страховой компании, д) даты диагностики.
44. Способ по п.39, отличающийся тем, что экстракцию ДНК проводят из источников, входящих в группу, состоящую из клинических проб млекопитающих, культур микроорганизмов или вирусов, растительных и пищевых проб, проб, взятых в зданиях и окружающей среде.
45. Способ по п.39, отличающийся тем, что в процессе выбора стратегии диагностики этапы проведения диагностики выбирают из параллельного скрининга нескольких образцов, взятых из разных источников, или из последовательного скрининга результатов диагностики одного объекта исследования.
46. Способ по п.39, отличающийся тем, что при последовательном скрининге проб ДНК, взятых из одного и того же объекта, или при проведении серии экспериментов от мультичипа последовательно отделяют первый, второй и последующие чипы.
47. Способ по п.39, отличающийся тем, что на основе анализа данных принимают решение по корректировке стратегии диагностики.
48. Способ по п.39, отличающийся тем, что после интерпретации результатов анализа клинических проб корректируют процесс лечения или исследуют влияние выбранных лекарств на динамику лечения.
49. Способ по п.39, отличающийся тем, что идентификацию и интерпретацию результатов диагностики осуществляют с применением программных средств и баз данных путем сравнения данных, полученных при сканировании чипа.
50. Набор для идентификации биополимеров на основе ДНК-вых или белковых зондов, включающий
а) биологический мультичип, охарактеризованный в п.30;
б) реагенты для подготовки образца и проведения идентификации;
в) устройство (устройства) для интерпретации результатов идентификации.
51. Набор по п.50, в котором реагенты для подготовки образца и проведения идентификации включают реагенты для выделения ДНК, реагенты для проведения ПЦР, реагенты для проведения гибридизации и реагенты для визуализации кластеров.
52. Набор по п.50, в котором в качестве устройства для интерпретации результатов идентификации используется портативный анализатор чипов, использующий в качестве возбуждающего источника флуоресценции свет диодных лазеров и укомплектованный фотокамерой либо ПЗС-камерой, или анализатор чипов, измеряющий пропускание, или анализатор, комбинирующий разные методы измерения.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006117379/13A RU2321638C2 (ru) | 2006-05-23 | 2006-05-23 | Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006117379/13A RU2321638C2 (ru) | 2006-05-23 | 2006-05-23 | Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006117379A true RU2006117379A (ru) | 2007-12-10 |
| RU2321638C2 RU2321638C2 (ru) | 2008-04-10 |
Family
ID=38903340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006117379/13A RU2321638C2 (ru) | 2006-05-23 | 2006-05-23 | Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2321638C2 (ru) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2334808B1 (en) * | 2008-10-01 | 2017-11-15 | Koninklijke Philips N.V. | Method for testing and quality controlling of nucleic acids on a support |
| JP2012507705A (ja) * | 2008-11-06 | 2012-03-29 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | キュベット及びキュベットを認証する方法 |
| RU2475543C2 (ru) * | 2010-05-25 | 2013-02-20 | Игорь Павлович Смирнов | Способ получения удаляемых водонерастворимых ионообменных покрытий на малди мишенях и их применение для масс-спектрометрического анализа |
| GB201010237D0 (en) * | 2010-06-18 | 2010-07-21 | Lgc Ltd | Methods and apparatuses |
| US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10400280B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| CN108753766A (zh) | 2013-02-08 | 2018-11-06 | 10X基因组学有限公司 | 多核苷酸条形码生成 |
| US10395758B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Sequencing methods |
| RU2547597C1 (ru) * | 2013-09-27 | 2015-04-10 | Юлия Сергеевна Скибина | Многоканальный наконечник для экстракции нуклеиновых кислот, белков и пептидов |
| US9824068B2 (en) | 2013-12-16 | 2017-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods and apparatus for sorting data |
| CN106413896B (zh) | 2014-04-10 | 2019-07-05 | 10X基因组学有限公司 | 用于封装和分割试剂的流体装置、系统和方法及其应用 |
| US10839939B2 (en) | 2014-06-26 | 2020-11-17 | 10X Genomics, Inc. | Processes and systems for nucleic acid sequence assembly |
| EP3889325A1 (en) | 2014-06-26 | 2021-10-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations |
| KR20170106979A (ko) | 2015-01-13 | 2017-09-22 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 구조 변이 및 위상 조정 정보를 시각화하기 위한 시스템 및 방법 |
| JP2018513445A (ja) | 2015-02-09 | 2018-05-24 | １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド | 構造変異の特定及びバリアントコールデータを用いたフェージングのためのシステム及び方法 |
| JP6735348B2 (ja) | 2016-02-11 | 2020-08-05 | １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド | 全ゲノム配列データのデノボアセンブリのためのシステム、方法及び媒体 |
| US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| CN110870018A (zh) | 2017-05-19 | 2020-03-06 | 10X基因组学有限公司 | 用于分析数据集的系统和方法 |
| SG11201913654QA (en) | 2017-11-15 | 2020-01-30 | 10X Genomics Inc | Functionalized gel beads |
| US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
-
2006
- 2006-05-23 RU RU2006117379/13A patent/RU2321638C2/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2321638C2 (ru) | 2008-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2006117379A (ru) | Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа | |
| US20230313279A1 (en) | Methods of determining the location of an analyte in a biological sample using a plurality of wells | |
| US20230111225A1 (en) | Method for resetting an array | |
| US6238866B1 (en) | Detector for nucleic acid typing and methods of using the same | |
| CN107709574A (zh) | 生物组织样品的分子概况的空间作图 | |
| Marx | Multiplying Genes by Leaps and Bounds: A new gene amplification method that greatly facilitates DNA analysis is finding a host of applications in medicine, forensic science, and fundamental molecular biology research | |
| EP0834575A3 (en) | Methods using target nucleic acid hybridization patterns on a matrix of oligonucleotides | |
| BRPI0610092A2 (pt) | mÉtodos para a detecÇço de um analito e de um Ácido nucleico em uma amostra, e para sintetizaÇço de uma molÉcula de Ácido nucleico ou de anÁlago de Ácido nucleico, kit reagente, usos do mesmo, de um composto, e de um mÉtodo, molÉcula de Ácido nucleico ou de anÁlogo de Ácido nucleico, produto de metalizaÇço, produto associado, e, composto | |
| CN101610847A (zh) | 样品分析仪 | |
| RU2348695C2 (ru) | Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа | |
| KR20190020133A (ko) | 염색체에 대한 인-시츄 혼성화를 위한 dna 탐침 | |
| TWI232934B (en) | A biochip containing splitable reaction confinement and method for producing same and application thereof | |
| KR101942947B1 (ko) | dCas9/gRNA 복합체와 형광표지인자를 이용한 표적 유전자 검출 방법 | |
| EP1480155A3 (en) | Information processing apparatus, information processing method, storage medium and program | |
| CN109239363B (zh) | 一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴别秦岭川金丝猴性别方面的应用 | |
| Bustin | The PCR revolution: basic technologies and applications | |
| CN117925786A (zh) | 含有树状分子染料的寡核苷酸探针及其制备方法和应用 | |
| KR101540852B1 (ko) | 굴의 종 특이적 프로브，ｄｎａ 칩，키트 및 이를 이용한 굴의 종 감별 방법 | |
| EP1587624B1 (de) | Probengefäss für analysen | |
| KR20170132159A (ko) | 분석용 칩 | |
| WO2008102924A1 (en) | Microarray for detection of mitochondrial dna mutation and method for diagnosis of diabetes using the same | |
| CN107787453A (zh) | 使用寡核苷酸检测生物标志物的装置和方法 | |
| DE10321042B4 (de) | Biochip-Träger | |
| Rueda-Alaña et al. | BirthSeq, a new method to isolate and analyze dated cells from any tissue in vertebrates | |
| DK2714728T5 (en) | Universal primers and their use in the detection and identification of amphibian / fish species |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20120524 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20140923 |
|
| RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20160504 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200524 |